Hintergrundinformationen
Die DNA-Transfektion durch Elektroporation ist eine etablierte Technik, die auf nahezu alle Zelltypen anwendbar ist. Sie führt zu einer hohen Frequenz stabiler Transformanten und hat eine hohe Effizienz der transienten Genexpression. Die Elektroporation hat sich inzwischen als wirksam erwiesen, wenn es darum geht, Plasmid-DNA in vivo in eine Vielzahl von Gewebetypen einzubringen. Bei der Elektroporation wird die Tatsache ausgenutzt, dass die Zellmembran wie ein elektrischer Kondensator wirkt, der keinen Strom durchlassen kann (außer durch Ionenkanäle). Wenn die Membranen einem elektrischen Hochspannungsfeld ausgesetzt werden, kommt es zu ihrem vorübergehenden Zusammenbruch und zur Bildung von Poren, die groß genug sind, um Makromoleküle (sowie kleinere Moleküle wie ATP) in die Zelle eindringen oder sie verlassen zu lassen. Das Wiederverschließen der Membranporen ist ein natürlicher Zerfallsprozess, der sich bei 0°C verzögert.
Während der Zeit, in der die Poren offen sind, kann Nukleinsäure in die Zelle und schließlich in den Zellkern gelangen. Lineare DNA mit freien Enden ist rekombinogener und wird mit größerer Wahrscheinlichkeit in das Wirtschromosom integriert, so dass stabile Transformanten entstehen. Supercoiled-DNA lässt sich leichter in Chromatin verpacken und ist im Allgemeinen effektiver für die transiente Genexpression.
Die Verwendung von Hochspannungs-Elektroschocks zur Einführung von DNA in Zellen wurde erstmals von Wong und Neumann an Fibroblasten durchgeführt (Wong und Neumann, 1982; Neumann et al., 1982). Die Technik wurde dann auf alle Zelltypen verallgemeinert (Potter et al., 1984) – auch auf solche wie Lymphozyten, die im Gegensatz zu Fibroblasten nicht mit anderen Verfahren transfiziert werden können (z.B.,
Oliver Smithies und Kollegen nutzten dann die Elektroporation, um DNA in embryonale Stammzellen (ES-Zellen) einzubringen, und entwickelten zielgerichtete Vektoren, die es der eingebrachten DNA ermöglichten, sich mit homologen Regionen im Genom zu rekombinieren und entweder ein verändertes Gen oder eine Störsequenz einzubringen, um ES-Zellen mit einem bestimmten Gen „knocked in“ oder „knocked out“ zu erzeugen. Die veränderten ES-Zellen wurden dann verwendet, um die entsprechenden Knockin- oder Knockout-Mäuse zu erzeugen. Die Elektroporation wurde für diese Gentransferanwendungen benötigt, da sie die DNA in nackter Form in die Zellen einbringt, die leicht an der homologen Rekombination teilnehmen kann. Diese Erweiterung der Elektroporation führte dazu, dass Dr. Smithies 2007 den Nobelpreis für Medizin oder Physiologie erhielt. Die Methodik für die Elektroporation von ES-Zellen ist im Wesentlichen dieselbe wie für andere Säugetierzellen. Wenn ein homologer Genaustausch erwünscht ist, müssen Vektoren entwickelt werden, die ein „Positiv-Negativ“-Screening ermöglichen (Bronson und Smithies, 1994; Joyner 2000), so dass eine Selektion alle Zellen erfasst, in die die elektroporierte DNA in das Genom eingefügt wurde, und die zweite Selektion gegen ES-Klone erfolgt, in die die DNA zufällig eingefügt wurde. Knockin/out-Mäuse können dann erzeugt werden, indem man die ausgewählten geklonten ES-Zellen mit Embryonen fusioniert, sie reimplantiert, um die Entwicklung zu ermöglichen, und die resultierenden Chimären züchtet, um Mäuse zu erzeugen, in denen alle Zellen das veränderte Gen tragen.
Obwohl ganze Pflanzen oder Blattgewebe durch Elektroporation transfizierbar sind, müssen Pflanzenzellen im Allgemeinen zu Protoplasten gemacht werden, bevor die DNA leicht in sie eingeführt werden kann (alternatives Protokoll; Fromm et al., 1985; Ou-Lee et al., 1986). Wie Säugetierzellen können auch Pflanzenprotoplasten unter verschiedenen elektrischen Bedingungen (kritische Parameter) elektroporiert werden. Sowohl hohe Spannung mit niedriger Kapazität (kurze Pulsdauer) als auch niedrige Spannung mit hoher Kapazität (lange Pulsdauer) wurden für einen erfolgreichen Gentransfer verwendet (Chu et al., 1991). Die In-vivo-EP wurde ursprünglich zur Verabreichung von Chemotherapeutika an solide Tumore eingesetzt und hat sich von präklinischen Studien bis hin zu klinischen Versuchen entwickelt (Gothelf, et al., 2003). Über die In-vivo-Verabreichung von Plasmid-DNA mit Hilfe der Elektroporation wurde erstmals Anfang bis Mitte der 1990er Jahre berichtet (Titomarov, et al., 1991; Heller, et al., 1996; Nishi, et al., 1996) und war ein logischer Fortschritt, der auf dem Erfolg der In-vitro-Transfektion mit Elektroporation und dem Nachweis beruhte, dass das Verfahren bei der Verabreichung kleiner Moleküle wie Chemotherapeutika sicher in vivo durchgeführt werden kann. Der Einsatz der In-vivo-Elektroporation für die Verabreichung von Plasmid-DNA hat zu einem enormen Anstieg der Zahl der durchgeführten präklinischen Studien geführt und wurde vor kurzem in die Klinik übertragen (Heller, et al., 2006a und Bodles-Brakhop, et al., 2009).
Die breite Anwendung der Elektroporation wurde zum großen Teil durch die Verfügbarkeit kommerzieller Geräte ermöglicht, die sicher und einfach zu bedienen sind und äußerst reproduzierbare Ergebnisse liefern. Die Ausführungen dieser Geräte sind sehr unterschiedlich, lassen sich aber in zwei Grundkategorien einteilen, die unterschiedliche Mittel zur Steuerung von Pulsdauer und Spannung (die beiden elektrischen Parameter, die die Porenbildung steuern) verwenden. Eine Art verwendet ein Kondensatorentladungssystem, um einen exponentiell abklingenden Stromimpuls zu erzeugen, die andere erzeugt eine echte Rechteckwelle (oder eine Annäherung daran). Die Kondensatorentladungsgeräte laden ihren internen Kondensator auf eine bestimmte Spannung auf und entladen ihn dann durch die Zell-DNA-Suspension. Sowohl die Größe des Kondensators als auch die Spannung können variiert werden. Da der Stromimpuls eine exponentiell abklingende Funktion (1) der Anfangsspannung, (2) der Kapazitätseinstellung des Geräts und (3) des Widerstandes des Stromkreises (einschließlich der Probe) ist, führt eine Änderung der Kondensatorgröße, die es ermöglicht, mehr (oder weniger) Ladung bei der Spannung zu speichern, zu längeren (oder kürzeren) Abklingzeiten und damit zu einer anderen effektiven Impulsdauer. Im Gegensatz dazu steuern Rechteckwellengeneratoren sowohl die Spannung als auch die Impulsdauer mit Festkörperschaltgeräten. Sie können auch schnell wiederkehrende Pulse erzeugen. Für In-vivo-Anwendungen werden Rechteckwellengeneratoren bevorzugt. Neben der Pulsdauer und -amplitude beeinflussen auch die Anzahl der Pulse und die Elektrodenkonfiguration die Effizienz der Verabreichung.
Die meisten unserer In-vitro-Elektroporationsexperimente wurden mit dem Bio-Rad Gene Pulser, einem Kondensatorentladungsgerät, durchgeführt, lassen sich aber auch direkt auf andere Kondensatorentladungsgeräte und mit einigen Anpassungen auf Rechteckwellengeneratoren anwenden. Kondensatorentladungsgeräte sind auch von GIBCO/BRL, BTX, Hoeffer Scientific und International Biotechnologies erhältlich (Adressen der Lieferanten siehe ANHANG 4). Diese Geräte, entweder in einer einzigen Einheit oder durch Zusatzkomponenten, können eine Vielzahl von Elektroporationsbedingungen liefern, die für die meisten Anwendungen geeignet sind. Rechteckwellengeneratoren sind von BTX, Baekon, CytoPulse Sciences, Sonidel, Bio-Rad, Jouan und IGEA erhältlich und bieten eine gute Kontrolle über die Impulsbreite, ermöglichen mehrere, schnelle Impulse und können für Zellen, die sehr empfindlich oder anderweitig schwer zu transfizieren sind, effektiver sein. Der Einsatz der Elektroporation zur Gentherapie bei lebenden Tieren oder Menschen erfordert ebenfalls eine gute Kontrolle der Elektroporationsparameter, um einen effizienten DNA-Transfer bei minimaler Gewebeschädigung zu gewährleisten. Es gibt Generatoren, die Pulse mit konstanter Spannung oder konstantem Strom abgeben. Diese Anbieter liefern nicht nur Rechteckgeneratoren, sondern auch Elektroden, die für die In-vivo-Elektroporation geeignet sind. Diese Geräte sind im Allgemeinen teurer. Es hat sich gezeigt, dass Wechselstromimpulse bei ~100 kHz die effektivste Wellenform für die Elektroporation und möglicherweise auch für die Elektrofusion sind (Chang, 1989).
Bei den meisten unserer In-vivo-Experimente wurden die Rechteckwellengeneratoren BTX T820 oder T830 verwendet. Bei diesen Experimenten wurden sowohl handelsübliche Elektroden, wie z.B. ein 2-Nadel-Array, Zangenelektroden und Pinzettenelektroden, als auch speziell entwickelte Elektroden verwendet. Wie bereits erwähnt, bieten die großen Anbieter von Elektroporationsgeräten eine Vielzahl von durchdringenden und nicht durchdringenden Elektroden an. Rechteckwellengeneratoren ermöglichen eine bessere Kontrolle der Impulsparameter, was bei der In-vivo-Eingabe besonders wichtig ist. Die zunehmende Verwendung der In-vivo-Elektroporation steht in direktem Zusammenhang mit ihrer effektiven Verabreichung in den Muskel. Die intramuskuläre Verabreichung von Genen mit Hilfe der Elektroporation ist insbesondere für Impfzwecke von Bedeutung (Abdulhagg, et al., 2008). Der Muskel hat sich auch als hervorragendes Depot für genbasierte Proteinersatzanwendungen erwiesen (Trollet, et al., 2006). Die Verabreichung an Muskeln kann auch für die Verabreichung von Impfstoffen gegen Krebs genutzt werden (Bodles-Brakhop, et al., 2009). Auch die Übertragung auf die Haut hat sich als vielseitiges Ziel durchgesetzt. Die Verabreichung an die Haut kann zur direkten Behandlung von Hautkrankheiten, zur Verabreichung von Proteinen in den Blutkreislauf für die systemische Therapie, zur Krebstherapie und zur Verabreichung von DNA-Impfstoffen verwendet werden (Hirao, et al., 2008, Roos, et al., 2006, Glasspool-Malone, et al., 2000).
Die Elektroporation ist einfacher durchzuführen als alternative Techniken, weshalb sie zunehmend eingesetzt wird. Ihr Nachteil für die Verwendung bei der Transientenanalyse ist, dass fast fünfmal mehr Zellen und DNA benötigt werden als bei der Calciumphosphat- oder DEAE-Dextran-vermittelten Transfektion (UNITS 9.1, 9.2 & 16.12). Der Hauptunterschied zwischen Elektroporation und Kalziumphosphat-Copräzipitation ist der Zustand der integrierten DNA nach der Selektion in geeigneten antibiotischen Medien. Im Falle von Kalziumphosphat liegt die Menge der aufgenommenen und in das Genom jeder transfizierten Zelle integrierten DNA im Bereich von 3 × 106 bp. Infolgedessen wird die transfizierte DNA oft in Form großer Tandem-Arrays integriert, die viele Kopien der transfizierten DNA enthalten. Dies wäre von Vorteil, wenn die Transfektion genomischer DNA in Empfängerzellen und die Selektion auf eine bestimmte phänotypische Veränderung, z. B. eine maligne Transformation, erwünscht ist; in diesem Fall ist eine große Menge integrierter DNA pro Empfängerzelle erforderlich. Im Gegensatz dazu kann die Elektroporation so eingestellt werden, dass eine bis viele Kopien der eingefügten DNA pro Empfängerzelle entstehen. Dies wäre ein Vorteil für Studien zur Genexpression, da die Identität der jeweiligen Kopie, die für die Genexpression verantwortlich ist, kontrolliert werden kann, und ist, wie oben erörtert, wesentlich für das Gen-Targeting von ES-Zellen zur Erzeugung transgener Mäuse.