3.4 Inosin-Modifikation und mRNA-Turnover
Die Modifikation von mRNAs von Adenosin zu Inosin (A-I) wird durch Adenosin-Deaminasen katalysiert, die auf RNA-Enzyme (ADARs) wirken. Diese Enzyme haben eine Vorliebe für doppelsträngige RNA-Regionen, und die Umwandlung von A-I (in diesem Abschnitt auch als Editing bezeichnet) verändert die Basenpaarungseigenschaften der modifizierten Basen, da sie nun eine ähnliche Basenpaarung wie Guanin eingehen. Wie zuvor werden wir die direkten Auswirkungen von Inosin auf die mRNA-Stabilität von denen trennen, die sich aus indirekten Auswirkungen ergeben. Die Einführung von Inosin in doppelsträngige RNA-Regionen kann den Abbau durch die Rekrutierung von Ribonukleasen auslösen, die spezifisch für Inosin-haltige RNAs sind. Das erste Enzym, von dem man annimmt, dass es diese Wirkung vermittelt, ist die Tudor-Staphylococcus-Nuklease (SN), die nachweislich die Spaltung von hypereditierten doppelsträngigen RNAs in Extrakten fördert. Die meisten der in dieser Studie beschriebenen Ergebnisse belegen eine biochemische Aktivität der Tudor-SN auf hypereditierten Substraten in vitro. Aus diesen Studien geht jedoch nicht hervor, welcher Anteil der Inosin-haltigen mRNAs in vivo von Tudor-SN gespalten wird und ob Tudor-SN die direkte Endonuklease ist oder nicht. Es wurde festgestellt, dass Tudor-SN in zytoplasmatischen Stressgranula lokalisiert ist, so dass es möglich ist, dass einige ihrer Zieltranskripte unter Stressbedingungen bevorzugt reguliert werden. Die zweite Nuklease, von der bekannt ist, dass sie spezifisch für inosinhaltige RNAs ist, ist die humane Endonuklease V (hEndoV), die in vitro eine Vielzahl von inosinhaltigen RNA-Substraten spalten kann. Eine Studie legt nahe, dass hEndoV die eigentliche Inosin-Endonuklease ist, wobei Tudor-SN der hEndoV eine stimulierende Wirkung verleiht. Interessanterweise ist hEndoV auch in zytoplasmatischen Stressgranula lokalisiert, was auf eine ähnliche Funktion wie Tudor-SN bei der potenziellen Regulierung des Gehalts an inosinhaltigen mRNAs bei Stress hindeutet. Insgesamt ist zwar klar, dass es in eukaryontischen Zellen inosinspezifische Nuklease-Aktivitäten gibt (Abb. 5), aber ihr Beitrag zur mRNA-Spaltung und zum mRNA-Umsatz ist nach wie vor kaum bekannt. Daher müssen die physiologischen Auswirkungen der Spaltung von hypereditierter dsRNA durch Tudor-SN und/oder hEndoV noch gründlicher erforscht werden.
ADAR-Enzyme können auch eine wichtige Rolle bei der mRNA-Stabilität spielen, indem sie die Bindung von RNA-bindenden Proteinen regulieren, die den mRNA-Zerfall beeinflussen. Der Einfluss von ADARs auf den Spiegel ihrer Ziel-mRNAs wurde global gemessen, und im Allgemeinen korreliert ihr Einfluss auf den mRNA-Spiegel nicht mit ihrer Fähigkeit, die Inosinbildung in diesen mRNAs zu fördern. Vielmehr hat es den Anschein, dass der Haupteinfluss der ADARs auf die mRNA-Stabilität durch die Rekrutierung des RNA-bindenden Proteins HuR (ELAVL1) erfolgt, das ein wichtiger Regulator des mRNA-Zerfalls ist. ADAR1 interagiert mit HuR in einer RNA-abhängigen Weise, und die meisten mRNAs, die in Abwesenheit von ADAR1 herunterreguliert werden, enthalten HuR-bindende Stellen. Somit scheint ADAR1 die Stabilität seiner mRNA-Ziele durch die Rekrutierung von HuR an nahe gelegene Zielstellen zu beeinflussen. ADARs können auch den Spiegel verschiedener mRNAs und ncRNAs regulieren, indem sie die Bindung des Zerfallsfaktors PARN, einer poly(A)-spezifischen Nuklease, verhindern. Diese Funktion scheint auch unabhängig von der Editierung zu sein, da eine katalytisch inaktive ADAR-Mutante die Funktionen des Enzyms bei der Kontrolle des Zerfalls erfüllen kann. Somit scheint der Einfluss von ADARs auf die Stabilität ihrer mRNA-Ziele weitgehend unabhängig von ihrer Fähigkeit zu sein, die Bildung von Inosin zu fördern.
Eine wichtige Folge der Inosin-Modifikation auf den mRNA-Umsatz ist auf die Auswirkungen von Inosin auf die mikroRNA-vermittelte Genregulation zurückzuführen. Das Vorhandensein von Inosin kann zwei wichtige Schritte dieses Weges beeinflussen: (i) die Biogenese von microRNAs und (ii) die Spezifität des Targetings von mRNAs durch microRNAs. Was die Auswirkungen von Inosin auf die Biogenese von microRNAs betrifft, so wurde gezeigt, dass primäre Vorläufer von microRNAs durch ADAR1 oder ADAR2 editiert werden können. Das Vorhandensein von Inosin in diesen Vorläufern hat zwei nachteilige Auswirkungen auf die Produktion reifer microRNAs . Erstens verringert Inosin die Effizienz der Verarbeitung der primären Vorstufen durch Drosha; zweitens werden inosinhaltige Vorstufen nun zu einem Ziel für inosinspezifische Ribonukleasen wie Tudor-SN und/oder hEndoV. Diese kombinierten Wirkungen der Inosin-Modifikation auf die primären Vorläufer der mikroRNAs führen zu einem Rückgang der aus diesen Vorläufern gebildeten mikroRNAs und gleichzeitig zu einem Anstieg der Ziel-mRNAs. Dieser Prozess kann reguliert werden, denn es wurde gezeigt, dass Vorläufer der microRNA miR-151 während der frühen Entwicklung editiert werden, was zu einem Abbau der Vorläufer durch Tudor-SN führt. Generell werden Vorläufer von mikroRNAs, die Inosin enthalten, in postzygotischen Stadien bei Mäusen abgebaut. Diese Ergebnisse zeigen, dass die A-I-Bearbeitung von microRNA-Vorläufern deren Biogenese während der Entwicklung regulieren kann, was sich wiederum direkt auf die Expression ihrer mRNA-Ziele auswirkt. Die Wirkung von ADARs auf die microRNA-Biogenese ist jedoch komplex, denn es wurde auch gezeigt, dass ADAR1 mit dem RNase-III-Enzym Dicer heterodimerisiert, um die Effizienz der microRNA-Verarbeitung zu erhöhen, und somit eine positive Rolle bei der microRNA-Biogenese spielt. Die Komplexität der direkten und indirekten Auswirkungen von ADARs auf die Biogenese kleiner RNAs wurde auch genomweit in Caenorhabditis elegans nachgewiesen. Schließlich kann ADAR1 in Säugetierzellen auch unabhängig vom RNA-Editing siRNAs binden, was die Wirksamkeit der siRNA-Behandlung einschränkt. ADARs scheinen daher ein zweischneidiges Schwert für die durch microRNA und kleine RNAs vermittelte Stilllegung von Genen zu sein, da die unterdrückende Wirkung der Inosin-Modifikation auf die Verarbeitung und Stabilität von microRNA-Vorläufern durch die Fähigkeit der ADARs, die Verarbeitung von microRNAs durch ihre Assoziation mit Dicer zu fördern, und ihre Wirkung auf die Verfügbarkeit von siRNAs ausgeglichen werden kann. Dennoch spielen diese Enzyme bei der Kontrolle der zellulären Differenzierung durch die Bearbeitung von microRNA-Vorläufern eine wichtige Rolle. So konnte beispielsweise gezeigt werden, dass die Hypereditierung des mikroRNA-Vorläufers Let-7 durch ADAR1 bei Leukämie die Erneuerung von Leukämie-Stammzellen fördert, was die Bedeutung der Feinabstimmung der Editierung von mikroRNA-Vorläufern während der Zelldifferenzierung unterstreicht.
Inosin beeinflusst auch die mikroRNA-vermittelte mRNA-Regulierung, indem es die RNA-Duplexbildung beeinflusst, die für die Bestimmung der Spezifität der Wechselwirkungen zwischen mikroRNAs und mRNAs entscheidend ist (Abb. 5). Dies wurde erstmals dadurch nachgewiesen, dass die Einführung von Inosin in die microRNA miR-376 zur Unterdrückung einer anderen Gruppe von mRNAs führte als die Unterdrückung durch die unmodifizierte miR-376. Befindet sich die editierte Stelle in der Seed-Sequenz der microRNA, führt die Modifikation zu einer Änderung der Spezifität für die microRNAs, da Inosin bevorzugt mit C basenpaart. Umgekehrt verändert das A-I-Editing in 3′-UTR-Sequenzen von mRNAs die potenzielle Ausrichtung dieser UTRs durch microRNAs und kann neue microRNA-Bindungsstellen schaffen. Es wurde gezeigt, dass reguliertes Editing bei der Regulierung von Onkogenen und Tumorsuppressorgenen durch microRNAs während der Zelltransformation von Bedeutung sein kann.
Schließlich kann Inosin die mRNA-Stabilität durch indirekte Effekte beeinflussen. Es wurde festgestellt, dass Inosin-haltige mRNAs in LPS-stimulierten Immunzellen auf den Zellkern beschränkt sind, wodurch sie der zytoplasmatischen mRNA-Zerfallsmaschinerie nicht zugänglich sind. Wenn diese mRNAs jedoch im Kern verbleiben, werden sie bevorzugt durch nukleäre Abbauwege wie das Kernexosom abgebaut. Dies kann zu einer Erhöhung oder Verringerung der Stabilität führen, je nach der relativen Effizienz jedes dieser Abbauwege für bestimmte mRNAs. Inosin wirkt sich auch auf das alternative Spleißen aus, was wiederum zu mRNA-Isoformen mit unterschiedlicher Stabilität führen kann. Dies gilt insbesondere dann, wenn die alternativ gespleißten Spezies Bindungsstellen für verschiedene RNA-bindende Proteine enthalten, die ihre Stabilität modulieren. Daher können Inosin und ADARs die mRNA-Stabilität und -Expression auf vielfältige Weise durch eine Kombination direkter und indirekter Effekte beeinflussen.