Ergebnisse

Analyse klinischer Proben.

Im September 2006 wurde das Influenzavirus A/Swine/Missouri/4296424/2006 (Sw/4296424) von mehreren 5 bis 6 Wochen alten Schweinen mit multifokaler Bronchopneumonie in einer kommerziellen Schweinezucht mit mehreren Quellen isoliert. Die Lungenläsionen umfassten eine mittelschwere, subakute bis chronische, eitrige Bronchopneumonie und eine interstitielle Pneumonie mit Bronchiolitis und Peribronchitis. Das Lungengewebe war negativ für das porcine reproduktive und respiratorische Syndromvirus (PRRSV), das porcine Circovirus Typ 2 (PCV2) und Mycoplasma hyopneumoniae, aber positiv für Streptococcus suis. Aufgrund der charakteristischen grippeähnlichen Läsionen und der klinischen Anzeichen einer Lungenentzündung wurde Lungengewebshomogenat auf Madin-Darby-Kaninchen-Nierenzellen (MDCK) beimpft. Zytopathische Wirkungen wurden am Tag 3 nach der Inokulation (p.i.) festgestellt. Das Nukleoprotein (NP)-Gen des Influenzavirus wurde in den infizierten Zellen durch RT-PCR nachgewiesen. Das Virus reagierte in Hämagglutinationshemmungstests (HI) nicht mit Referenz-Schweine-Antisera (A/Sw/IA/1973 H1N1, A/Sw/TX/1998 H3N2, A/Sw/NC/2001 H1N1), und in der Multiplex-RT-PCR wurden keine H1N1- oder H3N2-Gene nachgewiesen (14). Das Virus wurde dem National Animal Disease Center (NADC) im Februar 2007 zur Subtypisierung und Sequenzierung vorgelegt.

Nachdem das September-Isolat subtypisiert und sequenziert worden war (siehe unten), ergab eine Suche in den Fallakten, dass im April 2006 ein weiteres „untypisierbares“ Influenza-Isolat eingereicht worden war. A/Swine/Missouri/2124514/2006 (Sw/2124514) war von einem 12 Wochen alten Schwein isoliert worden, das in einem anderen kommerziellen Schweinezucht- und -veredelungsbetrieb an einer Atemwegserkrankung litt. Die Lungenläsionen waren histopathologisch charakteristisch für die Schweineinfluenza (schwere, subakute Entzündung der Alveolen und Bronchien mit bronchiolärer Epithelzellnekrose und Metaplasie). Die Lunge war negativ für PRRSV, PCV2 und M. hyopneumonia, aber positiv für Influenza-A-Virus durch RT-PCR (spezifisch für das NP-Gen) und S. suis. Das Virus wurde dem NADC im März 2007 zur Subtypisierung und Sequenzierung vorgelegt.

Subtypisierung und phylogenetische Analyse.

Um beide Influenzaviren zu identifizieren und zu charakterisieren, wurden Nukleinsäuresequenzierung sowie molekulare und phylogenetische Analysen durchgeführt. Beide Viren wurden mit Hilfe von MDCK-Zellen direkt aus Low-Passage-Isolaten sequenziert, und die Sequenzen wurden nach Plaque-Reinigung und Resequenzierung bestätigt. Sie wurden durch Nukleotidsequenz und eine BLAST-Suche in der Influenza Sequence Database (www.flu.lanl.gov) als H2N3-Viren identifiziert. Das HA-Gensegment von Sw/4296424 stimmte am ehesten mit dem von H2-Viren überein, die von Stockenten in Nordamerika isoliert wurden. Sein NA-Segment war eng mit dem eines H4N3-Vogelgrippevirus (AIV) verwandt, das von Blauflügelenten isoliert wurde (98,3 % Identität). Mit Ausnahme des PA-Gens (Polymerase Acidic) stammten seine internen Gene von den heutigen dreifach-reassortanten Schweinegrippeviren, die derzeit in den Vereinigten Staaten vorkommen. Diese Viren tragen interne Gene von menschlichen (PB1), aviären (PB2, PA) und Schweine-Influenzaviren (SI Tabelle 4). Sein PA-Segment war zu 99,2 % identisch mit dem des aus Stockenten isolierten H6N5-AIV (SI-Tabelle 4). Die Viren Sw/2124514 und Sw/4296424 wiesen eine Gesamtnukleotidsequenzidentität von 99,3-99,9 % auf (SI-Tabelle 5). Beide Isolate wurden wiederholt plaque-kloniert, erneut getestet und durch Sequenzierung als zum H2N3-Subtyp gehörig bestätigt. Der H2N3-Subtyp wurde serologisch durch Hämagglutinationshemmung und Neuraminidasehemmungstests bestätigt. Eine phylogenetische Analyse auf der Grundlage der HA- und NA-Gene zeigte, dass diese beiden Viren zur amerikanischen Vogelstammlinie gehören, die sich von den eurasischen Vogelstämmen und den H2N2-Viren unterscheidet, die nach der Influenzapandemie von 1957 beim Menschen isoliert wurden (Abb. 1).

Molekulare Analyse der HA- und NA-Oberflächenproteine.

Influenza-A-Viren enthalten zwei Oberflächenproteine: das HA ist das rezeptorbindende und membranfusionierende Glykoprotein, und das NA ist ein rezeptorzerstörendes Enzym. Das virale HA ist ein entscheidender Faktor für die Wirtsspeziesspezifität von Influenzaviren (15). Um die Reste innerhalb der HA zu charakterisieren, die möglicherweise mit der Anpassung eines Vogelvirus an den Säugetierwirt zusammenhängen, haben wir die Aminosäuresequenzen der HA von Schweinen mit denen der mutmaßlichen Referenzviren von Vögeln verglichen. Der molekulare Vergleich der HA-Moleküle der beiden H2N3-Schweineisolate ergab, dass sie sich von dem aus Stockenten isolierten H2N3-Referenzvirus durch sechs gemeinsame Aminosäuresubstitutionen (D36N, Q226L, T274I, V316I, L419I und L506V) unterscheiden (SI-Tabelle 6). Die Substitution Q226L wurde in beiden H2N3-Schweineisolaten gefunden, während Position 228 ein G enthielt, das mit der aviären Konsensussequenz identisch ist (Tabelle 1) (16). Im Gegensatz dazu enthalten menschliche HA-Moleküle des H2-Subtyps 226L und 228S, während frühe menschliche H2-Isolate 226L und 228G enthalten (Tabelle 1), ähnlich wie die Schweineisolate. Die Positionen 36N, 274I, 316I und 419I sind einzigartig für die beiden H2N3-Schweineisolate (SI-Tabelle 6), während die entsprechenden Positionen in den in Abb. 1 a dargestellten Human- und Vogelisolaten 36D, 274T, 316V und 419L sind. Bei den in Abb. 1 a dargestellten Influenza-Isolaten ist die Position 506V beim Menschen, bei zwei H2N3-Schweineisolaten und bei den Vogelisolaten konserviert, mit Ausnahme von A/mallard/Alberta/2004 (H2N3), wie in SI-Tabelle 6 dargestellt. Zwei gemeinsame Aminosäureveränderungen in der NA-Aminosäuresequenz der beiden Schweineisolate wurden im Vergleich zum H4N3-Referenzvirus, das aus Blauflügelenten isoliert wurde, festgestellt: H47Y und H253Y (SI-Tabelle 7). Die Position 47Y in beiden H2N3-Schweineisolaten ist die gleiche wie die entsprechende Aminosäure in den in Abb. 1 b dargestellten eurasischen Vogelisolaten; umgekehrt ist die Position in den nordamerikanischen Vogelisolaten 47H. Die Position 253Y ist einzigartig für die H2N3-Schweineisolate, und die Position 253H ist in den in Abb. 1 b dargestellten eurasischen und nordamerikanischen Vogelisolaten konserviert. Interessanterweise wies Sw/4296424 (H2N3), das fünf Monate später als Sw/2124514 (H2N3) isoliert wurde, zwei zusätzliche Substitutionen (P162S und L321V) im HA-Molekül und drei zusätzliche Substitutionen (V30I, I49T und A135T) im NA-Molekül auf, wenn es mit dem HA und NA von Sw/2124514 verglichen wurde (SI-Tabellen 6 und 7). Die Position 30I (Sw/4296424) im NA-Molekül ähnelt eurasischen Isolaten, während die Position 30V (Sw/2124514) in nordamerikanischen Vogelisolaten konserviert ist.

Pathogenität und Übertragbarkeit von H2N3-Schweine-Influenzaviren bei Schweinen.

Um das Ausmaß der Anpassung des H2N3-Virus an das Schwein zu untersuchen, haben wir seine Pathogenität in diesem Wirt durch Inokulation von 20 4 Wochen alten Schweinen mit 2 × 106 50% Gewebekultur-Infektionsdosis (TCID50) des Sw/4296424-Virus untersucht. Aufgrund der hohen Identität der beiden Isolate wurde nur ein H2N3-Virus ausgewählt. Zwölf Kontrollschweine wurden mit nicht infektiösem Zellkulturüberstand fiktiv inokuliert. Die Übertragbarkeit wurde durch die gemeinsame Unterbringung von 10 altersgleichen Kontaktschweinen mit den geimpften Schweinen ab Tag 3 p.i. geprüft. Alle Schweine, die für die Studie verwendet wurden, waren am Tag 0 seronegativ in Bezug auf Antikörper gegen die Schweinegrippe-Viren H1N1, H1N2, H2N3 und H3N2 mittels HI-Test. Fünf geimpfte Schweine und drei Kontrollschweine wurden am 3., 5. und 7. Tag nach der Infektion zur Sektion geschlachtet. Die 10 Kontaktschweine und die 5 mit dem Virus geimpften Schweine wurden am Tag 24 nach dem Kontakt bzw. am Tag 27 nach der Infektion mit dem H2N3-Virus serologisch getestet. Es wurden keine akuten respiratorischen Symptome beobachtet. Bei der Nekropsie wurden bei den geimpften Schweinen schwere makroskopische Lungenläsionen (pflaumenfarbene, verdichtete Bereiche) festgestellt, bei den Kontrollschweinen jedoch keine (Tabelle 2). Der histopathologische Score (0-3), der das Ausmaß der Schädigung der Lungenarchitektur ausdrückt, betrug bei den geimpften Schweinen >2 (Tabelle 2). Die Lungen von geimpften Schweinen, die am Tag 3, 5 oder 7 p.i. eingeschläfert wurden, wiesen eine leichte bis mittelschwere interstitielle Pneumonie und eine akute bis subakute nekrotisierende Bronchiolitis mit leichter lymphozytärer Manschettenbildung in Bronchiolen und Gefäßen auf (Abb. 2). Das Virus wurde in bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit (BALF) titriert und aus Nasenabstrichproben isoliert. Die Virustiter in der Lunge lagen zwischen 104,3 und 106,5 TCID50/ml an den Tagen 3 und 5 p.i. (SI-Tabelle 8) und waren am Tag 7 p.i. negativ. In der H2N3-geimpften Gruppe wurde das Virus bei 25 % (5 von 20) der Schweine am Tag 3, bei 67 % (10 von 15) am Tag 5 und bei 20 % (2 von 10) am Tag 7 p.i. aus Nasenabstrichen isoliert; in der Kontaktgruppe waren 10 % (1 von 10) der Proben am Tag 5 und 7 nach Kontakt positiv. Im Gegensatz dazu waren 100 % (10 von 10) der Kontaktschweine nach 24 Tagen Kontakt mit geimpften Schweinen seropositiv (SI Tabelle 9). Einige Kontrollschweine wiesen gelegentlich einen kleinen Herd einer leichten interstitiellen Lungenentzündung auf (Tabelle 2), waren jedoch negativ auf eine Infektion mit dem Schweineinfluenzavirus. Alle Schweine waren mittels PCR negativ für PRRSV und M. hyopneumoniae. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass das H2N3-Virus bei Schweinen pathogen und unter Schweinen übertragbar ist.

Pathogenität von H2N3-Schweinegrippeviren in Mäusen.

Um die Fähigkeit des H2N3 Sw/4296424-Virus zu testen, sich in Mäusen zu vermehren, haben wir 6 bis 7 Wochen alte BALB/c-Mäuse intranasal mit 102-106 TCID50 geimpft. Mäuse, die mit 104 TCID50 oder mehr geimpft wurden, zeigten Krankheitsanzeichen (z. B. erschwerte Atmung, raues Fell, Gewichtsverlust und Lethargie) (SI-Tabelle 10). Fünfundsiebzig Prozent der Mäuse, die 106 TCID50 erhielten, starben, aber bei niedrigeren Dosen gab es keine Todesfälle. Virale RNA wurde mittels Echtzeit-RT-PCR (17) in den Lungen von Mäusen nach Inokulation mit 106 oder 105 TCID50 nachgewiesen (SI-Tabelle 10). Histopathologisch induzierte das H2N3-Virus multiple oder zusammenwachsende Herde von interstitieller Pneumonie und proliferativer Alveolitis, die durch eine ausgeprägte Pneumozytenhypertrophie und eine Infiltration der Alveolarwände mit einer gemischten Population von Makrophagen, Lymphozyten und Neutrophilen gekennzeichnet war (SI Abb. 3). Einige Alveolarlumina enthielten Fibrinklümpchen und leicht gemischte leukozytäre Exsudate. Insgesamt deuten diese Befunde darauf hin, dass H2N3 in Mäusen ohne vorherige Anpassung pathogen ist.

Übertragbarkeit des H2N3-Schweinegrippevirus in Frettchen.

Um eine Pandemie zu verursachen, muss ein neu auftretendes Influenza-A-Virus den Menschen infizieren und effizient unter Menschen übertragen werden. Um das Potenzial des reassortierten H2N3-Virus zur Übertragung in Säugetiersystemen zu untersuchen, haben wir das Frettchen-Kontaktmodell (18) verwendet. Drei 18 Wochen alte Frettchen, die in getrennten Käfigen untergebracht waren, wurden mit 102,5 TCID50 des H2N3-Virus Sw/2124514 geimpft. Nach 24 Stunden wurde ein Kontakttier in jeden Käfig gesetzt. An den Tagen 1, 4 und 7 p.i. wurden Nasenspülungen entnommen, und das Virus wurde in embryonierten Eiern titriert. Das Virus wurde bei allen geimpften Frettchen und Kontaktfrettchen nachgewiesen, aber keines zeigte offensichtliche klinische Anzeichen (Tabelle 3). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das H2N3-Influenzavirus Frettchen infizierte und durch Kontakt effizient übertragen wurde.

Serologische Untersuchung von H2N3-Schweinegrippeviren in Ausbruchsbetrieben.

Um die Ausbreitung der H2N3-Viren weiter zu untersuchen, führten wir eine begrenzte serologische Untersuchung von Tieren aus den beiden betroffenen Produktionssystemen durch. In der ersten Studie wurden im Frühjahr 2007 Serumproben von Sauen aus vier Betrieben genommen, die während des Ausbruchs im September 2006 Ferkel an die Aufzuchtbetriebe abgegeben hatten. Neunzig Prozent (54 von 60) waren seropositiv für das Vorhandensein von Antikörpern gegen Sw/4296424 (SI Tabelle 11). Einige der getesteten Tiere waren zum Zeitpunkt des Indexfalls anwesend, und es ist unklar, ob sie zu diesem Zeitpunkt infiziert waren oder ob sie später infiziert wurden. Die Daten zeigen jedoch, dass das Virus sowohl in den Sauen- als auch in den Aufzuchtbetrieben vorhanden war und dass das Virus effizient zwischen den Tieren übertragen wurde. Alle Sauen in diesem Betrieb wiesen Antikörpertiter >1:40 gegen H1N1- und H3N2-Schweinegrippeviren auf, da sie zuvor mit einem bivalenten Impfstoff gegen abgetötete H1N1- und H3N2-Influenzaviren geimpft worden waren.

Im Frühjahr 2007 wurden außerdem Serumproben von 30 Sauen und 90 abgesetzten Schweinen entnommen, die mit dem Ausbruch im April 2006 in Verbindung standen, und sie wurden mit dem HI-Test auf Antikörper gegen Sw/2124514 untersucht. Von den 30 Sauen und 90 abgesetzten Schweinen waren 1 von 30 bzw. 26 von 90 seropositiv (SI-Tabelle 11).