Wachstum und Ethanolproduktion von S. cerevisiae NCYC 2826 auf Weizenstrohhydrolysat

Abbildung 1A zeigt das Wachstum von S. cerevisiae National Collection of Yeast Cultures (NCYC) 2826 bei 30°C für 36 Stunden in einer Kultur, die ein Hydrolysat mit einer Glukosekonzentration von 123 mM enthält, das wie im Abschnitt „Methoden“ beschrieben hergestellt wurde. Der S. cerevisiae-Stamm wurde aufgrund seiner bekannten hohen Ethanoltoleranz und Robustheit in industriellen Fermentationen ausgewählt. Abbildung 1A zeigt, dass bei der Kultivierung von S. cerevisiae NCYC 2826 auf Weizenstrohhydrolysat allein eine langsame Wachstumsrate μ von 0,036 h-1 und eine optische Enddichte (OD) von 0,8 erreicht wurde. Die Zugabe von Yeast Nutrient Base (YNB) zu den Medien führte zu einem Anstieg der μ auf 0,135 h-1 und einer endgültigen OD von 1,5, während die Zugabe von 2,3 mg ml-1 Harnstoff zum Weizenstrohhydrolysat eine μ von 0,99 h-1 und eine endgültige OD von 1,3 ergab. Frühere Studien haben gezeigt, dass Harnstoffzusätze die Ethanolproduktion bei der Hefegärung steigern können und dass Harnstoff selbst ein wesentlicher Bestandteil der minimalsten Hefewachstumsmedien ist. Unsere Ergebnisse unterstützen diese früheren Erkenntnisse und bestätigen, dass Harnstoff für ein nahezu optimales Wachstum der Hefe erforderlich ist. Nach 36 Stunden wurde die Ethanolkonzentration in den Kulturen gemessen, und der aus 123 mM Glukose gewonnene Ethanolertrag betrug bei allen Kulturen etwa 90 % des theoretischen Gesamtertrags. Während die Ethanolausbeute unter diesen drei Kulturbedingungen vergleichbar war, war das Wachstum bei Weizenstrohhydrolysat langsamer und die endgültige optische Dichte geringer als bei Zugabe von Harnstoff oder YNB zu der Kultur. Dies deutet darauf hin, daß, obwohl Glukose für die Fermentation zur Verfügung stand, das Hydrolysat nicht genügend Nährstoffe enthielt, um der Kultur die Möglichkeit zu geben, sich mit maximaler Geschwindigkeit zu teilen und eine optimale Dichte zu erreichen.

Um die Ursache des verringerten Zellwachstums auf Weizenstrohhydrolysat zu untersuchen, wurde S. cerevisiae NCYC 2826 auf Hydrolysat kultiviert, das unter Verwendung von 5 %, 10 %, 15 % und 20 % Ausgangskonzentration an Stroh hergestellt und mit 2,3 mg ml-1 Harnstoff ergänzt wurde. Abbildung 1B zeigt, daß mit zunehmender Anfangskonzentration des Strohs auch die Verzögerungsphase des Wachstums auf 20 Stunden bei einer Anfangskonzentration von 20 % anstieg. Die endgültige OD stieg ebenfalls mit zunehmender Strohkonzentration an, was auf die erhöhten Konzentrationen an freigesetzter Glukose zurückzuführen ist. Die verlängerte Lag-Phase ist charakteristisch für die Hemmung des Wachstums durch Furanverbindungen, die häufig in Strohhydrolysaten enthalten sind. Die Analyse des Furangehalts des Hydrolysats zeigte, daß der HMF-Gehalt vernachlässigbar war (Daten nicht gezeigt), aber die Konzentration des vorhandenen Furfurals stieg mit der anfänglichen Strohkonzentration an und erreichte 0,5 mg ml-1 bei 20 % anfänglichem Strohgehalt (Abbildung 2). Diese Daten deuten darauf hin, dass das Wachstum von S. cerevisiae NCYC 2826 auf Weizenstrohhydrolysat durch die Furfuralkonzentration im Hydrolysat begrenzt wird.

Konzentration von Glucose (Quadrate) und Furfural (Dreiecke) in Weizenstrohhydrolysaten, die wie im Abschnitt „Methoden“ beschrieben hergestellt wurden, mit zunehmender Konzentration des Ausgangsstrohs.

Analyse des Wachstums des SGRP-Stammsatzes auf Furfural

Um Hefestämme zu identifizieren, die gegen kontaminierendes Furfural resistent sein könnten, wurde der in den Methoden beschriebene SGRP-Stammsatz in YNB, 100 mM Glucose und in Gegenwart von 1,5 mg ml-1 Furfural gezüchtet. Tabelle 1 zeigt die Analyse der Toleranz des SGRP-Stammsatzes gegenüber 1,5 mg ml-1 Furfural unter Verwendung des im Abschnitt „Methoden“ beschriebenen Punktesystems. Ein Punktesystem war anstelle der durchschnittlichen Verzögerungszeiten erforderlich, da Stammwiederholungen, die nicht wuchsen, keine messbare Verzögerungsphase aufwiesen, aber dennoch in den Datensatz aufgenommen werden mussten.

Wir hatten zuvor beobachtet, dass eine Erhöhung des Inokulums in furfuralhaltigen Kulturen zu einer Verkürzung der Lag-Phase führte, vermutlich durch Maximierung der Menge an lebensfähigen Hefezellen, die in das Medium eingebracht wurden, was zu einer schnelleren Etablierung der exponentiellen Wachstumsphase führte (Daten nicht gezeigt). Daher wurde für diese Versuche ein 5 %iges Inokulumvolumen der Übernachtkultur verwendet. Die Daten in Tabelle 1 zeigen, dass das Wachstum auf Replikatplatten extrem variabel und auch stammabhängig war, was beweist, dass eine Konzentration von 1,5 mg ml-1 Furfural ausreicht, um eine Furfuraltoleranz bei Stämmen von S. cerevisiae und S. paradoxus zu erkennen. Als das Wachstum der Stämme in YNB getestet wurde, das 100 mM Glukose und entweder 2,0 oder 3,0 mg ml-1 Furfural enthielt, wurde bei keinem der untersuchten Stämme unter diesen Bedingungen ein sehr geringes Wachstum beobachtet. Daher wurde beschlossen, die Stämme anhand der 1,5-mg-ml-1-Daten auszuwählen und sie einem ausführlicheren Furfural-Screening zu unterziehen. Die Analyse der in Tabelle 1 dargestellten Daten zeigt, dass die S. cerevisiae-Stämme bei 1,5 mg ml-1 Furfural insgesamt besser wachsen als die S. paradoxus-Stämme. Fast 20 % der getesteten S. paradoxus-Stämme erhielten keine Bestnote im Bewertungssystem, während dies bei S. cerevisiae weniger als 10 % waren, was sich auch in der höheren durchschnittlichen Gesamtnote für S. cerevisiae von 2,5 ± 1,4 im Vergleich zu 2,1 ± 1,4 für S. paradoxus widerspiegelt. Innerhalb der einzelnen Stammgruppen gab es jedoch erhebliche Unterschiede, wobei die Werte für S. cerevisiae zwischen 1,7 und 3,7 und für S. paradoxus zwischen 0,3 und 3,0 lagen. Stämme, die einen Wert von über 2,9 mit einer Standardabweichung von weniger als 1,5 aufwiesen, wurden als signifikant furfuraltolerant angesehen. Folglich wurden die S. cerevisiae-Stämme NCYC 3284 (ex Boden, USA), NCYC 3290 (ex Bili-Wein, Westafrika), NCYC 3312 (ex Boden, Niederlande) und NCYC 3451 (ex Würze, Irland) zusammen mit S. paradoxus NCYC 3277 (ex Eichenrinde, Großbritannien) in einem detaillierteren Furfural-Screening weiter untersucht.

Auswirkungen steigender Furfuralkonzentrationen auf das Wachstum und die Ethanolproduktion

Abbildung 3 zeigt das Wachstum in Gegenwart unterschiedlicher Furfuralmengen (0,1 bis 4,0 mg ml-1) für die S. cerevisiae-Stämme NCYC 3284, NCYC 3290, NCYC 3312 und NCYC 3451 sowie den S. paradoxus-Stamm NCYC 3277, der in Tabelle 1 aus dem SGRP-Stammsatz als besonders resistent gegen Furfural identifiziert wurde. Zusätzliche Datei 1: In Abbildung S1 sind die entsprechenden Wachstumsdaten auf einer logarithmischen Skala aufgetragen. Der Kontrollstamm S. cerevisiae NCYC 2826 wurde zu Vergleichszwecken ebenfalls einbezogen. Bei allen sechs Stämmen begannen die Wachstumskurven mit zunehmender Furfuralkonzentration eine Zunahme der Verzögerungsphase zu zeigen, wie sie zuvor bei furfuralhaltigem Wachstum beobachtet wurde. Alle getesteten Stämme waren in der Lage, auf YNB zu wachsen, das mit 100 mM Glukose und 0,1 bis 1,5 mg ml-1 Furfural ergänzt wurde. S. cerevisiae NCYC 2826, unser Kontrollstamm, war nur in der Lage, auf bis zu 1,5 mg ml-1 zu wachsen, was zu einer 30 %igen Verringerung der endgültigen OD im Vergleich zum Wachstum auf 0,1 mg ml-1 Furfural führte. Tabelle 2 zeigt, dass die Ethanolproduktion von NCYC 2826 unter diesen Bedingungen erheblich geringer war als der Ertrag von ca. 90 %, der beim Wachstum mit YNB und Glucose allein oder mit Weizenstrohhydrolysat beobachtet wurde. S. cerevisiae NCYC 2826 wurde aus Traubenmost isoliert und es ist daher unwahrscheinlich, dass es die Fähigkeit entwickelt hat, während der Exposition gegenüber Furfural zu wachsen und zu fermentieren.

In ihrer Populationsgenomikstudie identifizierten Liti et al. fünf klar definierte, geografisch isolierte S. cerevisiae-Linien (malaysisch, nordamerikanisch, saké, westafrikanisch und „Wine/European“) sowie viele verschiedene rekombinante (Mosaik-)Stämme dieser Linien identifiziert. Aus den Ergebnissen der vorliegenden Studie geht hervor, dass Furfuralresistenz kein phänotypisches Merkmal ist, das für eine bestimmte S. cerevisiae-Linie spezifisch ist. Von den vier identifizierten furfuralresistenten SGRP-S. cerevisiae-Stämmen gehört NCYC 3284 (YPS128) zur nordamerikanischen Linie, NCYC 3290 (DBVPG 6044) zur westafrikanischen Linie, NCYC 3312 (DBVPG 1373) zur „Wine/European“-Linie, während NCYC 3451 (ein Einzelsporenderivat von NCYC 361) ein rekombinanter Stamm ist.

S. cerevisiae NCYC 3451 zeigte die größte Furfural-Resistenz (Abbildung 3F, Additional file 1: Abbildung S1F) und konnte in Gegenwart von bis zu 3,0 mg ml-1 Furfural wachsen. Darüber hinaus schien die Ethanolproduktion in diesem Stamm nicht durch Furfural gehemmt zu werden, wobei die höchste Ethanolausbeute (95 ± 15 %; Tabelle 2) bei einer (Furfural-)Konzentration von 3,0 mg ml-1 erzielt wurde. Wie bereits erwähnt, handelt es sich bei NCYC 3451 um einen rekombinanten Stamm, der nachweislich ein mosaikartiges Genom aufweist, das aus mindestens drei verschiedenen Linien stammt, nämlich Saké, Westafrika und „Wine/European“ (Liti et al.). Obwohl er als Bierverderbnishefe aus Würze isoliert wurde, deutet die hochkomplexe Genomstruktur dieses Stammes stark darauf hin, dass er industriellen Ursprungs ist (z. B. ein Back- oder Braustamm), auch wenn dies nicht bewiesen ist. Von den vier verbleibenden getesteten SGRP-Stämmen waren die S. cerevisiae-Stämme NCYC 3290 und NCYC 3312 beide in der Lage, auf 2,5 mg ml-1 Furfural zu wachsen (Abbildung 3D,C, Zusatzdatei 1: Abbildung S1D bzw. S1C), während S. cerevisiae NCYC 3284 (Abbildung 3E, Zusatzdatei 1: Abbildung S1E) und S. paradoxus NCYC 3277 (Abbildung 3B, Zusatzdatei 1: Abbildung S1B) nur auf 2,0 mg ml-1 Furfural wachsen konnten. Insgesamt wurde die Ethanolproduktion der fünf SGRP-Stämme durch die Anwesenheit von Furfural nicht wesentlich beeinträchtigt. Bei NCYC 3312 führte das Vorhandensein von 0,5 mg ml-1 Furfural sogar zu einem deutlichen Anstieg der Ethanolausbeute, und zwar von 41 ± 8 % erwarteter Ausbeute auf 75 ± 5 % (Tabelle 2). Dies wurde auch bei dem bierschädlichen Stamm NCYC 3451 beobachtet, allerdings in geringerem Maße (nur 14 % höhere Ausbeute; Tabelle 2). In der Tat wurde kürzlich gezeigt, dass geringe Mengen von Furfurylalkohol, einem Produkt der Furfuraldehydratisierung in Hefe, tatsächlich zu einer Steigerung der Ethanolproduktion führen können.