Das Hsp70-System interagiert mit verlängerten Peptidabschnitten von Proteinen sowie mit teilweise gefalteten Proteinen, um die Aggregation von Proteinen in wichtigen Signalwegen zu bewirken und so die Aktivität zu drosseln. Wenn Hsp70 nicht mit einem Substratpeptid interagiert, befindet es sich normalerweise in einem ATP-gebundenen Zustand. Hsp70 selbst zeichnet sich durch eine sehr schwache ATPase-Aktivität aus, so dass eine spontane Hydrolyse erst nach vielen Minuten erfolgt. Wenn neu synthetisierte Proteine aus den Ribosomen austreten, erkennt die Substratbindungsdomäne von Hsp70 Sequenzen von hydrophoben Aminosäureresten und interagiert mit ihnen. Diese spontane Interaktion ist reversibel, und im ATP-gebundenen Zustand kann Hsp70 relativ frei Peptide binden und freisetzen. Das Vorhandensein eines Peptids in der Bindungsdomäne stimuliert jedoch die ATPase-Aktivität von Hsp70 und erhöht seine normalerweise langsame ATP-Hydrolyse. Wenn ATP zu ADP hydrolysiert wird, schließt sich die Bindungstasche von Hsp70 und bindet die nun eingeschlossene Peptidkette fest. Eine weitere Beschleunigung der ATP-Hydrolyse bewirken die so genannten J-Domänen-Cochaperone: in erster Linie Hsp40 in Eukaryoten und DnaJ in Prokaryoten. Diese Cochaperone erhöhen die ATPase-Aktivität von Hsp70 in Gegenwart von interagierenden Peptiden drastisch.

Durch enge Bindung an teilweise synthetisierte Peptidsequenzen (unvollständige Proteine) verhindert Hsp70, dass diese aggregieren und funktionsunfähig werden. Sobald das Protein vollständig synthetisiert ist, stimuliert ein Nukleotidaustauschfaktor (prokaryotisches GrpE, eukaryotisches BAG1 und HspBP1 sind einige der identifizierten Faktoren) die Freisetzung von ADP und die Bindung von frischem ATP, wodurch die Bindungstasche geöffnet wird. Das Protein kann sich dann selbständig falten oder zur weiteren Verarbeitung an andere Chaperone übergeben werden. HOP (das Hsp70/Hsp90 Organizing Protein) kann gleichzeitig an Hsp70 und Hsp90 binden und vermittelt den Transfer von Peptiden von Hsp70 zu Hsp90.

Hsp70 hilft auch beim Transmembrantransport von Proteinen, indem es sie in einem teilweise gefalteten Zustand stabilisiert. Es ist auch dafür bekannt, dass es phosphoryliert wird, wodurch mehrere seiner Funktionen reguliert werden.

Hsp70-Proteine können Zellen vor thermischem oder oxidativem Stress schützen. Diese Belastungen schädigen normalerweise Proteine und führen zu einer teilweisen Entfaltung und möglichen Aggregation. Durch die vorübergehende Bindung an hydrophobe Reste, die durch den Stress freigelegt werden, verhindert Hsp70, dass diese teilweise denaturierten Proteine aggregieren und sich zurückfalten. Charakteristisch für den Hitzeschock ist ein niedriger ATP-Gehalt, und die anhaltende Bindung wird als Aggregationsunterdrückung angesehen, während die Erholung vom Hitzeschock eine Substratbindung und Nukleotidzyklen beinhaltet. In einem thermophilen Anaerobier (Thermotoga maritima) zeigt Hsp70 eine redoxsensitive Bindung an Modellpeptide, was auf einen zweiten Modus der Bindungsregulation auf der Grundlage von oxidativem Stress hindeutet.

Hsp70 scheint in der Lage zu sein, sich an der Entsorgung beschädigter oder defekter Proteine zu beteiligen. Die Interaktion mit CHIP (Carboxyl-terminus of Hsp70 Interacting Protein) – einer E3-Ubiquitin-Ligase – ermöglicht es Hsp70, Proteine an die Ubiquitinierungs- und Proteolyse-Wege der Zelle weiterzuleiten.

Schließlich hemmt Hsp70 nicht nur die allgemeine Proteinintegrität, sondern auch direkt die Apoptose. Ein Kennzeichen der Apoptose ist die Freisetzung von Cytochrom c, das dann Apaf-1 und dATP/ATP zu einem Apoptosom-Komplex rekrutiert. Dieser Komplex spaltet dann Procaspase-9, wodurch Caspase-9 aktiviert wird und schließlich über die Aktivierung von Caspase-3 die Apoptose eingeleitet wird. Hsp70 hemmt diesen Prozess, indem es die Rekrutierung von Procaspase-9 an den Apaf-1/dATP/Cytochrom c-Apoptosomkomplex blockiert. Es bindet nicht direkt an die Procaspase-9-Bindungsstelle, sondern induziert wahrscheinlich eine Konformationsänderung, die die Bindung von Procaspase-9 ungünstiger macht. Hsp70 interagiert nachweislich mit dem Stresssensorprotein IRE1alpha des endoplasmatischen Retikulums und schützt so die Zellen vor ER-Stress-induzierter Apoptose. Diese Interaktion verlängerte das Spleißen der XBP-1 mRNA und induzierte dadurch die transkriptionelle Hochregulierung von Zielproteinen des gespleißten XBP-1 wie EDEM1, ERdj4 und P58IPK, wodurch die Zellen vor der Apoptose gerettet wurden. Andere Studien deuten darauf hin, dass Hsp70 bei anderen Schritten eine anti-apoptotische Rolle spielen könnte, aber nicht an der Fas-Ligand-vermittelten Apoptose beteiligt ist (wohl aber Hsp 27). Hsp70 rettet also nicht nur wichtige Bestandteile der Zelle (die Proteine), sondern auch direkt die Zelle als Ganzes. In Anbetracht der Tatsache, dass sich Stressreaktionsproteine (wie Hsp70) vor der apoptotischen Maschinerie entwickelt haben, bietet die direkte Rolle von Hsp70 bei der Hemmung der Apoptose ein interessantes evolutionäres Bild davon, wie die neuere (apoptotische) Maschinerie die frühere Maschinerie (Hsps) aufnahm und so die verbesserte Integrität der Proteine einer Zelle mit den verbesserten Überlebenschancen dieser speziellen Zelle in Einklang brachte.