Junction Melting

In einem ersten Schritt zur Bewertung der Anwendbarkeit des 3SPN.2-Modells zur Vorhersage der thermodynamischen Eigenschaften des Holliday-Übergangs, bewerten wir die Schmelzeigenschaften des Übergangs anhand von Simulationen des 3SPN.2-Modells und vergleichen sie mit unseren Absorptionsexperimenten. Wir simulieren das Schmelzen des Übergangs mittels Replika-Austausch-Molekulardynamik (REMD, siehe Methoden), um die Abtastung von teilweise geschmolzenen Zuständen zu verbessern. Eine genaue Erfassung des relativen Anteils intakter, geschmolzener und teilweise geschmolzener Verbindungskonfigurationen ist derzeit mit einer All-Atom-Darstellung nicht möglich.

Abbildung 2 zeigt den Einzelstranganteil α als eine Funktion von T über einen Bereich von Salzkonzentrationen sowohl für das 3SPN.2-Modell als auch für Absorptionsmessungen. Siehe Methoden für die Definition von α in den Simulationen. Die Ähnlichkeit zwischen den Simulationen und den Experimenten ist auffallend. Sowohl die Simulationen als auch die Experimente zeigen, dass die Schmelztemperatur mit zunehmender Salzkonzentration ansteigt und dass der Übergang zunehmend scharf oder „kooperativ“ wird. Die Daten lassen sich gut durch das Massenwirkungsgesetz oder die van’t-Hoff-Relation beschreiben46,

Schmelzeigenschaften der J34-Verbindung.

Vergleich des Einzelstranganteils α aus (a) Simulationen und (b) Experimenten. Wir passen die Daten mit Hilfe der van’t Hoff-Gleichung (Gleichung 1) an, die durch die durchgezogenen Linien angezeigt wird. Der Konvention folgend, definieren wir TM als die Temperatur, bei der α = 0,5 ist.

wobei K die Gleichgewichtskonstante für das Schmelzen der Verbindung ist, ΔH und ΔS die Enthalpie- und Entropiedifferenz zwischen der geschmolzenen und der intakten Verbindung sind, die über diesen Temperaturbereich als konstant angenommen werden, und C die Gesamtstrangkonzentration ist (die Konzentration der einzelnen Stränge ist C/4). Man beachte, dass ΔS die Schärfe des Schmelzübergangs steuert. Im Folgenden wird das Verhalten von ΔH und ΔS erörtert, die anhand von Anpassungsdaten im Bereich von 0,1<α<0,9 bestimmt werden.

Die Schmelztemperatur TM ist eine nützliche thermodynamische Metrik für die Stabilität von Verbindungen und wird allgemein als die Temperatur definiert, bei der α = 1/2 ist. Abbildung 3 zeigt die experimentellen und simulierten TM-Werte als Funktion der Salzkonzentration. Wie aus den Schmelzkurven zu erwarten, spiegeln die Simulationen die experimentelle Abhängigkeit von TM genau wider. Auch die quantitative Ähnlichkeit ist bemerkenswert. Die Simulationsergebnisse sind durchweg um 5 bis 8 K zu höheren T-Werten verschoben, was einem Unterschied von weniger als 3 % entspricht. Sowohl bei den Experimenten als auch bei den Simulationen ist die Schmelztemperatur für ≥ 200 mM nahezu unabhängig von der Salzkonzentration. Diese Unabhängigkeit hängt mit der Abschirmung elektrostatischer Wechselwirkungen bei hohen Salzkonzentrationen zusammen; dementsprechend zeigt Abb. 3 auch die Debye-Abschirmlänge, die im 3SPN.2-Modell für die Debye-Hückel-Näherung der elektrostatischen Wechselwirkungen verwendet wird. Die Abschirmlänge beträgt <6 Å bei hoher Salzkonzentration, so dass die elektrostatische Abstoßung unbedeutend ist. Die Übereinstimmung zwischen den TM-Werten des Experiments und der Simulation bestätigt die approximative Behandlung der Elektrostatik im 3SPN.2-Modell. In Anbetracht der Tatsache, dass das 3SPN.2-Modell nur parametrisiert wurde, um das Schmelzen von Duplex-B-DNA nachzuahmen, deuten die Daten zum Schmelzen der Verbindungsstellen darauf hin, dass das 3SPN.2-Modell auf die Thermodynamik komplexerer DNA-Strukturen übertragbar ist. Gleichzeitig ist dieses Ergebnis nicht völlig unerwartet, da das Schmelzen jedes Arms dem von gewöhnlicher Duplex-DNA sehr ähnlich sein sollte.

Abhängigkeit der Salzkonzentration von der Schmelztemperatur der Verbindungsstelle TM.

Bei allen Konzentrationen unterscheidet sich TM um <3% zwischen 3SPN.2 Simulationen (grüne Kreise) und Absorptionsexperimenten (rote Rauten). Die Linien sind nur als Orientierungshilfe für das Auge gedacht. Die Abbildung zeigt auch die Debye-Abschirmungslänge, die das 3SPN.2-Modell in der Debye-Hückel-Näherung für die elektrostatischen Wechselwirkungen verwendet. Das Plateau der Schmelztemperatur fällt mit einer starken Abschirmung der elektrostatischen Wechselwirkungen zusammen.

Die Anpassung der Daten unter Verwendung der van’t Hoff-Beziehung (Gleichung 1) liefert eine Schätzung der Schmelzenthalpie und -entropie. Die Werte von ΔH und ΔS aus dieser Anpassung liegen in der richtigen Größenordnung, die auf der Grundlage der von SantaLucia und Mitarbeitern47,48 ermittelten thermodynamischen Parameter zu erwarten wäre. Der Einschub in Abb. 4 zeigt, dass die Simulationen die Werte für ΔH und ΔS im Vergleich zu den Experimenten leicht überschätzen und dass ΔH nahezu linear mit ΔS variiert. Diese lineare Beziehung wird manchmal als „Ausgleichsbeziehung“ bezeichnet. Tatsächlich impliziert die van’t Hoff-Gleichung eine spezifische Beziehung zwischen ΔH und ΔS

Thermodynamik des Übergangsschmelzens.

Die Entropie ΔS und die Enthalpie ΔH des Schmelzens, die durch Anpassung der Experimente (rote Rauten) und Simulationen (grüne Kreise) an die van’t Hoff-Gleichung (Gleichung 1) erhalten wurden. Die Einfügung zeigt eine ungefähre lineare Entropie-Enthalpie-Kompensationsbeziehung. Sowohl die experimentellen als auch die simulierten Daten zeigen eine bessere Übereinstimmung mit der bei TM ausgewerteten van’t Hoff-Gleichung (Gl. 2, blaue Linie).

, die sich aus Gl. 1 ergibt, wenn bei TM α = 1/2 gesetzt wird. Abbildung 4 zeigt die Übereinstimmung mit dieser Beziehung und verdeutlicht, dass der lineare Ausgleich zwischen ΔH und ΔS nur annähernd gegeben ist; wenn die TM-Werte stärker mit der Konzentration variieren würden, wären die Abweichungen von der Linearität zwischen ΔH und ΔS deutlicher zu erkennen, während Gleichung 2 gültig bleiben sollte. Aus praktischer Sicht ist es wichtiger, dass diese Ergebnisse die Effektivität des 3SPN.2-Modells bei der Reproduktion der energetischen und thermodynamischen Eigenschaften der Verbindungen zeigen, die in enger Übereinstimmung mit den experimentellen Daten stehen.

Konformationshäufigkeiten und Struktur

Um die Fähigkeit des 3SPN.2-Modells zur Vorhersage der experimentellen Verbindungseigenschaften weiter zu prüfen, untersuchen wir die relative Population der Verbindungskonformationen. Experimentell ist bekannt, dass bei niedriger Salzkonzentration die offene, planare Form vorherrscht, während bei höherer Salzkonzentration die Verbindungsstellen gestapelte Konformationen annehmen (Abb. 1). Bei einer relativ hohen Konzentration = 50 mM und T = 298 K zeigen Experimente eine relative Häufigkeit von 23/77 % gestapelter Isoformen I/II15. Hier verwenden wir das 3SPN.2-Modell zur Untersuchung eines breiten Spektrums von Salzkonzentrationen bei T = 300 K, um das Modell zu validieren und eine Vorhersage für die allgemeine Salzkonzentrationsabhängigkeit der Kreuzungspopulationen zu treffen. Es sei darauf hingewiesen, dass wir die Wirkung von Na+ und nicht von Mg2+ untersuchen, was zu ähnlichen Ergebnissen führt16,45.

Wie Thirumalai und Mitarbeiter betonten26 , kann die Übereinstimmung zwischen einem Zeitmittelwert und dem Ensemblemittelwert (Ergodizität) für Vierfachverzweigungen aufgrund der Umwandlungsrate zwischen den Verzweigungskonformationen über recht große Beobachtungszeiträume hinweg gebrochen werden. Um die relativen Populationen der gestapelten Konformeren zu schätzen, benötigen wir daher ein großes Ensemble von Simulationen. Dementsprechend führen wir für jede Salzkonzentration 100 unabhängige Simulationen durch, jeweils ausgehend von der offenen Konfiguration, da diese Konformation schnell und zufällig entweder in iso-I oder iso-II übergeht. Jede Simulation wird für 2 μs durchgeführt, was insgesamt 200 μs an Trajektoriendaten für jede Salzkonzentration ergibt, aufgeteilt auf 100 unabhängige Proben. Dies liefert eine erste Schätzung für die relative Population jeder Konformation. Auf der Grundlage dieser Schätzung führen wir 100 weitere Simulationen mit einem Verhältnis von offenen, iso-I- oder iso-II-Anfangskonfigurationen durch, die mit der vorläufigen Populationsschätzung übereinstimmen, um zu sehen, ob unsere Ergebnisse empfindlich darauf reagieren, vom offenen Zustand auszugehen. Wir stellen fest, dass die Populationsschätzungen innerhalb unserer statistischen Unsicherheit stabil bleiben, so dass wir keine signifikanten Auswirkungen aufgrund des Starts im offenen Zustand feststellen können. Unsere Ergebnisse werden beeinträchtigt, wenn wir entweder alle iso-I- oder alle iso-II-Ausgangskonfigurationen verwenden, was auf die relativ langsame Umwandlung dieser Zustände untereinander zurückzuführen ist.

Um die Populationen der Verbindungsstellen zu bewerten, müssen wir eine Metrik finden, die genau zwischen den drei primären Verbindungsstellenkonformationen unterscheidet. In experimentellen FRET-Studien wird üblicherweise der Abstand zwischen den Enden der ausgewählten Arme (der den Inter-Duplex-Winkel definiert) zur Unterscheidung der Konformationszustände verwendet. Wir untersuchten zunächst den Inter-Duplex-Winkel, stellten jedoch fest (wie später noch erläutert wird), dass der IDA in jeder Isoform erheblich schwankt, was eine eindeutige Unterscheidung der Konformationen erschwert. Stattdessen fanden wir heraus, dass die Abstände zwischen den Basen in der Nähe des Herzstücks der Verbindung einen zuverlässigeren Indikator für die Konformation der Verbindung darstellen. Diese Abstände sollten auch experimentell zugänglich sein, indem man ein Paar fluoreszierender Nukleotid-Basenanaloga wie 6-Methyl-Isoxanthopterin (6-MI) oder 2-Aminopurin in der Nähe des Kreuzungszentrums platziert. Die unteren Felder in Abb. 1 zeigen die acht Basen im Zentrum der Verbindung in den Konformeren iso-I und iso-II sowie in der offenen Form. Im Iso-I-Konformer sind die Abstände dTT der T-Basen (auf den Strängen X und H) und die Abstände dCC der C-Basen (ebenfalls auf den Strängen X und H) viel kleiner als die Abstände dAG der A- und G-Basen (auf den Strängen B und R); im Iso-II-Konformer führt die umgekehrte Stapelung zum entgegengesetzten Verhalten der relativen Abstände. In der offenen Form sind alle diese Abstände ähnlich, aber größer als die Abstände der gestapelten Iso-I- und Iso-II-Konformer.

Daher sollten wir in der Lage sein, zwischen Iso-I- und Iso-II-Konformern einfach auf der Grundlage dieser Abstände zwischen den Basen zu unterscheiden. Um dies zu bestätigen, stellen wir in Abb. 5 die normalisierte Häufigkeitsverteilung der Interbasenabstände P(dTT ∪ dCC) und P(dAG) dar, die das Vorhandensein von zwei unterschiedlichen Peaks für alle Konzentrationen ≥50 mM zeigt. Bei P(dAG) (Abb. 5a) zeigt der Peak mit geringem Abstand die Iso-II-Konformerzustände an, während der Peak mit größerem Abstand entweder auf Iso-I- oder offene Konformationen zurückzuführen ist. Bei P(dTT ∪ dCC) (Abb. 5b) deutet der Peak bei kleinen Abständen auf Iso-I-Zustände hin, und der Peak bei größeren Abständen ist entweder auf Iso-II- oder offene Konformationen zurückzuführen. Wir nehmen einen Grenzwert von 12 Å Abstand an, dem ungefähren Ort des Minimums der Verteilungen, um Verbindungen entweder als gestapelte Iso-I- oder Iso-II-Konformer zu unterscheiden. Die Konfigurationen, die weder als Iso-I noch als Iso-II identifiziert werden, werden als offene Konformere klassifiziert. In Übereinstimmung mit der Erwartung, dass die offene Konformation bei niedriger Salzkonzentration dominiert, hat keine der beiden Verteilungen einen Peak bei geringer Trennung, so dass fast alle Konfigurationen bei niedrigem Salzgehalt mit der offenen Konformation identifiziert werden.

Kriterium für die Unterscheidung von Verbindungskonformationen.

Verteilung des Abstandes zwischen den Basen in der Mitte der Verbindung für (a) die AG-Basen, bei denen ein geringer Abstand den Iso-II-Konformer kennzeichnet, und (b) TT- oder CC-Paare, bei denen ein geringer Abstand den Iso-I-Konformer kennzeichnet. Der Peak mit größerem Abstand bei niedriger Salzkonzentration ist auf offene Konformationen zurückzuführen; bei höherer Salzkonzentration entsteht er hauptsächlich durch die komplementäre gestapelte Form. Die vertikale gepunktete Linie gibt das Abschneidekriterium an, das wir verwenden, um anschließend die Konformationszustände einzelner Konfigurationen zu identifizieren.

Anhand dieser Kriterien zur Unterscheidung von Konformeren identifizieren wir einzelne Konfigurationen mit einem der drei Isomere und zeigen in Abb. 6a repräsentative Zeitreihen von Kreuzungskonformationen für fünf Simulationen bei = 300 mM. Abbildung 7a zeigt repräsentative Konfigurationen dieser Konformeren. Die Zeitreihendaten zeigen qualitativ, dass die offene Konformation extrem kurzlebig ist und als Übergangszustand zwischen den langlebigen Iso-I- und Iso-II-Konformeren fungiert. Dies wurde bereits aus Einzelmolekülexperimenten8,15,16,50 abgeleitet, und in dieser Studie beobachten und bestätigen wir explizit den Übergangsmechanismus zwischen Gleichgewichtskonformeren. Wir weisen die Rolle der offenen Konformation als Zwischenstufe quantitativ nach, indem wir die neun Übergangswahrscheinlichkeiten (einschließlich der Übergänge in dieselbe Konformation) zwischen den drei Konformeren auswerten. Abbildung 6b zeigt, dass die Übergangswahrscheinlichkeiten für Iso I→II und II→I auf der Skala dieser Diagramme verschwindend klein sind (Null, im Rahmen der Unsicherheit unserer Berechnung). Folglich führt der einzige Weg zwischen den gestapelten Konformeren über den offenen Konformer, wodurch dieser als Übergangszustand festgelegt wird. Abbildung 6c zeigt, wie die Übergangswahrscheinlichkeiten zwischen der gestapelten und der offenen Konformation mit der Salzkonzentration variieren, wobei die Übergänge zum offenen Zustand bei niedrigen Salzkonzentrationen dominieren. Die fünf Zeitreihen in Abb. 6a zeigen auch, dass der zeitliche Durchschnitt der Daten von Probe zu Probe variiert. Es ist klar, dass 2 μs für eine ergodische Abtastung der Konformationshäufigkeiten unzureichend sind und unser Ansatz der Verwendung eines Ensembles von Simulationen erforderlich ist. Dieser Ansatz ist für das grobkörnige Modell möglich, übersteigt jedoch die derzeitigen Rechenressourcen für ein All-Atom-Modell. Diese „gebrochene Ergodizität“ ähnelt der experimentellen Feststellung, dass das Konformations-Sampling auf großen Zeitskalen nicht ergodisch ist26. Wir sollten jedoch darauf hinweisen, dass die gebrochene Ergodizität hier ausschließlich auf die stochastische Natur des Konformations-Samplings zurückzuführen ist, während in den Experimenten von Ref. 26 auch Variationen in der Bindung von Ionen an einzelne Verbindungsstellen eine Rolle spielen.

Molekül-zu-Molekül-Variationen im Konformations-Sampling und in den Konformationsübergangswahrscheinlichkeiten.

(a) Beispielhafte Zeitreihen von Verbindungskonformationen für fünf der 100 Ensemblemitglieder bei = 300 mM. Die offene Isoform ist kurzlebig und stellt einen Übergangszustand zwischen iso-I und iso-II dar. (b) Matrix der Übergangswahrscheinlichkeiten von einem bestimmten Ausgangszustand zum Endzustand bei = 300 mM. Die Übergangswahrscheinlichkeiten zum gleichen Zustand (diagonale Elemente) sind nicht dargestellt, da die Tendenz, im aktuellen Zustand zu bleiben, die Skala der anderen Übergangswahrscheinlichkeiten dominiert49. Man beachte, dass die Übergangswahrscheinlichkeiten für iso I→II (und umgekehrt) nahezu Null sind. (c) Salzkonzentrationsabhängigkeit der vier wichtigsten Übergangswahrscheinlichkeiten.

Knotenpunktkonformationen, Abundanz und Struktur.

(a) Repräsentative Konformationen, die in unseren Simulationen beobachtet wurden; der Einfachheit halber ist nur das DNA-Grundgerüst dargestellt. (b) Die relative Häufigkeit der primären Isoformen als Funktion der Salzkonzentration. Die Identität der Isoformen wird durch die Basentrennungen im Inneren der Verbindung definiert, wie im Text beschrieben. (c) Inter-Duplex-Winkel (IDA) für jede Konformation. Beachten Sie, dass die offene planare Konformation nur bei niedrigem Salzgehalt vorherrschend ist. Bei höherem Salzgehalt nimmt der kleine Anteil der offenen Konformationen (im Durchschnitt) eine tetraedrische Konformation an.

Auf der Grundlage der Zeitreihendaten für die Verbindungskonformation werten wir direkt den Anteil der Konfigurationen in den offenen, iso-I- oder iso-II-Konformationen als Funktion der Salzkonzentration aus (Abb. 7b). Wie erwartet, beobachten wir bei niedrigen Salzkonzentrationen (= 10 mM) im Wesentlichen nur den offenen planaren Zustand mit quadratischer Geometrie. Bei allen höheren Salzkonzentrationen werden die gestapelten Konformeren bevorzugt, mit durchschnittlich ≈58 % in iso-II und 36 % in iso-I (für ≥200 mM). Unsere Simulationen sagen voraus, dass der relative Anteil der Konformeren, außer bei relativ niedrigen Salzkonzentrationen, nicht wesentlich vom Salz abhängt. Die Dominanz der gestapelten Konformationen bei hohen Salzkonzentrationen kann aufgrund der starken Abschirmung durch elektrostatische Wechselwirkungen erwartet werden, ähnlich wie bei der Abhängigkeit der Schmelztemperatur von der Salzkonzentration. Dieses Screening erklärt jedoch nicht die Vorliebe für die gestapelte Iso-II-Konformation. Der Unterschied in der Isomerenpopulation muss durch Basensequenzeffekte in der Nähe des Verbindungskerns entstehen, wie experimentell beobachtet wurde16,17. Die Tatsache, dass das Modell die experimentell bekannte Tendenz zu iso-II reproduziert, zeigt, wie erfolgreich das grobkörnige Modell bei der Erfassung der sequenzabhängigen Struktur ist. Wir finden auch einen kleinen Anteil, 6 %, von Verbindungskonfigurationen im offenen Zustand bei hohem Salzgehalt. Wie bereits erwähnt, sind diese Konformationen kurzlebig und erleichtern die Umwandlung zwischen den gestapelten Konformationen. Im Vergleich zu den Experimenten von Ha und Mitarbeitern15 bei relativ hohen Salzkonzentrationen sagt das 3SPN.2-Modell den Bias in Richtung iso-II um etwa 15 % zu niedrig voraus. Der Unterschied könnte zum Teil auf die unterschiedlichen experimentellen und rechnerischen Kriterien zurückzuführen sein, die zur Definition von Isoformen verwendet werden; insbesondere untersuchen wir die Basentrennungen im Inneren der Verbindung, während die FRET-Experimente Markierungen verwenden, die auf die Trennung der Enden der R- und X-Arme der Verbindung (effektiv die IDA) empfindlich sind. Für H-ähnliche Konformationen mit einem offenen Kreuzungszentrum (experimentell in Anwesenheit von Endonukleasen beobachtet12) würden sich diese alternativen Ansätze in ihrer Klassifizierung systematisch unterscheiden: (i) basierend auf den Kreuzungsenden würden H-Konformationen als iso-I oder II klassifiziert werden; (ii) umgekehrt würden H-Konformationen basierend auf der Trennung am Kreuzungskern als offen klassifiziert werden, so dass unsere Kriterien immer eine kleinere gestapelte Fraktion ergeben werden.

Da unsere Kriterien es uns erlauben, die Konformationen einzelner Kreuzungskonfigurationen zu kategorisieren, können wir auch direkt die mittlere Struktur jeder dieser Konformationen bewerten. Wir charakterisieren die Struktur der Kreuzung durch den Inter-Duplex-Winkel (IDA), den wir durch den Winkel definieren, den die XR- und RH-Arme mit dem Kreuzungspunkt bilden51. Dementsprechend sollte der IDA für iso-II wesentlich kleiner sein als der von iso-I. Abbildung 7c bestätigt diese Erwartung, wobei sich der IDA von iso-II bei hoher Salzkonzentration 90° nähert und der IDA von iso-I nahe 140° liegt. Ein Wert von 90° für iso-II ist groß im Vergleich zu experimentellen Schätzungen, die auf der Grundlage von Gleichgewichts-FRET-Messungen41,44,45 in der Größenordnung von 40-60° liegen, worauf wir noch zurückkommen werden. Wir sollten uns auch darüber im Klaren sein, dass 90° für iso-II keine planare Konfiguration impliziert, was in den repräsentativen Konfigurationen in Abb. 7a visuell ersichtlich ist; aufgrund der dreidimensionalen Struktur kann sogar eine gestapelte Struktur einen Winkel nahe 90° annehmen. Bei den niedrigsten Salzkonzentrationen können wir den Winkel für gestapelte Konformationen nicht abschätzen, da sie im Wesentlichen nicht abgetastet werden. Bei = 10 mM beträgt der IDA der offenen Verbindung 95°, was mit einer nahezu ebenen Verbindung übereinstimmt und in Abb. 7a auch visuell erkennbar ist. Bei höheren Salzkonzentrationen nimmt der kleine Anteil der offenen Konfigurationen einen etwas größeren Winkel von ≈105° an. Dieser größere Winkel steht im Einklang mit einer nahezu tetraedrischen Konfiguration (Abb. 7a), die sich vielleicht von der planaren offenen Konfiguration bei niedriger Salzkonzentration unterscheiden sollte. Unsere Ergebnisse deuten also darauf hin, dass die Übergangszustände zwischen gestapelten Konformeren überwiegend offene tetraedrische Konformationen sind und nicht planare. Solche tetraedrischen Zwischenzustände wurden bereits in früheren Simulationen beobachtet23. Aus der Analyse von Einzelmoleküldaten wurde die Möglichkeit einer Vielzahl von Übergangskonformationen abgeleitet26.

Vergleiche von Übergangsstrukturen

Als letzten Vergleichspunkt betrachten wir, wie die IDA, die anhand des 3SPN.2-Modells ermittelt wurde, mit experimentellen Messungen und der IDA, die anhand unserer AMBER-Simulation für alle Atome geschätzt wurde, verglichen wird. FRET-Messungen haben ergeben, dass der IDA von iso-II bei T = 283 K und einer Salzkonzentration von 200 mM45 43 ± 8° beträgt. Dementsprechend simulieren wir sowohl das AMBER- als auch das 3SPN.2-Modell unter übereinstimmenden Bedingungen, ausgehend von einer anfänglichen iso-II-Konfiguration mit einem IDA von 43° (siehe Abb. 1b). Sowohl für das 3SPN.2- als auch für das AMBER-Modell öffnet sich der Übergang zu einem größeren IDA und pendelt sich nach ≈50 ns auf einen stabilen Wert ein (siehe Abb. 8). Das Hauptfeld von Abb. 8 zeigt die IDA-Werte, die von jedem Modell im stationären Zustand abgetastet wurden. Das Modell 3SPN.2 weist größere Schwankungen der IDA auf als das Modell AMBER, obwohl die mittlere IDA bei beiden Modellen ähnlich ist. Quantitativ gesehen beträgt der mittlere IDA-Wert für AMBER 85,3° mit einer Standardabweichung von 12,3°; für 3SPN.2, beträgt der mittlere IDA 95,7° mit einer Standardabweichung von 24,1°.

Vergleich der Übergangsstruktur zwischen All-Atom- und Grobkornmodellen.

Der IDA für das All-Atom-Modell AMBER (schwarz) und das 3SPN.2 grobkörniges Modell (rot) bei T= 283 K und = 200 mM. Die Haupttafel zeigt die Verteilung der abgetasteten IDA-Werte; durchgezogene Linien sind die berechnete Häufigkeit und gepunktete Linien sind eine Normalverteilung mit demselben Mittelwert und derselben Standardabweichung wie die Daten. Der Einschub zeigt die ursprünglichen Zeitreihen für jedes Modell, aus denen die Verteilungen ermittelt wurden. Beachten Sie, dass wir für das 3SPN.2-Modell 2 μs an Daten haben, die nicht alle in der Abbildung gezeigt werden.

Die Simulationen zeigen beide eine wesentlich größere IDA, als aus den FRET-Messungen und kristallographischen Studien zu erwarten war45,52. Dies könnte darauf hindeuten, dass keines der beiden Modelle eine genaue Schätzung der IDA liefert, oder dass die Näherungen, die zur Schätzung der IDA aus den FRET-Daten gemacht werden müssen, die IDA unterschätzen. Sicherlich können bei FRET-Experimenten in der Masse das Vorhandensein der externen Farbstoffe, ihre zugehörigen Linker und ihre relative Ausrichtung erhebliche Fehler in die Abstandsermittlung einbringen. Die Unterschiede zwischen den aktuellen IDA-Bestimmungen und den kristallographisch gemessenen Werten könnten möglicherweise auf Einschränkungen des Kristallgitters zurückzuführen sein. Beim Vergleich zwischen dem Allatom- und dem Grobkornmodell zeigt die annähernde Verdoppelung der Standardabweichung deutlich, dass die Verbindungsarme im Grobkornmodell flexibler sind. Dies könnte zum Teil auf das Fehlen eines expliziten Lösungsmittels zurückzuführen sein, da das solvatisierende Wasser in der All-Atom-Darstellung zwangsläufig die Flexibilität der Verbindungsarme behindert.