Hereditäres nichtpolypöses kolorektales Karzinom (HNPCC) ist eine genetisch heterogene Erkrankung, die durch Keimbahnmutationen in einem von mehreren MMR-Genen verursacht wird (Jiricny, 1998a,b), obwohl es derzeit Hinweise darauf gibt, dass Keimbahnmutationen in hMSH2 und hMLH1 für die Mehrzahl der HNPCC-Fälle verantwortlich sind (Peltomäki und Vasen, 1997). Träger des HNPCC-Gens erben eine Mutation in einem der Allele, die für ein MMR-Gen kodieren, und die zweite Kopie wird mutiert oder geht als ein frühes Ereignis in der Entwicklung eines Tumors verloren. Dieses zweite Ereignis führt dazu, dass die Zellen keine DNA-Mismatch-Reparatur (MMR) mehr durchführen können, was vermutlich zu der raschen Anhäufung von Mutationen führt, die die Tumorentwicklung vorantreibt. Was genau die Ursache für die Veranlagung zu Darmkrebs bei HNPCC-Patienten ist, muss noch geklärt werden. Es hat sich gezeigt, dass eine genaue Zusammenstellung der menschlichen MMR-Komplexe für eine effiziente MMR unerlässlich ist, um die genomische Integrität zu erhalten (Drummond et al., 1997). Diese Daten deuten darauf hin, dass je nach Art der Mutation in den MMR-Genen und der Expression dieser Gene die Zusammensetzung und damit die Aktivität der DNA-Reparaturkomplexe bei HNPCC-Patienten unterschiedlich ist. Auch die Beteiligung von zumindest hMLH1 und hMSH2 an anderen zellulären Prozessen, wie der DNA-Rekombination und der Regulierung des Zellzyklus-Checkpoints (Jiricny, 1998a,b), die die Stabilität des Genoms steuern, kann durch Mutationen in den hMLH1- und hMSH2-Genen beeinträchtigt werden. Daher können die Tumorentwicklung und der Krankheitsverlauf in verschiedenen HNPCC-Familien unterschiedlich sein (Jäger et al., 1997). Die Bedeutung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in den Reparaturkomplexen wird durch die Erkenntnisse gestützt, dass hMSH2 im Komplex mit entweder hMSH6 (hMutSα) oder hMSH3 (hMutSβ) und das hMLH1-Protein im Komplex mit entweder hPMS2 (hMutLα), hPMS1 (hMutLβ) oder hMLH3 vorliegt (Drummond et al., 1995; Li und Modrich, 1995; Lipkin et al., 2000; Palombo et al., 1995; Papadopoulos et al., 1995; Räschle et al., 1999). Es wurde auch gezeigt, dass das hMSH2-Protein mit der menschlichen Exonuklease 1 (hEXO1) interagiert (Rasmussen et al., 2000; Schmutte et al., 1998). Es ist zwar nicht bekannt, ob hEXO1 an der MMR beteiligt ist, aber Hefestämme, denen es an Exonuklease-1-Aktivität mangelt, zeigen erhöhte Spontanmutationsraten und einen geringen Anstieg der Rekombination, wenn das Heteroduplex-Zwischenprodukt Basenfehlanpassungen oder kleine Schleifen enthält (Nicholson et al., 2000; Tischkoff et al., 1997, 1998). Es ist bekannt, dass sowohl Exonuklease 1 (EXO1) als auch MMR-Proteine an der homologen Rekombination beteiligt sind (Fiorentini et al., 1997; Saparbaev et al., 1996; Sugawara et al., 1997) und dass EXO1 in der Hefe eine Rolle bei der Reparatur von Doppelstrangbrüchen und beim meiotischen Crossing Over spielt (Tsubouchi und Ogawa, 2000).

Viele Studien zu HNPCC haben sich auf die Identifizierung von Mutationen in den Genen hMLH1 und hMSH2 konzentriert. Die Mutationsanalyse dieser Gene gibt jedoch keinen Aufschluss über die molekularen und biochemischen Defekte, die dieser Krankheit zugrunde liegen. Um den Zusammenhang zwischen dem Funktionsverlust des hMLH1-Gens und HNPCC besser zu verstehen, haben wir spezifische Protein-Protein-Interaktionen der hMutLα- und hMLH1-hEXO1-Komplexe charakterisiert und dabei mutierte Formen von hMLH1 verwendet, die bei HNPCC-Patienten gefunden wurden. Zur Untersuchung solcher Protein-Protein-Wechselwirkungen in vivo bzw. in vitro verwendeten wir das Hefe-Two-Hybrid-System sowie einen Glutathion-S-Transferase (GST)-Fusionsinteraktionstest (Pull-Down).

Das hMLH1-Protein existiert überwiegend in einem Komplex mit hPMS2, der auch als hMutLα-Heterodimer bekannt ist (Li und Modrich, 1995). Die Bildung eines hMutLα-Komplexes ist für die MMR-Aktivität unerlässlich (Baker et al., 1995, 1996; Edelmann et al., 1996), so dass die Unfähigkeit der HNPCC-hMLH1-Proteine, einen Komplex mit hPMS2 zu bilden, zu einer ineffizienten MMR-Aktivität bei HNPCC-Patienten führen könnte. Um die mögliche Ursache für HNPCC zu erforschen, haben wir untersucht, ob drei hMLH1-Mutanten, die bei dänischen HNPCC-Patienten identifiziert wurden (Abbildung 1), mit hPMS2 interagieren können. Bei den Mutationen handelte es sich um eine Threonin-zu-Methionin-Fehlmutation an Codon 117 (T117M) von hMLH1 und zwei neue HNPCC-Mutationen, eine Nonsense-Mutation (CAG zu TAG) an Codon 426 (Q426X) und eine Frame-Shift-Mutation (Insertion von A am Nukleotid 1813), die zu einem vorzeitigen Stopp an Codon 609 (1813insA) führt (Abbildung 1). Der Pull-down-Assay mit rekombinanten GST-markierten HNPCC-Proteinen und in vitro transkribiertem und translatiertem (IVTT) hPMS2 ergab erwartungsgemäß die Bildung eines Komplexes zwischen hMLH1 und hPMS2 (Abbildung 2a, Spuren 5 und 10). Außerdem konnten wir die Bildung eines Komplexes zwischen HNPCC-hMLH1 (T117M) und hPMS2 nachweisen (Abbildung 2a, Spur 11). Obwohl wir festgestellt haben, dass das HNPCC-hMLH1 (T117M)-Protein in eukaryotischen NIH3T3-Zellen exprimiert wird (Daten nicht gezeigt), konnten wir die Interaktion mit hPMS2 im Hefe-Zwei-Hybrid-Assay nicht reproduzieren (Abbildung 3a). Eine Erklärung für diese Diskrepanz könnte die dreifach reduzierte Komplexbildung zwischen hPMS2 und dem HNPCC-hMLH1 (T117M)-Mutantenprotein im Vergleich zu den hPMS2- und hMLH1-Proteinen sein, die mit einem Phosphoimager quantifiziert wurde (Daten nicht gezeigt) (Abbildung 2a, Spuren 10 und 11). Im Gegensatz dazu wurden Komplexbildungen zwischen den hMLH1-Proteinabkürzungen, HNPCC-hMLH1 (Q426X) und HNPCC-hMLH1 (1813insA), und hPMS2 in keinem der Assays nachgewiesen (Abbildung 2a, Spuren 12 und 13 und Abbildung 3a). Eine schwache Bande in der Pull-down-Reaktion, die HNPCC-hMLH1 (1813insA) und hPMS2 enthielt, war sichtbar (Abbildung 2a, Spur 13), aber die Intensität war ähnlich wie die Bande, die in der Reaktion erhalten wurde, die nur hPMS2-Protein enthielt (Abbildung 2a, Spur 3), und es ist daher unwahrscheinlich, dass sie einen echten Komplex zwischen HNPCC-hMLH1 (1813insA) und hPMS2 darstellt.

(a) Sequenzalignment der MutL-Familie. hMLH1: humanes MutL-Homolog hMLH1, yMLH1: Saccharomyces cerevisiae MutL-Homolog MLH1, MutL: Escherichia coli MutL. Konservierte Reste sind in Fettdruck dargestellt. Die Sequenzausrichtung wurde mit ClustalW Multiple Sequence Alignment durchgeführt. (b) Strukturen der Proteine hPMS2, hMLH1, HNPCC-hMLH1 (T117M), HNPCC-hMLH1 (Q426X), HNPCC-hMLH1 (1813insA), hEXO1a/HEX1, hEXO1b, hEXO1a/HEX1-N-terminal, hEXO1a/HEX1-C-terminal und hEXO1b-C-terminal (Y5). Drei dänische Familien, bei denen HNPCC diagnostiziert wurde, wurden über das dänische HNPCC-Register identifiziert. Zwei neue HNPCC-Mutationen, eine Nonsense-Mutation (CAG zu TAG) am Codon 426 (Q426X) und eine Frame-Shift-Mutation (Insertion von A am Nukleotid 1813), die zu einem vorzeitigen Stopp am Codon 609 (1813insA) von hMLH1 führt, wurden in Familien identifiziert, die die Kriterien von Amsterdam erfüllten. Die dritte Mutation, eine Threonin-zu-Methionin-Missense-Mutation an Codon 117 (T117M) von hMLH1, wurde bereits beschrieben (www.nfdht.nl/database/mlh1-4.htm). Die hMLH1-Kodierungsregion wurde in die EcoRI-Stelle von pcDNA3 kloniert und als Vorlage für die Primer-vermittelte Mutagenese verwendet, um die drei verschiedenen HNPCC-Mutationen in hMLH1, T117M, Q426X und 1813insA, zu konstruieren. Die DNA-Sequenz aller synthetischen Mutationen und PCR-amplifizierten Fragmente wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Die anderen in dieser Studie verwendeten Konstrukte sind hPMS2 (cDNA in voller Länge), HEX1-N (1355 bp N-terminale Region von HEX1/hEXO1a), HEX1-C (1182 bp C-terminale Region von HEX1/hEXO1a) und hEXO1b-C (Y5) (1952 bp C-terminale Region von hEXO1b). Alle hEXO1-Konstrukte sind ausführlich beschrieben in Rasmussen et al., 2000)

GST-Fusionsprotein-Assay zur Untersuchung der Interaktion zwischen hMLH1-Proteinen und hEXO1b oder hPMS2. (a) Spur 1, markiertes IVTT-hPMS2-Protein; Spur 2, +GST-Beads; Spur 3, +BL21-Lysat; Spur 4, +gereinigtes GST-Protein; Spur 5, +gereinigtes GST-hMLH1-Protein; Spur 6, gereinigtes GST-hMLH1-Protein und markierter IVTT-Vektor; Spur 7, gereinigtes GST-HNPCC-hMLH1 (T117M) Protein und markierter IVTT-Vektor; Spur 8, gereinigtes GST-HNPCC-hMLH1 (Q426X) Protein und markierter IVTT-Vektor; Spur 9, gereinigtes GST-HNPCC-hMLH1 (1813insA)-Protein und markierter IVTT-Vektor; Spur 10, gereinigtes GST-hMLH1-Protein und markiertes IVTT-hPMS2-Protein; Spur 11, gereinigtes GST-HNPCC-hMLH1 (T117M)-Protein und markiertes IVTT-hPMS2-Protein; Spur 12, gereinigtes GST-HNPCC-hMLH1 (Q426X) Protein und markiertes IVTT hPMS2 Protein; und Spur 13, gereinigtes GST-HNPCC-hMLH1 (1813insA) Protein und markiertes IVTT hPMS2 Protein. (b) Spur 1, IVTT hEXO1b-Protein; Spur 2, +GST-Beads; Spur 3, +BL21-Lysat; Spur 4, +gereinigtes GST-Protein; Spur 5, +gereinigtes GST-hMLH1-Protein; Spur 6, gereinigtes GST-hMLH1-Protein und markierter IVTT-Vektor; Spur 7, gereinigtes GST-hMSH2-Protein und markiertes IVTT hEXO1b-Protein; Spur 8, gereinigtes GST-hMLH1-Protein und markiertes IVTT hEXO1b-Protein; Spur 9, gereinigtes GST-HNPCC-hMLH1 (T117M) Protein und markiertes IVTT hEXO1b-Protein; Spur 10, gereinigtes GST-HNPCC-hMLH1 (Q426X) Protein und markiertes IVTT hEXO1b Protein; und Spur 11, gereinigtes GST-HNPCC-hMLH1 (1813insA) Protein und markiertes IVTT hEXO1b Protein. Alle In-vitro-Transkriptions-Translationsreaktionen wurden mit dem TNT-gekoppelten Retikulozyten-Lysat-System (Promega) durchgeführt. Kurz gesagt, wurden die Lysate mit 1 μg DNA, einem Aminosäuremix ohne Cystein, 35S-Cystein und T9-RNA-Polymerase für 90 Minuten bei 30°C gemäß den Anweisungen des Herstellers inkubiert. Der pGEX-Vektor (Pharmacia-Amersham) wurde für die Konstruktion von GST-hMLH1, GST-hMLH1 (T117M), GST-hMLH1 (Q426X), GST-hMLH1 (1813insA) und GST-hMSH2 verwendet. Alle pGEX-Konstrukte sind N-terminale GST-Fusionsproteine. Die DNA-Sequenzierung der gesamten kodierenden Region bestätigte alle Konstrukte. Die Fusionsproteine wurden wie von Guerrette et al. (1998) beschrieben gereinigt, mit Ausnahme der Verwendung von nicht-induzierten E. coli Kulturen. Die Pull-down-Assays wurden wie von Guerrette et al. (1998) beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Proteine 2 Stunden lang bei 30°C inkubiert wurden, bevor die Reaktionsgemische auf die Gele geladen wurden

Interaktion von hMLH1, HNPCC-hMLH1 (T117M), HNPCC-hMLH1 (Q426X) und HNPCC-hMLH1 (1813insA) mit hPMS2 oder hEXO1 im Hefe-Zwei-Hybrid-System. (a) Die β-Galactosidase-Aktivität, angegeben in Miller-Einheiten, wurde wie in Rasmussen et al. (2000) beschrieben bestimmt. (b) und (c) Stämme, die verschiedene Plasmide enthalten, wurden auf SD-LEU-TRP+X-gal-Platten ausgestreut. Die in den getesteten Stämmen enthaltenen Plasmide sind oben in jeder Spalte und links in jeder Zeile angegeben. AD: Aktivierungsdomäne, BD: Bindungsdomäne. Die Hefe-Two-Hybrid-Vektoren pAS2-1, pBRIDGE und pACT2 (CLONTECH) wurden für die Konstruktion von GAL4-Fusionsproteinen verwendet. Die Hefe-Two-Hybrid-Versuche wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt (Rasmussen et al., 2000). Kurz gesagt wurden die kodierenden Regionen von hMLH1 oder HNPCC-hMLH1 durch PCR amplifiziert und in die EcoRI- und BamHI-Stellen von pBRIDGE oder die NcoI- und BamHI-Stellen von pACT2 kloniert. hPMS2 wurde durch PCR unter Verwendung von pREP4-hPMS2 (Risinger et al., 1998) als Vorlage amplifiziert und in die NdeI- und BamHI-Stellen von pAS2-1 und die SmaI- und EcoRI-Stellen von pACT2 kloniert. Alle anderen Plasmide sind in Rasmussen et al. (2000) beschrieben. Keines der Plasmide zeigte irgendeine Wechselwirkung mit den Zwei-Hybrid-Vektoren ohne Insert

Ebenso wurde zuvor durch Deletionsmutagenese gezeigt, dass die Interaktion zwischen hMLH1 und hPMS2 durch den C-terminalen Teil von hMLH1 (Aminosäuren 506-756) und den C-terminalen Teil von hPMS2 (Aminosäuren 675-850) vermittelt wird (Abbildung 1b) (Guerrette et al., 1999). Die HNPCC-hMLH1 (T117M)-Mutation wurde in neun nicht verwandten HNPCC-Familien aus verschiedenen Teilen der Welt gefunden (www.nfdht.nl/database/mlh1-4.htm und Daten nicht gezeigt), was darauf hindeutet, dass es sich bei der Mutation nicht um einen verknüpften Polymorphismus handelt, wie bereits bei Hefe gezeigt (Shcherbakova und Kunkel, 1999; Shimodaira et al., 1998). Die HNPCC-hMLH1 (T117M)-Mutation liegt an einer konservierten Sequenz (Abbildung 1), von der angenommen wird, dass sie direkt an der Bindung und/oder Hydrolyse von ATP beteiligt ist (Ban et al., 1999). Die HNPCC-hMLH1 (T117M) Missense-Mutation könnte also die MMR-Aktivität inaktivieren, indem sie die Fähigkeit dieses mutierten Proteins zur Bindung und/oder Hydrolyse von ATP und damit die Komplexbildung mit anderen MMR-Proteinen verändert. In Übereinstimmung mit dieser Hypothese zeigen wir, dass HNPCC-Individuen, die die Mutationen HNPCC-hMLH1 (T117M), HNPCC-hMLH1 (Q426X) und HNPCC-hMLH1 (1813insA) tragen, in der hMutLα-Heterodimerbildung beeinträchtigt sind, was zu einem Defekt der MMR-Aktivität führt, wenn das zweite hMLH1-Allel verloren geht oder inaktiviert wird.

In einem Versuch, gewebespezifische MMR-assoziierte Faktoren zu identifizieren, haben wir und andere kürzlich eine menschliche Exonuklease identifiziert, die mit hMSH2 interagiert (Rasmussen et al., 2000; Schmutte et al., 1998; Tishkoff et al., 1998; Wilson III et al., 1998). Wir konnten zeigen, dass hMSH2 mit beiden Formen von hEXO1, hEXO1b und hEXO1a/HEX1, interagiert und dass diese Interaktion durch ihre C-terminalen Domänen vermittelt wird. Im Gegensatz dazu konnten wir im Two-Hybrid-System keine Interaktion zwischen hMSH6 und hEXO1 feststellen (Rasmussen et al., 2000). Es ist nicht bekannt, ob hEXO1 eine Rolle in der MMR spielt oder ob seine Interaktion mit hMSH2 für die Rekombination wichtig ist. Wir zeigen, dass das hMLH1-Protein wie hMSH2 mit beiden Formen von hEXO1 (hEXO1b und hEXO1a/HEX1) interagiert und dass diese Interaktion durch die C-terminalen Domänen der Exonukleasen vermittelt wird (Abbildung 2b, Spuren 5 und 8 und Abbildung 3). Wir konnten keine Interaktion zwischen hPMS2 und hEXO1 nachweisen (Abbildung 3a,c). Unsere vorläufigen Daten deuten darauf hin, dass die Anwesenheit von hMLH1- und hPMS2-Proteinen die Bindung von hEXO1 an hMLH1 nicht verhindert (Daten nicht gezeigt). Daher glauben wir nicht, dass die hMutLα-Bildung notwendigerweise die Bindung von hEXO1 an hMLH1 blockiert. Zur weiteren Charakterisierung der hMLH1-hEXO1-Interaktion konstruierten wir fluoreszierende Proteinfusionen von hMLH1 und hEXO1 und schleusten sie in NIH3T3-Zellen ein (Abbildung 4). Unsere Ergebnisse zeigen, dass CFP-hMLH1 hauptsächlich im Zellkern vorkommt, wir aber auch einen Teil dieses Proteins im Zytoplasma nachweisen können (Abbildung 4, Tafel 1). Im Gegensatz dazu können wir YFP-hEXO1 nur im Zellkern nachweisen (Abbildung 4, Tafel 2). Nach Cotransfektion mit YFP-hEXO1 war CFP-hMLH1 jedoch vollständig nukleär (Abbildung 4, Felder 3 und 4).

Nukleäre Lokalisierung von CFP-hMLH1 und YFP-hEXO1b Fusionsproteinen. Am Tag der Behandlung wurden murine NIH3T3-Zellen transient mit 3,5 μg CFP-hMLH1 (Feld 1) oder YFP-hEXO1b (Feld 2) oder beiden Konstrukten (Felder 3 und 4) transfiziert. Die Zellen wurden über Nacht inkubiert, und am nächsten Tag wurde die subzelluläre Lokalisierung der Fusionsproteine mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie untersucht. Die transfizierten Zellen sind außerdem in dem entsprechenden Nomarski-Bild dargestellt. Die hMLH1 cDNA wurde in die EcoRI- und BamHI-Stellen des pECFP-C2-Vektors (CLONTECH) und die hEXO1b cDNA in die BamHI- und SalI-Stellen des pEYFP-C1-Vektors (CLONTECH) kloniert. Bei beiden fluoreszierenden Proteinkonstrukten handelt es sich um N-terminale Fusionen

Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass mindestens zwei MMR-Proteine, nämlich hMSH2 und hMLH1, mit der menschlichen Exonuklease 1 interagieren, während zwei andere MMR-Proteine, hPMS2 und hMSH6, nicht direkt an der Interaktion mit hEXO1 beteiligt sind, wenn sie im In-vivo-Zwei-Hybrid-Assay untersucht werden.

Um zu untersuchen, ob die Wechselwirkungen zwischen hMLH1 und hEXO1 bei HNPCC-Patienten beeinträchtigt sein könnten, wurde die Assoziation der drei oben beschriebenen hMLH1-Mutantenproteine mit hEXO1 charakterisiert. Eine positive Interaktion wurde nur zwischen HNPCC-hMLH1 (T117M) und dem hEXO1b-Protein in voller Länge über den in vitro Pull-Down-Assay nachgewiesen (Abbildung 2b, Spur 9). Mit dem In-vivo-Zwei-Hybrid-Assay konnten jedoch keine Protein-Protein-Interaktionen zwischen den HNPCC-hMLH1-Proteinen und den getesteten Exonuklease-1-Konstrukten nachgewiesen werden (Abbildung 3). Wir waren nicht in der Lage, die Interaktion zwischen hEXO1 in voller Länge, das mit der GAL4-Aktivierungsdomäne fusioniert ist, und den hMLH1-Proteinen zu untersuchen, da diese Konstrukte im Hefe-Two-Hybrid-Assay nicht funktionsfähig sind (Rasmussen et al., 2000). In ähnlicher Weise haben wir festgestellt, dass die hMLH1- und hMLH1-Derivate, die mit der GAL4-Aktivierungsdomäne fusioniert sind, zu Fusionsproteinen führen, die im Two-Hybrid-Assay nicht funktionsfähig sind (Abbildung 3 und nicht gezeigte Daten).

Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass drei neuartige HNPCC-hMLH1-Mutationen, von denen bekannt ist, dass sie mit der Krebsanfälligkeit von HNPCC-Patienten einhergehen, zu einem Defekt beim Zusammenbau des hMutLα-Heterodimers führen, der zu einer verminderten MMR-Aktivität führen könnte. In ähnlicher Weise sind die mutierten HNPCC-hMLH1-Proteine auch nicht in der Lage, mit dem neu identifizierten hEXO1-Protein zu interagieren, einem Protein, das nun mit hMLH1 und hMSH2, aber nicht mit hMSH6 und hPMS2 zu interagieren scheint. Derzeit sind die genauen biologischen Wege und der Gesamtbeitrag dieser dokumentierten Interaktionen noch unklar, vor allem weil hMLH1 sowohl bei der MMR als auch bei der Rekombination eine Rolle spielt. Die Entschlüsselung der molekularen Defekte bei HNPCC durch Testen der pathogenen MMR-Proteine in funktionellen Assays zur Quantifizierung der Interaktionen in den Proteinkomplexen sollte zusammen mit Mutationsscreening, Immunhistochemie und Mikrosatellitenanalyse dazu beitragen, Strategien zur Diagnose und Behandlung von HNPCC-Trägern zu entwickeln.