Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) und High Performance Liquid Chromatography (HPLC): zwei flüssigchromatographische Methoden im direkten Vergleich. In diesem Artikel werden die Unterschiede zwischen den beiden Techniken erörtert, wobei der Schwerpunkt auf den Anforderungen der jeweiligen Analyten liegt.
Die Namen Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) und High Performance Liquid Chromatography (HPLC) geben einen Hinweis auf die Unterschiede zwischen diesen chromatographischen Methoden. Während HPLC mit hohem Druck arbeitet, um kleine chemische Verbindungen zu analysieren, reinigt FPLC große Biomoleküle wie Proteine oder DNA. Die Chromatographie von Biomolekülen ist sehr anspruchsvoll und empfindlich, da sie weder hohe Temperaturen noch hohen Druck oder die in der HPLC üblichen Lösungsmittel vertragen. Aus diesen Gründen erfordert die Trennung von Biomolekülen einen alternativen Ansatz zur HPLC.
Für die schnelle Protein-Flüssigchromatographie sind verschiedene Begriffe gebräuchlich, wie Biochromatographie, Bioseparation oder Biopurifikation. Diese spezielle Form der Chromatographie wird zur Aufreinigung großer Biomoleküle von mehreren Kilodalton (kDa) wie Proteine, Nukleotide oder Peptide eingesetzt (Abbildung 1). Das Ziel des FPLC-Anwenders ist es, ein möglichst reines und natives Produkt zu erhalten. Das Ziel der klassischen HPLC hingegen ist die Identifizierung und Qualifizierung von Analyten, in der Regel kleinen Verbindungen mit einer Größe von wenigen Atomen bis zu etwa 3000 Da.
Die Herausforderung, ein reines Protein aus einem Zellextrakt zu gewinnen
Typischerweise werden Biomoleküle aus bakteriellen oder eukaryotischen Zellen gereinigt, die voller Proteine, DNA, RNA und Zellmembranen sind. Daher kann die Aufreinigung des gewünschten Proteins aus einem Zellextrakt sehr schwierig sein. Biochemiker wenden mehrere Tricks an: Einer besteht darin, rekombinante Proteine zu verwenden, die von den Zellen überexprimiert werden. Die Überexpression des gewünschten Proteins ermöglicht die Aufreinigung in größeren Mengen. Der zweite Trick besteht darin, das gewünschte Protein mit einer Markierung zu versehen, die von dem Harz (Säulenmaterial) spezifisch erkannt wird. Proteine ohne Tag binden nicht an die Säule und eluieren sofort, während das gewünschte Protein angereichert wird und leicht abgetrennt werden kann.
Biomoleküle werden aus zellulären Lysaten gereinigt, was viel größere Probenvolumina bedeutet als bei der analytischen HPLC. Daher werden zum Einspritzen der Probe größere Probenschleifen oder sogar Pumpen mit höheren Flussraten verwendet. Außerdem unterscheiden sich die Materialien von FPLC- und HPLC-Säulen völlig. Für die HPLC werden Siliziumdioxidkügelchen mit sehr kleinen Teilchengrößen und hoher Druckbeständigkeit verwendet, während für die FPLC bei den meisten Methoden Agarose oder Polymermaterial mit größeren Teilchengrößen erforderlich ist. Die für die FPLC verwendeten Harze sind nicht so druckstabil wie Kieselgelperlen und sehr empfindlich gegenüber Luftblasen. Außerdem unterscheidet sich nicht nur das Säulenmaterial, sondern auch die Säulenhardware. In der klassischen HPLC werden druckstabile Edelstahlsäulen verwendet. Wie bereits erwähnt, spielt die Druckstabilität bei der FPLC keine Rolle, so dass man mit transparenten und biokompatiblen Glassäulen arbeiten kann. Dies ist ein großer Vorteil, da der Benutzer die Säule auf Luftblasen überprüfen oder den Zustand des Materials während eines Reinigungslaufs überwachen kann.
Vielfältige Biomoleküle, vielfältige Aufreinigungsmethoden
Die Unterschiede im Säulenmaterial spiegeln sich auch in den Methoden wider. Bei der analytischen HPLC ist die Umkehrphasenchromatographie mit hydrophoben stationären Phasen und polaren mobilen Phasen die Methode der Wahl, während bei der FPLC eine größere Vielfalt an Methoden zum Einsatz kommt (Abbildung 2). Eine FPLC-Methode ist die Größenausschlusschromatographie (SEC), bei der die Moleküle entsprechend ihrer Größe getrennt werden. Kleinere Moleküle können in die Poren der Kügelchen diffundieren, während größere Moleküle die Säule fast ohne Rückhaltung passieren. Die kleineren Moleküle eluieren später von der Säule, wodurch ein Gradient dieser Moleküle entsprechend ihrer Größe entsteht. Ein weiterer Trennungsansatz ist die Ionenaustauschchromatographie. Biomoleküle werden entsprechend ihrer spezifischen Ladung, die vom pH-Wert des Puffers abhängt, getrennt und gereinigt. Je höher die Ladung des Proteins ist, desto besser bindet es an das entgegengesetzt geladene Harz. Um das Protein von der Säule zu eluieren, wird die Konzentration der Salzionen während des Laufs erhöht. Die Salzionen konkurrieren mit dem Protein um die Bindung an das Harz. Eine weitere wichtige FPLC-Methode ist die Affinitätschromatographie, bei der das gewünschte Molekül spezifisch an die Säule binden kann, während die anderen Moleküle dies nicht können und ohne Bindung eluieren. Hier werden Säulen mit speziellen Medien verwendet, die das gewünschte Biomolekül erkennen. Eine besondere Form der Affinitätschromatographie ist die immobilisierte Metallionenaffinität (IMAC). Das gewünschte Protein muss gentechnisch verändert werden, indem es mit einer Markierung versehen wird, die normalerweise aus sechs Histidinen besteht. Das IMAC-Harz erkennt diesen „Hisâtag“ spezifisch. Die Elution erfolgt durch Erhöhung der Imidazol-Konzentration, die mit den His-markierten Proteinen konkurriert. Darüber hinaus können die Proteine auch durch ihre spezifische Hydrophobie getrennt werden, indem die Methode der hydrophoben Wechselwirkung angewendet wird. Das Harz ist so zusammengesetzt, dass die hydrophobsten Proteine am stärksten an die Säule binden und durch Absenken des Salzgradienten eluiert werden.
Um ein gewünschtes Protein zu reinigen, wird in der Regel eine Kombination von Methoden eingesetzt. Im ersten Schritt, dem sogenannten „Capture“-Schritt, wird das Protein aus dem Rohextrakt aufgereinigt. In der Regel wird für diesen ersten Schritt der Reinigung die Affinitätschromatographie verwendet. Im zweiten Schritt, dem „Zwischenschritt“, werden weitere Verunreinigungen durch Ionenaustauschchromatographie oder hydrophobe Wechselwirkung entfernt. Ziel des abschließenden „Polishing“-Schrittes – in der Regel ein Größenausschlusschromatographie-Schritt – ist es, alle verbleibenden Verunreinigungen zu beseitigen, um ein hochreines Produkt zu erhalten. Diese Proteinreinigungsstrategie hängt ganz von dem jeweiligen Biomolekül ab. In manchen FÃ?llen kann eine zweistufige Aufreinigung ausreichen. Je mehr Methoden kombiniert werden, desto mehr des gewünschten Proteins geht während der Reinigung verloren, aber es kann eine höhere Reinheit erreicht werden.
Nach der Reinigung kann die gewonnene Probe mittels HPLC, Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE), Enzymaktivitätstests oder Massenspektrometrie auf Reinheit, Konzentration und Enzymfunktion oder -aktivität untersucht werden.
FPLC-Anforderungen
Proteine bestehen aus Aminosäuren, die als Kette aufgereiht sind. Diese Kette ist zu einer dreidimensionalen Struktur gefaltet, die der Schlüssel zur Funktion und Aktivität eines jeden Proteins ist. Daher ist es sehr wichtig, diese Proteinstruktur während des Reinigungsprozesses zu erhalten. Äußere Faktoren wie hohe Temperatur, hoher Druck, extremer pH-Wert oder Lösungsmittel können die Proteinstruktur stören und werden daher bei der FPLC vermieden. Die Arbeitstemperatur für Proteine liegt normalerweise bei 4 °C. Aus diesem Grund wird eine FPLC-Maschine häufig in einer Kältekammer oder einem Kühlraum aufgestellt, wo sie nicht nur niedrigen Temperaturen, sondern auch kondensierender Feuchtigkeit ausgesetzt ist. Die Komponenten eines FPLC-Systems müssen speziell für diese Bedingungen ausgelegt sein. Darüber hinaus sind die FPLC-Komponenten mit einer zusätzlichen Herausforderung konfrontiert, nämlich mit salzhaltigen Pufferlösungen, die als Eluenten verwendet werden. In der Regel werden ein isosmotischer pH-Wert und Salzkonzentrationen gewählt, die der Zellumgebung ähnlich sind. Chromatographiesysteme sind in der Regel aus rostfreiem Stahl gefertigt. Zum einen kann das Salz in den Puffern zu Korrosion führen, zum anderen können die Metallionen aus dem Edelstahl mit dem Protein interferieren und dessen Struktur stören. Daher ist es wichtig, Edelstahl zu vermeiden und bei der FPLC biokompatibles Material wie Polyetheretherketon (PEEK), Keramik oder Titan zu verwenden. Wie die HPLC-Systeme werden auch die FPLC-Systeme durch Software gesteuert. Es gibt erhebliche Unterschiede zwischen FPLC- und HPLC-Software. Letztere wird hauptsächlich für die Analyse der Proben verwendet und enthält eine Vielzahl von Analysewerkzeugen. Bei der FPLC hingegen sind nicht viele Analysewerkzeuge erforderlich, und es ist üblich, Methoden auf der Grundlage des Volumens oder sogar des Säulenvolumens zu erstellen (Abbildung 3). Für die meisten FPLC-Anwendungen werden Methoden auf der Grundlage des Säulenvolumens bevorzugt, was die Hochskalierung erleichtert. FPLC-Software ist meist sehr intuitiv und benutzerfreundlich und umfasst eine direkte Kontrolle, die eine Anpassung der Parameter während eines Laufs ermöglicht. Dadurch kann der Anwender sehr spontan auf verschiedene Situationen reagieren.
Es ist also klar, dass es große Unterschiede zwischen diesen beiden chromatographischen Bereichen gibt (Tabelle 1). Methoden, Hardware und Software unterscheiden sich stark, je nachdem, ob das Molekül analysiert oder gereinigt werden soll. Bei FPLC-Anwendungen sind die Empfindlichkeit der Proben und das Bestreben, sie so nativ wie möglich zu halten, eine zusätzliche Herausforderung. Insgesamt sind beide Techniken hochinteressante Bereiche, die jeder, der auf diesem Gebiet arbeitet, kennen sollte.
Stephanie Runde schloss ihr Studium der Biochemie an der Technischen Universität München mit einem Diplom ab. Sie promovierte an der Freien Universität Berlin und arbeitet derzeit bei der Knauer Wissenschaftliche Geräte GmbH als Produktmanagerin für FPLC.