FRAP kann auch zur Überwachung von Proteinen außerhalb der Membran verwendet werden. Nachdem das Protein von Interesse fluoreszierend gemacht wurde, im Allgemeinen durch Expression als GFP-Fusionsprotein, wird ein konfokales Mikroskop verwendet, um einen Bereich des Zytoplasmas, der mitotischen Spindel, des Zellkerns oder einer anderen zellulären Struktur zu photobleichen und zu überwachen. Die mittlere Fluoreszenz in der Region kann dann gegen die Zeit seit dem Photobleaching aufgetragen werden, und aus der resultierenden Kurve lassen sich kinetische Koeffizienten ableiten, z. B. für die Bindungsreaktionen des Proteins und/oder den Diffusionskoeffizienten des Proteins in dem Medium, in dem es überwacht wird. Häufig wird nur die Dynamik der Diffusion und der Bindungs-/Entbindungs-Wechselwirkungen berücksichtigt, aber im Prinzip können sich Proteine auch durch Strömung bewegen, d. h., Dies könnte auf den Fluss des Zytoplasmas oder des Nukleoplasmas oder auf den Transport entlang von Filamenten in der Zelle, wie z. B. Mikrotubuli, durch molekulare Motoren zurückzuführen sein.

Die Analyse ist am einfachsten, wenn die Wiederherstellung der Fluoreszenz entweder durch die Diffusionsrate in den gebleichten Bereich oder durch die Rate, mit der gebleichte Proteine sich von ihren Bindungsstellen innerhalb des gebleichten Bereichs lösen und durch fluoreszierendes Protein ersetzt werden, begrenzt ist. Betrachten wir diese beiden Grenzen für den allgemeinen Fall des Bleichens eines GFP-Fusionsproteins in einer lebenden Zelle.

Diffusionsbegrenzte FluoreszenzwiederherstellungBearbeiten

Für einen kreisförmigen Bleichfleck mit Radius w {\displaystyle w}

und diffusionsdominierter Erholung wird die Fluoreszenz durch eine von Soumpasis abgeleitete Gleichung beschrieben (die modifizierte Besselfunktionen I 0 {\displaystyle I_{0}}

und I 1 {\displaystyle I_{1}}

) f ( t ) = e – 2 τ D / t ( I 0 ( 2 τ D / t ) + I 1 ( 2 τ D / t ) ) {\displaystyle f(t)=e^{-2\tau _{D}/t}\left(I_{0}(2\tau _{D}/t)+I_{1}(2\tau _{D}/t)\right)}

mit τ D {\displaystyle \tau _{D}}

die charakteristische Zeitskala für die Diffusion, und t {\displaystyle t}

ist die Zeit. f ( t ) {\displaystyle f(t)}

ist die normalisierte Fluoreszenz (geht zu 1, wenn t {\displaystyle t}

gegen unendlich geht). Die Diffusionszeitskala für einen gebleichten Fleck mit dem Radius w {\displaystyle w}

ist τ D = w 2 / ( 4 D ) {\displaystyle \tau _{D}=w^{2}/(4D)}

, wobei D der Diffusionskoeffizient ist.

Beachte, dass dies für eine sofortige Bleiche mit einem Stufenfunktionsprofil gilt, d.h. der Anteil f b {\displaystyle f_{b}}

des Proteins, von dem angenommen wird, dass es zum Zeitpunkt t = 0 {\displaystyle t=0} sofort gebleicht wird

ist f b ( r ) = b , r < w {\displaystyle f_{b}(r)=b,~~r<w}

, und f b ( r ) = 0 , r > w {\displaystyle f_{b}(r)=0,~~r>w}

, für r {\displaystyle r}

die Entfernung vom Zentrum des gebleichten Bereichs ist. Es wird auch angenommen, dass die Erholung durch Diffusion in zwei Dimensionen modelliert werden kann, die ebenfalls gleichmäßig und isotrop ist. Mit anderen Worten, die Diffusion findet in einem gleichförmigen Medium statt, so dass die effektive Diffusionskonstante D überall gleich ist, und die Diffusion ist isotrop, d. h. sie erfolgt entlang aller Achsen in der Ebene mit der gleichen Geschwindigkeit.

In der Praxis wird in einer Zelle keine dieser Annahmen strikt zutreffen.

1. Die Ausbleichung wird nicht sofort erfolgen. Insbesondere wenn eine starke Ausbleichung eines großen Bereichs erforderlich ist, kann die Ausbleichung einen erheblichen Teil der Diffusionszeitskala τ D {\displaystyle \tau _{D}}
   

   . Dann diffundiert ein erheblicher Teil des gebleichten Proteins tatsächlich während des Bleichens aus der gebleichten Region heraus. Wenn dies nicht berücksichtigt wird, führt dies zu einem erheblichen Fehler in D.

2. Das gebleichte Profil ist keine radiale Stufenfunktion. Wenn der gebleichte Fleck tatsächlich ein einzelnes Pixel ist, wird das Bleichen als Funktion der Position typischerweise beugungsbegrenzt sein und durch die Optik des verwendeten konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops bestimmt. Dies ist keine radiale Stufenfunktion und variiert auch entlang der Achse senkrecht zur Ebene.
3. Zellen sind natürlich dreidimensional und nicht zweidimensional, wie auch das gebleichte Volumen. Die Vernachlässigung der Diffusion aus der Ebene (wir nehmen die xy-Ebene an) ist nur dann eine vernünftige Annäherung, wenn sich die Fluoreszenz überwiegend durch Diffusion in dieser Ebene erholt. Dies ist z. B. der Fall, wenn ein zylindrisches Volumen gebleicht wird, dessen Achse entlang der z-Achse verläuft, und wenn dieses zylindrische Volumen die gesamte Höhe der Zelle durchläuft. Dann führt die Diffusion entlang der z-Achse nicht zu einer Fluoreszenzerholung, da das gesamte Protein gleichmäßig entlang der z-Achse gebleicht wird, so dass eine Vernachlässigung dieser Diffusion, wie in der Gleichung von Soumpasis, unschädlich ist. Wenn jedoch die Diffusion entlang der z-Achse zur Fluoreszenzerholung beiträgt, muss sie berücksichtigt werden.
4. Es gibt keinen Grund zu erwarten, dass das Zytoplasma oder das Nukleoplasma einer Zelle räumlich völlig einheitlich oder isotrop ist.

Die Gleichung der Soumpasis ist also nur eine nützliche Annäherung, die verwendet werden kann, wenn die oben aufgeführten Annahmen gute Annäherungen an die tatsächliche Situation sind und wenn die Wiederherstellung der Fluoreszenz tatsächlich durch die Zeitskala der Diffusion τ D {\displaystyle \tau _{D}} begrenzt ist.

. Man beachte, dass nur weil die Soumpasis adäquat an die Daten angepasst werden kann, dies nicht notwendigerweise bedeutet, dass die Annahmen wahr sind und dass die Diffusion die Erholung dominiert.

Reaktionsbegrenzte ErholungBearbeiten

Die Gleichung, die die Fluoreszenz als Funktion der Zeit beschreibt, ist in einer anderen Grenze besonders einfach. Wenn eine große Anzahl von Proteinen an Stellen in einem kleinen Volumen bindet, so dass dort das Fluoreszenzsignal durch das Signal von gebundenen Proteinen dominiert wird, und wenn diese Bindung alle in einem einzigen Zustand mit einer Off-Rate koff erfolgt, dann ist die Fluoreszenz als Funktion der Zeit gegeben durch

f ( t ) = 1 – e – k off t {\displaystyle f(t)=1-e^{-k_{\text{off}}t}

Beachten Sie, dass die Erholung nur von der Geschwindigkeitskonstante für die Entbindung, koff, abhängt. Sie hängt nicht von der Bindungsrate ab. Obwohl sie von einer Reihe von Annahmen abhängt

1. Die on-Rate muss ausreichend groß sein, damit die lokale Konzentration des gebundenen Proteins die lokale Konzentration des freien Proteins bei weitem übersteigt, so dass wir den Beitrag des freien Proteins zu f vernachlässigen können.
2. Die Reaktion ist eine einfache bimolekulare Reaktion, bei der das Protein an lokalisierte Stellen bindet, die sich während der Erholung nicht nennenswert bewegen
3. Austausch ist viel langsamer als Diffusion (oder welcher Transportmechanismus auch immer für die Mobilität verantwortlich ist), denn nur dann erholt sich die diffundierende Fraktion schnell und fungiert dann als Quelle für fluoreszierendes Protein, das das gebundene gebleichte Protein bindet und ersetzt und so die Fluoreszenz erhöht. Da r der Radius des gebleichten Flecks ist, bedeutet dies, dass die Gleichung nur gültig ist, wenn die gebundene Lebensdauer 1 / k off >> r 2 / D {\displaystyle 1/k_{\text{off}}>>r^{2}/D}
   

   .

Wenn alle diese Annahmen erfüllt sind, dann ergibt die Anpassung einer Exponentialkurve an die Erholungskurve die Off-Rate-Konstante, koff. Die Anpassung einer Exponentialkurve bedeutet also nicht unbedingt, dass die Erholung von einer einfachen bimolekularen Reaktion dominiert wird. Eine Möglichkeit zur Unterscheidung zwischen einer Wiederherstellung, deren Geschwindigkeit durch die Bindungslosigkeit bestimmt wird, und einer Wiederherstellung, die durch Diffusion begrenzt ist, besteht darin, festzustellen, dass die Wiederherstellungsgeschwindigkeit für die bindungslose Wiederherstellung unabhängig von der Größe des gebleichten Bereichs r ist, während sie mit r – 2 {\displaystyle r^{-2}}

, für die diffusionsbegrenzte Wiederherstellung. Wenn also eine kleine und eine große Fläche gebleicht werden, sind die Wiederherstellungsraten für die beiden gebleachten Flächen gleich, wenn die Wiederherstellung durch Entbindung begrenzt ist, während sie für die größere gebleichte Fläche viel langsamer ist, wenn die Wiederherstellung durch Diffusion begrenzt ist.

Diffusion und ReaktionBearbeiten

Im Allgemeinen wird die Wiederherstellung der Fluoreszenz weder durch einfache isotrope Diffusion noch durch eine einzige einfache Bindungslösungsrate dominiert. Es gibt sowohl Diffusion als auch Bindung, und die Diffusionskonstante ist möglicherweise nicht einheitlich im Raum, und es kann mehr als eine Art von Bindungsstellen geben, und diese Stellen können auch eine ungleichmäßige Verteilung im Raum haben. Auch Strömungsprozesse können eine Rolle spielen. Dieses komplexere Verhalten impliziert, dass ein Modell mit mehreren Parametern erforderlich ist, um die Daten zu beschreiben; Modelle mit nur einer einzigen Diffusionskonstante D oder einer einzigen Off-Rate-Konstante, koff, sind unzureichend.

Es gibt Modelle, die sowohl Diffusion als auch Reaktion beinhalten. Leider kann eine einzelne FRAP-Kurve nicht ausreichen, um die (möglicherweise verrauschten) experimentellen Daten zuverlässig und eindeutig anzupassen. Sadegh Zadeh et al. haben gezeigt, dass FRAP-Kurven durch verschiedene Wertepaare der Diffusionskonstante und der On-Rate-Konstante angepasst werden können, oder mit anderen Worten, dass Anpassungen an die FRAP nicht eindeutig sind. Dies ist bei Anpassungen mit drei Parametern (On-Rate-Konstante, Off-Rate-Konstante und Diffusionskonstante) der Fall. Anpassungen, die nicht eindeutig sind, sind im Allgemeinen nicht brauchbar.

Bei Modellen mit einer Reihe von Parametern kann ein einziges FRAP-Experiment unzureichend sein, um alle Modellparameter zu schätzen. Dann sind weitere Daten erforderlich, z. B. durch Bleichen von Bereichen unterschiedlicher Größe, unabhängige Bestimmung einiger Modellparameter usw.