Bakterielle Isolierung und RdFucI-Identifizierung

Eine Kolonie, die in einem Medium wuchs, das L-Fucoidan aus Laminaria Japonica (Carbosynth, Compton, Berkshire, UK) als einzige Kohlenstoffquelle enthielt, wurde aus einem Abalone-Darm isoliert, der in Südkorea geerntet wurde (Additional file 1: Fig. S1). Ein Vergleich der Sequenzidentität auf der Basis der 16S ribosomalen RNA mit der NCBI-Datenbank ergab, dass das Isolat phylogenetisch den Mitgliedern der Gattung Raoultella nahe steht (Additional file 1: Fig. S1). Daher wurde der isolierte Stamm als Raoultella sp. KDH14 identifiziert. Nach Durchführung einer vollständigen Genomsequenzierung wurde RdFucI aus Raoultella sp. KDH14 auf der Grundlage der Gensequenzidentität identifiziert.

RdFucI besteht aus 595 Aminosäuren mit einer Molekularmasse von 65,5 kDa und einem isoelektrischen Punkt von 5,5. Die BLAST-Ergebnisse zeigten eine hohe Sequenzidentität von RdFucI (> 90%) mit anderen l-FucIs aus verschiedenen Bakterien der Familien Raoultella, Klebsiella und Citrobacter.

Das identifizierte RdFucI wurde in E. coli BL21(DE3) mit dem N-terminalen Hexa-Histidin-Tag überproduziert und durch his-Tag-Affinitätschromatographie aufgereinigt. Bei der Analyse durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) erschien die einzelne Bande bei etwa 65 kDa, was mit der berechneten Molekülmasse der monomeren Untereinheit übereinstimmt.

Die von RdFucI katalysierte Reaktion begünstigt die Bildung von l-Fucose

Um die Isomerase-Aktivität von RdFucI zu untersuchen, wurde die Enzymreaktion mit l-Fucose oder l-Fuculose als Substrat durchgeführt (Abb. 2). Die Enzymaktivitäten für die Vorwärts- (l-Fucose zu l-Fuculose) und Rückwärtsreaktion (l-Fuculose zu l-Fucose) wurden bestimmt. Die Produktion von l-Fuculose aus l-Fucose wurde durch Dünnschichtchromatographie (TLC) und Gaschromatographie/Massenspektrometrie-Analyse (GC/MS) bestätigt (Additional file 2: Fig. S2). Bei der Umwandlung zwischen l-Fucose und l-Fuculose wurde kein Nebenprodukt beobachtet, was bedeutet, dass ein Substrat ein Produkt ergibt (Additional file 2: Fig. S2). Daher halten wir es für sinnvoll, die berechnete Menge an l-Fuculosekonzentration durch experimentelle Messung der l-Fucosemenge zu verwenden.

Enzymatische Umwandlung von a l-Fucose zu l-Fuculose (Vorwärtsreaktion) und b l-Fuculose zu l-Fucose (Rückwärtsreaktion) durch RdFucI. Die enzymatische Reaktion wurde mit 3 µg RdFucI mit entweder a l-Fucose oder b l-Fucose bei 10 mM als Ausgangssubstrat bei 30 °C für 10 min in 20 mM Natriumphosphat (pH 7,0) in Gegenwart von 1 mM Mn2+ durchgeführt. Die l-Fucose-Konzentration wurde experimentell gemessen und die l-Fucose-Konzentration wurde durch Subtraktion der experimentell bestimmten l-Fucose-Konzentration von der Gesamtzuckerkonzentration (10 mM) berechnet. Die experimentellen Daten stellen Mittelwerte ± Standardabweichungen von drei Wiederholungen dar

Die Rückreaktion war 6,6-mal schneller als die Vorwärtsreaktion, und die spezifische Aktivität für l-Fuculose (63,9 U/mg) war höher als die für l-Fucose (9,6 U/mg). Bei beiden Reaktionen betrug das Gleichgewichtsverhältnis zwischen l-Fucose und l-Fuculose, das experimentell bestimmt wurde, etwa 9:1, woraus sich die Gleichgewichtskonstante (Keq) von 0,11 ergibt. Der Wert von Keq wurde auch theoretisch mit 0,23 bestimmt, und zwar auf der Grundlage der thermodynamischen Beziehung zwischen der Standardänderung der freien Gibbs-Energie der Reaktion und Keq im Gleichgewicht, \(\mathop \Delta \limits_{r} G^{ \circ } = – RT\ln K_{\text{eq}}), wobei R und T die Gaskonstante (8,314 J/mol K) bzw. die Temperatur (K) darstellen. \(\mathop \Delta \limits_{r} G^{ \circ }\) steht für die Standardänderung der freien Gibbs-Energie für die Reaktion von l-Fucose zu l-Fuculose (0,859993 kcal/mol), die in der Datenbank BioCyc (https://biocyc.org) aufgeführt ist. Es gab eine gewisse Diskrepanz zwischen den experimentellen und theoretischen Werten von Keq. Ein Keq < 1 zeigt an, dass die umgekehrte Reaktion bevorzugt wird. Die von RdFucI katalysierte Isomerisierung begünstigte die umgekehrte Reaktion und erzeugte bei 30 °C und pH 7 L-Fucose mit einer Ausbeute von etwa 90 %.

Auswirkung von Temperatur und pH auf die Aktivität von RdFucI und das Gleichgewicht

Enzymatische Reaktionen wurden bei verschiedenen Temperaturen von 10 bis 80 °C und pH-Werten von 4 bis 11 unter Verwendung von L-Fuculose als Substrat durchgeführt (Abb. 3). Die Isomerisierung von l-Fuculose zu l-Fucose durch RdFucI war stark temperaturabhängig, und maximale oder nahezu maximale Aktivitäten (> 80 % des Maximums) wurden bei Temperaturen zwischen 30 und 50 °C beobachtet (Abb. 3a). Um die Auswirkung der Temperatur auf das Gleichgewicht für die Isomerisierung von L-Fucose zu L-Fuculose zu untersuchen, wurde das Gleichgewichtsverhältnis bei 30, 40 und 50 °C untersucht, bei denen maximale oder nahezu maximale Aktivitäten (> 80 % des Maximums) gezeigt wurden. Das Ergebnis war, dass es keinen signifikanten Unterschied im Gleichgewichtsverhältnis zwischen den drei Temperaturen gab (l-Fucose/l-Fuculose = 9:1; p > 0,05). Mit anderen Worten, l-Fucose wurde bei allen getesteten Temperaturen mit einer Ausbeute von etwa 90% aus l-Fucose synthetisiert (Additional file 3: Fig. S3a).

Auswirkung von a Temperatur und b pH-Wert auf die relative Aktivität von RdFucI gegenüber l-Fucose. Die enzymatischen Reaktionen wurden a bei verschiedenen Temperaturen von 10 bis 80 °C und b bei verschiedenen pH-Werten von 4 bis 11 durchgeführt. Die verwendeten Puffer waren 50 mM Natriumacetat (pH 4, 5 und 6), 50 mM Natriumphosphat (pH 6, 7 und 8), 50 mM Tris-HCl (pH 7, 8 und 9) und 50 mM Glycin-NaOH (9, 10 und 11). Die experimentellen Daten stellen Mittelwerte ± Standardabweichungen von drei Wiederholungen dar

Die Wirkung des pH-Wertes wurde untersucht. Hohe Aktivitäten von RdFucI (> 70% des Maximums) wurden bei alkalischen und nahezu neutralen pH-Werten (pH 9, 10 und 11 sowie pH 6, 7 und 8) beobachtet. Unterhalb von pH 6 nahm die Enzymaktivität stark ab, und bei pH 4 wurde nur eine geringe Aktivität beobachtet. Trotz der hohen spezifischen Aktivitäten bei alkalischen Bedingungen war die L-Fucose-Ausbeute bei Gleichgewicht (60 Minuten Inkubation) bei pH 10 (54 %) viel geringer als bei pH 7 (88 %) (Additional file 3: Abb. S3b). Die relativen Aktivitäten bei pH 7, 8 und 9 waren in Tris-HCl-Puffer viel geringer als die Aktivitäten in Natriumacetat- oder Glycin-NaOH-Puffer, was bedeutet, dass Tris die enzymatische Aktivität von RdFucI stark hemmt. Die vorangegangenen Enzymexperimente in dieser Studie wurden in Reaktionsgemischen durchgeführt, die 1 mM Tris enthielten, das aus dem Pufferwechselschritt nach der Enzymreinigung stammte. Um zu untersuchen, ob Tris im Reaktionsgemisch RdFucI hemmen könnte, wurden die Isomerisierungsaktivitäten aus den Reaktionen in Abwesenheit und Anwesenheit von 1 mM Tris verglichen (Additional file 4: Fig. S4). Es zeigte sich kein signifikanter Unterschied in den Enzymaktivitäten der beiden Reaktionen, was darauf hindeutet, dass 1 mM Tris die Aktivität von RdFucI nicht hemmt.

Wirkung von Metallionen auf die Aktivität von RdFucI

Zuckerisomerasen, einschließlich L-Fucose-Isomerasen, benötigen zweiwertige Kationen, wie Mn2+ und Co2+, als Cofaktoren für ihre Isomerisierungsaktivitäten. Um die Auswirkung von zweiwertigen Kationen auf die katalytische Aktivität von RdFucI auf L-Fuculose zu untersuchen, wurde die Enzymaktivität in Abwesenheit und Anwesenheit von entweder 1 mM verschiedener Metallionen oder Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) untersucht (Tabelle 1). Das native RdFucI-Enzym, das weder Metallionen noch EDTA ausgesetzt war, zeigte eine geringe Aktivität, und die Metallchelierung durch EDTA verringerte die Enzymaktivität. Unter den getesteten Metallionen führten Mn2+, Mg2+, Co2+, Cd2+ und Zn2+ zu einem deutlichen Anstieg der Enzymaktivität. Insbesondere die Zugabe von Mn2+ erhöhte die Aktivität von RdFucI maximal um das 7,4-fache. Im Gegensatz dazu hemmten Ca2+, Cu2+ und Fe3+ die Aktivität von RdFucI.

Substratspezifität und kinetische Parameter von RdFucI

Im Allgemeinen zeigen Zucker- und Zuckerphosphat-Isomerasen eine breite Spezifität gegenüber verschiedenen Substraten. Um festzustellen, ob die bei L-Fucose gezeigte ketosebegünstigende Aktivität von RdFucI auch bei anderen Substraten zu beobachten ist, wurde die Substratspezifität von RdFucI gegenüber verschiedenen Aldose-Zuckern (L-Fucose, D-Arabinose, D-Altrose, D-Galactose, D-Mannose und D-Glucose) und ihren entsprechenden Ketose-Zuckern (L-Fuculose, D-Ribulose, D-Psicose, D-Tagatose und D-Fructose) untersucht (Abb. 4). Von all diesen Substraten, einschließlich Aldose und Ketose, wurden die höchsten Aktivitäten bei L-Fuculose (115,3 U/mg) und D-Ribulose (127,3 U/mg), beides Ketosezucker, beobachtet. Die Aktivitäten von RdFucI für l-Fuculose und d-Ribulose waren viel höher als die für die anderen Substrate. Unter den Aldose-Zuckern war die Aktivität für L-Fucose die höchste (21,0 U/mg), während die anderen Substrate spezifische Aktivitäten zwischen 4,7 und 7,9 U/mg erzeugten. Andere Ketosezucker als L-Fuculose und d-Ribulose zeigten spezifische Aktivitäten von 0,0 bis 10,8 U/mg. Somit waren l-Fuculose und d-Ribulose die bevorzugten Substrate für RdFucI, und die Ketose-begünstigende Aktivität von RdFucI wurde nur mit l-Fuculose und d-Ribulose nachgewiesen.

Substratspezifität von RdFucI. Die Enzymreaktionen wurden gegen 10 mM verschiedener Aldose- und Ketose-Substrate bei 40 °C und pH 10 durchgeführt. Als Aldose-Substrate wurden L-Fucose, D-Arabinose, D-Aaltrose, D-Galactose, D-Mannose und D-Glucose verwendet. Für Ketosesubstrate wurden L-Fuculose, D-Ribulose, D-Picose, D-Tagatose und D-Fructose verwendet. Die experimentellen Daten stellen Mittelwerte ± Standardabweichungen von drei Wiederholungen dar

Kinetische Parameter wurden unter Verwendung von L-Fuculose und D-Ribulose als Substrate bestimmt (Additional file 5: Table S1). Die Werte von Km (Michaelis-Konstante) und kcat (Umsatzzahl des Substrats) für l-Fuculose waren 1,9- bzw. 1,2-fach niedriger als die für d-Ribulose. Die katalytische Effizienz von RdFucI, dargestellt als kcat/Km, für l-Fuculose war 1,5-fach höher als die von d-Ribulose, was darauf hindeutet, dass l-Fuculose als Substrat von RdFucI bevorzugt wird.

Gesamtkristallstruktur von RdFucI

Um die molekulare Funktion besser zu verstehen, haben wir die Kristallstruktur von RdFucI bestimmt (Zusatzdatei 6: Tabelle S2). Die Elektronendichtekarte von RdFucI war von den Resten Ser5-Arg591 für sechs Untereinheiten in der asymmetrischen Einheit gut definiert. Das Monomer RdFucI besteht aus 19 α-Helices und 23 β-Strängen, die N1-, N2- und C-Domänen umfassen (Abb. 5a). Die N1-Domäne (Ser5-Met172) nimmt eine α/β-Faltung an und ist an der Substraterkennung der hexameren Bildung von RdFucI beteiligt. Die N2- (Lys173-Leu352) und C-Domänen (Thr353-Arg591) enthalten die metallbindenden Reste, die an der katalytischen Aktivität beteiligt sind (Abb. 5a). In der asymmetrischen Einheit bilden die RdFucI-Untereinheiten eine hexamere Formation, die als Dimer von Trimeren mit D3h-Pseudosymmetrie angeordnet ist (Abb. 5b). Dies stimmt mit dem Ergebnis der analytischen Größenausschlusschromatographie überein, bei der sich RdFucI in Lösung als Homohexamer erwies (Additional file 7: Fig. S5).

Gesamtstruktur von RdFucI. a Cartoon-Darstellung des RdFucI-Monomers. Das RdFucI-Monomer besteht aus N1- (gelb), N2- (rosa) und C- (grün) Domänen. b Oberflächendarstellung des RdFucI-Hexamers. Die Untereinheiten A, B, C, D, E und F sind gelb, rosa, cyan, lila, grün bzw. orange gefärbt. Eine Metallbindungsstelle an einer Substratbindungstasche ist durch einen roten Punkt gekennzeichnet

In der hexameren Formation interagiert die Untereinheit A (Gesamtoberfläche: 23011.7 Å2) mit vier verschiedenen Untereinheiten B (Reste in der Schnittstelle: 47/vergrabene Oberfläche: 1909,6 Å2), C (58/1837,6 Å2), D (42/1482,9 Å2) und E (34/1086,2 Å2) interagieren. Die Untereinheit A interagiert nicht mit der übrigen Untereinheit F (Abb. 5b). Die Untereinheit A von RdFucI hat eine vergrabene Oberfläche von insgesamt 2569,1 Å2, was 27,45 % der Gesamtoberfläche entspricht. Diese vergrabene Schnittstelle wird durch Interaktionen mit 59 Wasserstoffbrücken und 26 Salzbrücken von anderen Untereinheiten stabilisiert (Zusätzliche Datei 8: Tabelle S3, Zusätzliche Datei 9: Tabelle S4, Zusätzliche Datei 10: Tabelle S5, Zusätzliche Datei 11: Tabelle S6).

Substratbindungsstelle und aktives Zentrum von RdFucI

Die Substratbindungstasche wird von den N2- und C-Domänen der Untereinheit A und der N1-Domäne der Untereinheit B gebildet (Abb. 6a-c) und hat insgesamt sechs Substratbindungsstellen im homohexameren RdFucI. Der Eingang der Substratbindungstasche, an dem das Substrat ankommt, ist etwa 11 × 12,5 Å groß (Abb. 6a). Die Substratbindungstasche, in der die Metallbindungsstelle gebildet wird, hat eine negativ geladene Oberfläche von etwa 4 × 5 Å (Abb. 6b). Der Abstand zwischen der Metallbindungsstelle und der Oberfläche der Substratbindungstasche beträgt etwa 16,7 Å (Abb. 6d), was bedeutet, dass sich das aktive Zentrum tief in einer Tasche befindet. Dies deutet darauf hin, dass sowohl die offene Kette als auch die Ringform des Substrats für das Zentrum der aktiven Stelle zugänglich sind und dass umgekehrt ein massives Saccharid für die aktive Stelle, die sich im Inneren der Substratbindungstasche befindet, nicht zugänglich wäre.

Substratbindungstasche und aktives Zentrum von RdFucI. a Die Substratbindungstasche wird durch Zusammenbau der Untereinheiten A und C gebildet. b Elektrostatische Oberfläche der Substratbindungstasche. c Darstellung des B-Faktors der Substratbindungsoberfläche. d Oberflächenschnitt durch die Substratbindetasche. e 2Fo-F-Elektronendichtekarte (graues Netz, Kontur bei 1,0 σ) der Metallbindungsstellen von RdFucI, die in eine 10 mM Mn2+ enthaltende Lösung getaucht wurden. f Geometrische Analyse der Mn2+-Bindungsstellen von RdFucI

RdFucI benötigt zweiwertige Metallionen für seine katalytische Aktivität bei der Isomerisierungsreaktion nach dem En-Diol-Mechanismus. Die Metallbindungsstelle von RdFucI sollte durch konservierte Glu337-, Asp359- und His528-Reste mit Mn2+ koordiniert werden (Additional file 12: Fig. S6). Es gibt jedoch keine Fo-Fc-Elektronendichtekarte (gezählt bei > 5σ), von der vermutet wird, dass sie an Mn2+ als essentielles Metall für die Substratbindung gebunden ist (Additional file 13: Abb. S7a). Die Analyse des B-Faktors ergab, dass der Temperaturfaktor von Mn2+ (70,53 Å2) höher ist als der durchschnittliche Temperaturfaktor des Proteins (36.22 Å2), was darauf hindeutet, dass Mn2+ auf RdFucI mit einer geringen Belegung vorhanden ist. Dieser Befund stimmt mit dem Ergebnis der biochemischen Analyse überein, bei der das native Enzym eine geringe Aktivität aufwies. Andererseits erhöhte die Zugabe von Mn2+ die katalytische Aktivität von RdFucI erheblich (Tabelle 1). Wir vermuteten daher, dass die Zugabe von Mn2+ zum RdFucI-Kristall die Bindungsaktivität von Mn2+ erhöhen würde. Nach dem Einweichen der RdFucI-Kristalle in einer Lösung von 10 mM Mn2+ wurde eine zuverlässige Fo-Fc-Elektronendichte (> 6σ) an der Metallbindungsstelle beobachtet, bei der die Position von Mn2+ in allen Untereinheiten geklärt war (Abb. 6e und Zusatzdatei 13: Abb. S7b). Der Temperatur-B-Faktor des Mn2+ (76,56 Å2) war jedoch höher als der des gesamten Proteins (60,69 Å2), was bedeutet, dass das Mn2+-Ion in der Metallbindungsstelle noch nicht vollständig besetzt ist. Mn2+ wurde von den Atomen OE1 (durchschnittlicher Abstand: 2,62 Å) und OE2 (2,65 Å) von Glu337, OD1 (2,72 Å) und OD2 (2,72 Å) von Asp361, NE2 (2,52 Å) von His528 und dem Wassermolekül (2,79 Å) koordiniert (Abb. 6e). Die durchschnittlichen Bindungswinkel von Glu337(OE1)-Mn2+-Asp361(OD2), Glu337(OE1)-Mn2+-His528(NE2) und Asp361(OD1)-Mn2+-His528(NE2) betrugen 127,32°, 86,25° bzw. 73,96°. Der Bindungswinkel zwischen Liganden und Mn2+ zeigte eine verzerrte oktaedrische Koordination.

Strukturvergleich mit anderen l-FucIs

Der DALI-Server wurde für die Suche nach strukturellen Homologen verwendet. Diese Suche ergab, dass RdFucI den l-FucIs aus E. coli (EcFucI, PDB-Code 1FUI, Z-Score: 60.6, rmsd: 0.3 für 587 Cαs-Atome), Aeribacillus pallidus (ApFucI, 3A9R, Z-Score: 56.6, rmsd: 0,7 für 580 Cαs-Atome), und Streptococcus pneumonia (SpFucI, 4C20, Z-Score: 55,9, rmsd: 0,7 für 585 Cαs-Atome). Die Überlagerung der Substratbindungstasche zeigte, dass die metallbindenden Reste Glu337, Asp361 und His528 (nummeriert in RdFucI) positionsmäßig mit den anderen Proteinen identisch sind, während die Substraterkennungsreste (Arg16, W88, Gln300, Tyr437, Trp496 und Asn524) einen leichten Konformationsunterschied in ihren Seitenketten aufweisen (Abb. 7a). Insbesondere die α7-α8-Schleife jedes l-FucI, die auf der Oberfläche der Substratbindungstasche liegt, weist eine andere Konformation auf. Das Sequenzalignment der l-FucIs zeigte eine hohe Ähnlichkeit, aber die Sequenz der α7-α8-Schleife jedes l-FucIs war sehr variabel (Abb. 7b). Da die α7-α8-Schleife an der Bildung der Architektur der Substratbindungstasche beteiligt ist, bildet jeder l-FucI eine einzigartige Substratbindungstasche (Abb. 7c). l-FucIs haben in der Regel eine negativ geladene Oberfläche um die Metallbindungsstelle, aber die Oberfläche der Substratbindungstasche weist unterschiedliche Ladungszustände auf (Abb. 7c). Infolgedessen werden die strukturellen Unterschiede der α7-α8-Schleife zu Unterschieden in der Substratspezifität von l-FucIs führen.

Struktureller Vergleich von RdFucI mit anderen l-FucIs. Überlagerung von a Aktivzentrum und b Substratbindungsfläche von RdFucI mit EcFucI (PDB-Code: 1FUI), ApFucI (3A9R) und SpFucI (4C20). Nahaufnahme des großen Konformationsunterschieds der α8-α9-Schleifen von l-FucIs (links). c Teilweises Sequenz-Alignment für die α8-α9-Schleifenregion für RdFucI und EcFucI, ApFucI und SpFucI. d Elektrostatische Oberflächendarstellung von RdFucI, EcFucI, ApFucI und SpFucI. Die tiefe Substratbindungstasche und die α8-α9-Schleifenregionen sind durch orangefarbene bzw. schwarze Punktlinien gekennzeichnet. Eine Metallbindungsstelle ist durch ein gelbes Sternchen gekennzeichnet