DDRGK1 ist für die ER-Homöostase erforderlich

Um die zelluläre Funktion von DDRGK1 zu verstehen, untersuchten wir die Auswirkungen des DDRGK1-Knockdowns mit einer Mischung aus zwei siRNAs, wie zuvor beschrieben21. Wir fanden heraus, dass der Knockdown von DDRGK1 sowohl bei MCF7- als auch bei HepG2-Zellen einen apoptotischen Zelltod auslöste, der durch Annexin V/PI-Färbung (Abb. 1a), Caspase-3-Aktivierung und PARP-Spaltung (Abb. 1b) gekennzeichnet war. Es ist anzumerken, dass wir die durch Knockdown von DDRGK1 induzierte Caspase-3-Spaltung in HepG2-Zellen nachweisen können, nicht aber in MCF7-Zellen, da MCF7-Zellen Caspase-3-defizient sind22. Quantitative Echtzeit-PCR-Analysen zeigten, dass der Knockdown von DDRGK1 die Expression der pro-apoptotischen Gene BAX, BAK, NOXA, DR5 und Bid erhöhte, während die Expression des anti-apoptotischen Gens Bcl-2 verringert wurde (Abb. 1c,d). Wichtig ist, dass wir festgestellt haben, dass der Knockdown von DDRGK1 in MCF7- und HepG2-Zellen ER-Stress-Reaktionen auslöst, mit erhöhter ER-Stress-spezifischer Genexpression von BiP, HSPA8 und CHOP (Abb. 1e,f).

(a) MCF7- und HepG2-Zellen wurden entweder mit Kontroll-siRNA oder mit siRNA, die auf DDRGK1 abzielt, 72 Stunden lang transfiziert. Die Zellen wurden anschließend mit Annexin V und PI angefärbt und einer durchflusszytometrischen Analyse mit anschließender Quantifizierung der apoptotischen Zellen (Annexin V+) unterzogen. (b) Western-Blot-Analyse von PARP und gespaltener Caspase-3 in Kontroll- und DDRGK1-Knockdown-MCF7- und HepG2-Zellen wie in a beschrieben. (c,d) Q-PCR-Analyse der relativen mRNA-Expressionswerte von BAX, BAK, NOXA, Bid, DR-5 und Bcl-2 in Kontroll- und DDRGK1-Knockdown-MCF7- und HepG2-Zellen. (e,f) Q-PCR-Analyse der relativen mRNA-Expressionswerte von BiP, HSPA8 und CHOP in Kontroll- und DDRGK1-Knockdown-MCF7- und HepG2-Zellen. Alle Daten sind als Mittelwerte±s.d. aus drei Experimenten dargestellt. *P<0.05, **P<0.01 und ***P<0.001 durch Student’s t-test.

Um weiter zu bestätigen, dass DDRGK1 an der ER-Stressreaktion beteiligt ist, bestimmten wir die Wirkung von DDRGK1 auf das Zellüberleben nach Behandlung mit den ER-Stressinduktoren Thapsigargin (Tg) und Tunicamycin (Tm). Das Ausschalten von DDRGK1 verstärkte die ER-Stress-induzierte Apoptose durch Tg-Behandlung sowohl in HepG2- als auch in MCF7-Zellen, wie durch Annexin V/PI-Färbung und Spaltung von Caspase-3 und PARP festgestellt wurde (Abb. 2a-c und ergänzende Abb. 1A-C). Im Gegensatz dazu reduzierte die Überexpression von DDRGK1 den ER-Stress-induzierten Zelltod in HepG2-Zellen (Abb. 2d-f). Darüber hinaus wurde die Lebensfähigkeit von MCF7-Zellen mit dem MTT-Assay untersucht, und die Ergebnisse zeigten, dass der Knockdown von DDRGK1 die Zellen empfindlicher gegenüber einer Tg- oder Tm-Behandlung machte und die Lebensfähigkeit der Zellen reduzierte (ergänzende Abb. 1D), während die Überexpression von DDRGK1 das Überleben der Zellen nach einer Tg- oder Tm-Behandlung förderte (ergänzende Abb. 1E). Zusammengenommen deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass DDRGK1 eine wichtige Rolle bei der Regulierung der ER-Homöostase spielt.

(a). HepG2-Zellen wurden mit Kontroll-siRNA oder mit siRNA gegen DDRGK1 für 72 h transfiziert, und dann wurden die Zellen mit DMSO (Vehikelkontrolle) oder Tg (2,5 μM) für 24 h vor der Ernte behandelt. Die Zellen wurden mit Annexin V und PI angefärbt, gefolgt von einer durchflusszytometrischen Analyse. (b). Quantifizierung der apoptotischen Zellen (Annexin V+) in a. (c) Western-Blot-Analyse von PARP und gespaltener Caspase-3 in den in a beschriebenen HepG2-Zellen. (d) HepG2-Zellen wurden 36 Stunden lang mit dem Kontrollvektor oder DDRGK1 transfiziert, und die Zellen wurden vor der Ernte 24 Stunden lang mit DMSO oder Tg (2,5 μM) behandelt. Die Zellen wurden mit Annexin V und PI angefärbt, gefolgt von einer durchflusszytometrischen Analyse. (e) Quantifizierung der apoptotischen Zellen (Annexin V+) in d. (f) Western-Blot-Analyse von PARP und gespaltener Caspase-3 in den HepG2-Zellen in d. Alle Daten sind als Mittelwerte±s.d. aus drei Experimenten dargestellt. **P<0,01 und ***P<0,001 durch Student’s t-test.

DDRGK1 moduliert die UPR

Um zu verstehen, wie DDRGK1 die ER-Homöostase reguliert, analysierten wir zunächst die Veränderungen in den Proteinkonzentrationen von drei UPR-Sensoren und ihren nachgeschalteten Zielen in DDRGK1-depletierten Zellen. Die Ergebnisse zeigten, dass der Knockdown von DDRGK1 in MCF7- und HepG2-Zellen die Konzentrationen von Gesamt-IRE1α signifikant reduzierte, aber die Konzentrationen von phosphoryliertem IRE1α (p-IRE1α) schwach verringerte, was auf die reduzierten Konzentrationen von Gesamt-IRE1α zurückzuführen sein könnte (Abb. 3a). Die Spiegel von ATF6 und gespaltenem ATF6 waren nicht betroffen (Abb. 3a). Interessanterweise hatte der Knockdown von DDRGK1 keinen Einfluss auf die Gesamtmenge an PERK, aber die Menge an phosphoryliertem PERK (p-PERK) und BiP war signifikant erhöht (Abb. 3a). Anschließend untersuchten wir die Auswirkungen der DDRGK1-Depletion auf das IRE1α-Substrat XBP1. Die Ergebnisse zeigten, dass XBP1s, eine gespleißte Form von XBP1, in MCF7-Zellen mit DDRGK1-Depletion signifikant und zeitabhängig vermindert war (Abb. 3b), was mit Veränderungen des IRE1α-Proteinspiegels korreliert war (ergänzende Abb. 2A). Darüber hinaus erhöhte die Deletion von DDRGK1 die eIF2α-Phosphorylierung (p-eIF2α) und die CHOP-Expression sowohl in MCF7- als auch in HepG2-Zellen (ergänzende Abb. 2B). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Deletion von DDRGK1 die UPR-IRE1α-Signalisierung unterdrückt und den apoptotischen UPR-PERK-Signalweg aktiviert, der folglich die Apoptose auslöst, wie in Abb. 1 und 2 beobachtet. Allerdings war die Konzentration von IRE1α in DDRGK1-überexprimierenden Zellen dosisabhängig erhöht (Abb. 3c), während die Konzentrationen von p-PERK, PERK, ATF6, p-IRE1α, BiP und der gespleißten Form von XBP1 nicht signifikant verändert waren (Abb. 3c; ergänzende Abb. 2C und D). Um die funktionelle Beziehung zwischen DDRGK1 und der UPR zu untersuchen, untersuchten wir die dynamischen Veränderungen von IRE1α und PERK in MCF7-Zellen mit DDRGK1-Knockdown und in Kontrollzellen nach Tg-Behandlung zu verschiedenen Zeitpunkten. Die Behandlung mit Tg erhöhte erwartungsgemäß die Werte von IRE1α und p-IRE1α, p-PERK und BiP in den Kontrollzellen. Allerdings waren die gesamten IRE1α-Spiegel in DDRGK1-depletierten Zellen im Vergleich zu den Kontrollzellen signifikant verringert (0-24 h), während die p-IRE1α-Spiegel in den DDRGK1-depletierten Zellen nur geringfügig verringert waren (4-24 h) (Abb. 3d). Gleichzeitig war der XBP1s-Spiegel in DDRGK1-depletierten Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen verringert (4-12 h) (Abb. 3e). Die Gesamt-PERK-Konzentration war nicht verändert, aber p-PERK war in DDRGK1-depletierten Zellen signifikant erhöht (0-12 h) (Abb. 3d). Ähnliche Ergebnisse wurden in HepG2-Zellen erzielt (ergänzende Abb. 2E und F). Zusammengenommen deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass die Abreicherung von DDRGK1 den Abbau von IRE1α und die Aktivierung von PERK verursacht.

(a) MCF7- und HepG2-Zellen wurden entweder mit Kontroll-siRNA oder siRNA, die auf DDRGK1 abzielt, für 72 h transfiziert. Die Proteinkonzentrationen von p-IRE1α, IRE1α, p-PERK, PERK, ATF6 und BiP wurden mittels Western Blot bestimmt. (b) MCF7-Zellen wurden mit Kontroll-siRNA oder siRNA gegen DDRGK1 transfiziert, und die Zellen wurden zu den angegebenen Zeiten für die RT-PCR-Analyse des XBP-1-Spleißens geerntet. (c) MCF7- und HepG2-Zellen wurden 36 Stunden lang mit Kontroll- oder DDRGK1-Vektoren in verschiedenen Dosen transfiziert. Die Proteinkonzentrationen von p-IRE1α, IRE1α, p-PERK, PERK und ATF6 wurden mittels Western Blot bestimmt. (d) MCF7-Zellen wurden 72 Stunden lang mit siRNA-Kontrolle oder siRNA, die auf DDRGK1 abzielt, transfiziert. Die Zellen wurden nach der Behandlung mit 2,5 μM Tg zu den angegebenen Zeiten für Western Blot gesammelt. (e) RT-PCR-Analyse des XBP-1-Spleißens in d. *Stellt eine unspezifische Bande dar.

DDRGK1 reguliert die UPR durch Targeting von IRE1α

Die UPR wird durch ER-Stresssensoren bei ER-Stress ausgelöst, um die ER-Homöostase zu regulieren8. Es wurde berichtet, dass die hepatozytenspezifische Deletion von IRE1α bei Mäusen zu einer Aktivierung des UPR-PERK-Signalwegs führt23. Um herauszufinden, ob die in DDRGK1-depletierten Zellen beobachtete Induktion von p-PERK durch verringerte IRE1α-Spiegel vermittelt wurde, haben wir die Spiegel von p-PERK, PERK und deren nachgeschalteten Zielmolekülen in IRE1α-depletierten Zellen untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass der Knockdown von IRE1α die Proteinkonzentrationen von p-PERK und p-eIF2α sowohl in MCF7- als auch in HepG2-Zellen signifikant erhöhte (Abb. 4a), ähnlich wie sie in DDRGK1-depletierten Zellen beobachtet wurden (Abb. 3a; ergänzende Abb. 2B). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass DDRGK1 die UPR durch den Angriff auf IRE1α reguliert. Wir haben dann untersucht, wie DDRGK1 IRE1α reguliert. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die IRE1α-Proteinkonzentration, nicht aber die mRNA-Konzentration (ergänzende Abb. 3A), in DDRGK1-Knockdown-Zellen drastisch reduziert war (Abb. 3a). Die Behandlung der Zellen mit dem Proteasom-Inhibitor MG132 blockierte die DDRGK1-vermittelte Verringerung des IRE1α-Proteins (Abb. 4b; ergänzende Abb. 3B). Darüber hinaus beobachteten wir, dass die Abreicherung von DDRGK1 die Halbwertszeit von IRE1α in einem Cycloheximid-Chase-Assay drastisch reduzierte (Abb. 4c). In Übereinstimmung mit diesen Beobachtungen stellten wir fest, dass die ektopische Expression von IRE1α das Zellüberleben sowohl in DDRGK1-depletierten MCF7- als auch in HepG2-Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen verbesserte, gekennzeichnet durch Annexin V/PI-Färbung und Caspase-3-Aktivierung (Abb. 4d,e; ergänzende Abb. 3C und D). Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass DDRGK1 die Stabilität von IRE1α reguliert und dadurch die UPR reguliert.

(a). MCF7- und HepG2-Zellen wurden entweder mit Kontroll-siRNA oder siRNA, die auf IRE1α abzielt, für 72 h transfiziert. Die Proteinkonzentrationen von p-PERK, PERK, p-eIF2α und eIF2α wurden mittels Western Blot bestimmt. (b). Western-Blot-Analyse von IRE1α in Kontroll- und DDRGK1-knockdown MCF7-Zellen, die mit oder ohne MG132 (20 μM, 8 h) behandelt wurden. (c). Western-Blot-Analyse des IRE1α-Zerfalls in Kontroll- und DDRGK1-Knockdown-MCF7-Zellen nach Behandlung mit 100 μg ml-1 Cycloheximid für die angegebenen Zeiten. Die Grafik zeigt die Quantifizierung der IRE1α-Proteinspiegel. (d) MCF7-Zellen wurden entweder mit Kontroll-siRNA oder siRNA, die auf DDRGK1 abzielt, 72 Stunden lang transfiziert. Vor der Ernte wurden die DDRGK1-Knockdown-Zellen entweder mit Kontroll- oder IRE1α-Vektoren 36 Stunden lang transfiziert. Die Zellen wurden anschließend mit Annexin V und PI gefärbt und einer durchflusszytometrischen Analyse unterzogen, gefolgt von einer Quantifizierung der apoptotischen Zellen (Annexin V+). Alle Daten sind als Mittelwerte±s.d. aus drei Experimenten angegeben. *P<0,05 durch Student’s t-test. (e) Western-Blot-Analyse von IRE1α in MCF7-Zellen in d.

DDRGK1 interagiert mit IRE1α

Um zu verstehen, wie DDRGK1 die IRE1α-Stabilität reguliert, testeten wir, ob DDRGK1 mit IRE1α über einen reziproken Immunopräzipitationstest (IP) in HEK293T-Zellen interagiert. Die Ergebnisse zeigten, dass exogen exprimiertes Flag-IRE1α spezifisch mit endogenem DDRGK1 und BiP interagierte (Abb. 5a). Dementsprechend interagierte exogen exprimiertes Flag-DDRGK1 spezifisch mit endogenem IRE1α und dem bekannten DDRGK1-assoziierten Protein C53 (Ref. 14). Allerdings konnten wir BiP in den Flag-DDRGK1-Immunpräzipitaten nicht nachweisen (Abb. 5b), was darauf schließen lässt, dass DDRGK1 möglicherweise nicht direkt mit BiP interagiert. IRE1α, ein endogenes ER-assoziiertes Degradationssubstrat (ERAD), wird durch die Assoziation zwischen IRE1α und dem Sel1L-Hrd1 ERAD-Komplex in einer BiP-abhängigen Weise abgebaut24. Daher haben wir untersucht, ob BiP an der Interaktion zwischen DDRGK1 und IRE1α beteiligt ist. Die Ergebnisse zeigten, dass die Interaktion zwischen DDRGK1 und IRE1α durch die Ausschaltung von BiP nicht beeinträchtigt wurde (ergänzende Abb. 4). Um die Interaktion von DDRGK1 mit IRE1α weiter zu bestätigen, führten wir Immunfluoreszenzfärbeexperimente durch. Die Ergebnisse zeigten, dass diese beiden Proteine im ER kolokalisiert sind (Abb. 5c). Um die Region zu kartieren, die an der Interaktion von IRE1α mit DDRGK1 beteiligt ist, haben wir Flag-IRE1α-Wildtyp und Trunkierungsmutanten zusammen mit DDRGK1 in HEK293T-Zellen kotransfiziert, und die IP-Ergebnisse zeigten, dass die zytoplasmatische Kinasedomäne von IRE1α für die Interaktion mit DDRGK1 notwendig war (Abb. 5d). Um die dynamischen Veränderungen in der Interaktion zwischen DDRGK1 und IRE1α unter ER-Stressbedingungen zu verstehen, wurden HEK293T-Zellen mit Flag-DDRGK1 transfiziert und zu verschiedenen Zeitpunkten mit Tg behandelt. Wie erwartet, beobachteten wir, dass die Gesamtmenge an IRE1α, p-IRE1α und BiP unter ER-Stress signifikant erhöht war. Interessanterweise stellten wir fest, dass DDRGK1 in den Immunpräzipitaten spezifisch mit unphosphoryliertem IRE1α, aber nicht mit p-IRE1α interagierte (Abb. 5e). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass DDRGK1 mit nicht-phosphoryliertem IRE1α interagiert und dessen Stabilität aufrechterhält.

(a). Western-Blot-Analyse von Immunopräzipitaten des Flag M2-Affinitätsgels in HEK293T-Zellen, die mit Flag-Vector- oder Flag-IRE1α-Vektoren für 36 h transfiziert wurden. (b). Western-Blot-Analyse von Immunpräzipitaten des Flag M2-Affinitätsgels in HEK293T-Zellen, die 36 h lang mit Flag-Vector oder Flag-DDRGK1 transfiziert wurden. (c). MCF7-Zellen wurden mit Anti-DDRGK1-Antikörper (grün) und Anti-IRE1α-Antikörper (rot) doppelt immungefärbt. Die Zellkerne wurden mit DAPI (blau) gegengefärbt. Die Ko-Lokalisierung zwischen den beiden endogenen Proteinen DDRGK1 und IRE1α ist im Merge-Panel dargestellt. Maßstabsbalken, 20 μm. (d) Schematische Darstellung der IRE1α-Wildtyp- und verkürzten Konstrukte und Western-Blot-Analyse der Flag M2-Affinitätsgel-Immunpräzipitate in HEK293T-Zellen, die mit Flag-Vektor oder Flag-IRE1α-Wildtyp und verkürzten Konstrukten transfiziert wurden. (e) Western-Blot-Analyse von Flag M2-Affinitätsgel-Immunpräzipitaten in mock- oder Tg-behandelten (2,5 μM) HEK293T-Zellen, die Flag-Vector oder Flag-DDRGK1 exprimieren.

Ufm1 ist für die Interaktion von DDRGK1 und IRE1α erforderlich

Eine kürzlich durchgeführte Studie zeigte, dass DDRGK1 ein Ufmylierungssubstrat ist und für die ASC1-Ufmylierung erforderlich ist15,20. Um zu untersuchen, ob die Ufmylierung an der Regulierung der IRE1α-Stabilität durch DDRGK1 beteiligt ist, haben wir untersucht, ob die Abreicherung von Ufm1 die IRE1α-Proteinexpression beeinflusst. Ähnlich wie bei der Abreicherung von DDRGK1 beobachteten wir, dass der Knockdown der Ufm1-Expression die IRE1α-Proteinexpression drastisch reduzierte (Abb. 6a), was darauf hindeutet, dass DDRGK1 IRE1α durch Ufmylierung reguliert. Dementsprechend konnten wir feststellen, dass eine Überexpression von DDRGK1 das IRE1α-Protein in MCF7-Zellen mit Ufm1-Knockdown im Vergleich zu Kontrollzellen nicht stabilisieren konnte (Abb. 6b). Darüber hinaus waren die IRE1α-Proteinkonzentrationen in MCF7-Zellen mit Ufm1-Knockdown sowohl in Abwesenheit als auch in Anwesenheit von Tg drastisch reduziert (Abb. 6c), was darauf hindeutet, dass die Ufmylierung für die Regulierung der IRE1α-Proteinstabilität durch DDRGK1 erforderlich ist. Wir fragten uns dann, ob IRE1α einer ufmylierten Modifikation unterliegt. Um dieser Frage nachzugehen, wiesen wir die Ufmylierung von IRE1α in Zellen nach, die DDRGK1 und Ufm1 sowie UBA5 (E1), UFC1 (E2) und UFL1 (E3) exprimieren, wie zuvor beschrieben20. Wir konnten jedoch keine Ufmylierung des IRE1α-Proteins nachweisen, obwohl die Ufmylierung des DDRGK1-Proteins leicht nachweisbar war, wie zuvor beschrieben (Daten nicht gezeigt)15,20,25, was darauf hindeutet, dass IRE1α möglicherweise kein Ziel der Ufmylierung ist. Interessanterweise stellten wir fest, dass die Assoziation zwischen DDRGK1 und IRE1α in HEK293T-Zellen mit Ufm1-Knockdown im Vergleich zu Kontrollzellen signifikant verringert war (Abb. 6d). In Übereinstimmung mit dieser Beobachtung stellten wir fest, dass die Interaktion von DDRGK1 K267R (eine DDRGK1-Mutante mit Defiziten bei der Ufmylierung, bei der der Lysinrest 267 durch einen Argininrest ersetzt wurde)15 mit IRE1α im Vergleich zum Wildtyp DDRGK1 drastisch verringert war (Abb. 6e), was darauf hindeutet, dass die Ufmylierung von DDRGK1 für die Assoziation zwischen DDRGK1 und IRE1α erforderlich ist. Darüber hinaus konnte DDRGK1 K267R das IRE1α-Protein im Vergleich zum Wildtyp DDRGK1 nicht stabilisieren (Abb. 6f). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Ufmylierung von DDRGK1 an K267 für seine Interaktion mit IRE1α und die Regulierung der IRE1α-Proteinstabilität erforderlich ist.

(a) MCF7-Zellen wurden entweder mit Kontroll-siRNA oder siRNA, die auf Ufm1 abzielt, für 72 h transfiziert. Die Proteinkonzentrationen von IRE1α wurden mittels Western Blot bestimmt. (b) Western-Blot-Analyse von IRE1α in Kontroll- und Ufm1-Knockdown-MCF7-Zellen, die Vektor oder DDRGK1 exprimieren. (c) Der Proteingehalt von IRE1α wurde mittels Western Blot in Kontroll- und Ufm1-Knockdown-MCF7-Zellen nach Behandlung mit 2,5 μM Tg für die angegebenen Zeiten bestimmt. (d) Western-Blot-Analyse von Flag M2-Affinitätsgel-Immunopräzipitaten in HEK293T-Kontroll- und Ufm1-Knockdown-Zellen, die Flag-Vector oder Flag-DDRGK1 exprimieren. (e) Western-Blot-Analyse von Flag M2-Affinitätsgel-Immunpräzipitaten in HEK293T-Zellen, die mit Flag-Vector, Flag-DDRGK1 WT oder K267R-Mutante transfiziert wurden. (f) Western-Blot-Analyse von IRE1α in MCF7-Zellen, die mit Flag-Vektor, Flag-DDRGK1 WT oder K267R-Mutante transfiziert wurden.

DDRGK1 ist für die HSC-Rekonstitutionsfähigkeit bei Mäusen erforderlich

Eine kürzlich durchgeführte Studie deutet darauf hin, dass hämatopoetische Stammzellen (HSCs) extrem empfindlich gegenüber ER-Stress sind26. Dies veranlasste uns zu der Vermutung, dass DDRGK1 für die Funktion der HSZ entscheidend sein könnte. Zunächst bestimmten wir die Expressionsmenge von DDRGK1 in verschiedenen hämatopoetischen Linien von 2 Monate alten Wildtyp-Mäusen. Q-PCR ergab eine signifikant höhere Expression von DDRGK1 in HSZ, einschließlich Langzeit-HSZ (LT-HSCs), Kurzzeit-HSZ (ST-HSCs) und multipotenten Vorläuferzellen (MPPs) (Abb. 7a). Darüber hinaus war die Proteinkonzentration von DDRGK1 in HSC-angereicherten Lineage-c-Kit+-Knochenmarkzellen im Vergleich zu Lineage+c-Kit–BM-Zellen hoch (Abb. 7b). Diese Beobachtungen deuten auf eine wichtige Rolle von DDRGK1 in Stammzellen hin. Um die Rolle von DDRGK1 in der HSC-Funktion zu untersuchen, wurden kompetitive Transplantationsexperimente mit HSCs nach lentiviralem Knockdown von DDRGK1 durchgeführt (Abb. 7c). Lineage-Sca1+c-Kit+ (LSK) Zellen von CD45.1 Spendermäusen wurden mit dem Kontroll- oder DDRGK1-Knockdown-Lentivirus transduziert und in letal bestrahlte CD45.2 Empfängermäuse transplantiert. Die durchflusszytometrische Analyse zeigte, dass der Prozentsatz der vom Spender stammenden Zellen aus dem peripheren Blut (PB) in der DDRGK1-Knockdown-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant reduziert war, was darauf hindeutet, dass der Knockdown von DDRGK1 die Fähigkeit zur kompetitiven Rekonstitution von HSCs signifikant beeinträchtigt (Abb. 7d). Während in einem nicht-kompetitiven Transplantationsexperiment die Empfängermäuse, die mit DDRGK1-Knockdown-HSZs transplantiert wurden, drei Monate nach der Transplantation noch lebten, deutet dies darauf hin, dass der Knockdown von DDRGK1 lediglich die kompetitive Rekonstitutionsfähigkeit der HSZs beeinträchtigte. Um Off-Target-Effekte auszuschließen, entwickelten wir eine weitere shRNA, die auf DDRGK1 abzielte, und beobachteten ähnliche Ergebnisse (ergänzende Abb. 5A). Drei Monate nach der Transplantation wurden die Empfängermäuse für die BM-Analyse und in vitro-Koloniebildungstests euthanasiert. Die durchflusszytometrische Analyse zeigte, dass der Knockdown von DDRGK1 die Aufrechterhaltung der transduzierten HSCs dramatisch beeinträchtigte, ohne deren Abstammungspotenzial (d. h. myeloische, B-Zell- und T-Zell-Linien) zu beeinflussen, was sich in einer verringerten Häufigkeit der vom Spender stammenden hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen sowie der differenzierten hämatopoetischen Zellen im BM und PB zeigte (Abb. 7e). Ein ähnliches Ergebnis wurde in einem unabhängigen Experiment mit einer anderen shRNA, die auf DDRGK1 abzielt, beobachtet (ergänzende Abb. 5B). Darüber hinaus isolierten wir CD34-Flt3-LSK-Zellen (LT-HSCs) von Spendern aus den Empfängermäusen und führten einen Einzelzell-Koloniebildungstest durch. Die Ergebnisse zeigten, dass der Knockdown von DDRGK1 die Fähigkeit der HSCs, intermediäre und große Kolonien zu bilden, beeinträchtigte (Abb. 7f). Insgesamt deuten diese Daten darauf hin, dass DDRGK1 für die Aufrechterhaltung der HSZ-Funktion erforderlich ist.

(a) Q-PCR-Analyse der relativen mRNA-Expressionsniveaus von DDRGK1 in den angegebenen Subpopulationen von BM aus jungen Wildtyp-Mäusen (2 Monate alt, n=3). Die relative Expression von DDRGK1 wurde auf GAPDH normalisiert. Die Daten sind als Mittelwerte±s.d. dargestellt. (b) Western-Blot-Analyse von DDRGK1 in angereicherten Lineage+ c-Kit- und Lineage- c-Kit+ Zellen von jungen Wildtyp-Mäusen (2 Monate alt). (c) Experimentelles Schema für den Rekonstitutionsversuch. (d) Repräsentative FACS-Muster, die den prozentualen Anteil GFP-positiver Zellen in von Spendern stammenden Kontroll- (sh-Vektor) oder DDRGK1-Knockdown- (sh-DDRGK1) PB-Zellen zeigen (linkes Feld). Die Werte stellen den normalisierten Prozentsatz der GFP+-Zellen des Spenders am gesamten Transplantat dar (rechtes Feld, n=3). Die Daten sind als Mittelwerte±s.d. dargestellt. **P<0,01 und ***P<0,001 durch Student’s t-test. (e) Die Werte stellen den prozentualen Anteil der vom Spender stammenden GFP+ Zellen in LT-HSC (CD34-Flt3- LSK), ST-HSC (CD34+Flt3- LSK), MPP (CD34+Flt3+ LSK), CMP (CD34+CD16/32-Sca1-c-Kit+Lin-) dar, GMP (CD34+CD16/32+Sca1-c-Kit+Lin-), MEP (CD34- CD16/32-Sca1-c-Kit+Lin-), B, T und Zellpopulationen der myeloischen Linie im BM von primären Empfängermäusen 12 Wochen nach der Transplantation (n=3). Die Daten sind als Mittelwerte±s.d. dargestellt. ***P<0,001 durch Student’s t-test. (f) Einzelne vom Spender stammende GFP+ LT-HSCs von Empfängermäusen wurden in 96-Well-Platten sortiert und 14 Tage lang in vitro kultiviert. Der Prozentsatz der Kolonien wurde berechnet, indem die Anzahl der Kolonien durch die ursprüngliche Anzahl der ausgesäten Einzelzellen geteilt wurde. Die Daten sind als Mittelwerte±s.d. dargestellt. **P<0,01 durch Student’s t-test.

Um zu untersuchen, ob die beeinträchtigte HSZ-Funktion auf eine verminderte Homing-Effizienz zurückzuführen ist, markierten wir Kontroll- oder sh-DDRGK1 lentiviral transduzierte LSK-Zellen, die aus 2 Monate alten Mäusen gereinigt worden waren, mit Fluoreszenzfarbstoff (violett) und injizierten sie letal bestrahlten Empfängern. Der Prozentsatz der markierten LSK-Zellen, die 18 Stunden nach der Transplantation im Knochenmark des Empfängers vorhanden waren, wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass die Homing-Fähigkeit von DDRGK-knockdown LSK-Zellen mit der von Kontrollzellen vergleichbar war (ergänzende Abb. 6A und B). Um festzustellen, ob der Knockdown von DDRGK1 eine Auswirkung auf den Zellzyklus-Status von LSK-Zellen hat, färbten wir von Spendern stammende Kontroll- und DDRGK1-Knockdown-LSK-Zellen mit dem Proliferationsmarker Ki67 und DAPI an und fanden keinen signifikanten Unterschied in den Zellzyklusprofilen zwischen DDRGK1-Knockdown-HSKs und Kontroll-HSKs (ergänzende Abb. 7A). Anschließend untersuchten wir die Auswirkung des DDRGK1-Knockdowns auf die Apoptose der HSZ mittels Annexin V-Färbung und fanden eine signifikant höhere Apoptosehäufigkeit in von Spendern stammenden DDRGK1-Knockdown-LSK-Zellen im Vergleich zu Kontroll-LSK-Zellen; dieses Phänomen wurde bei beiden shRNAs, die auf DDRGK1 abzielen, beobachtet (Abb. 8a; ergänzende Abb. 7B). Als Nächstes untersuchten wir den Gehalt an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in den transduzierten HSK-Zellen. Die Ergebnisse zeigten, dass die ROS-Konzentration in den Kontroll- und DDRGK1-Knockdown-Gruppen vergleichbar war (ergänzende Abb. 7C). Auf der Grundlage der obigen Beobachtungen kamen wir zu dem Schluss, dass der Knockdown von DDRGK1 in HSCs den apoptotischen Zelltod auslöst und damit die Funktion der HSCs beeinträchtigt.

(a) Repräsentatives FACS-Muster, das den Prozentsatz der Annexin V-positiven Zellen in den vom Spender stammenden Kontroll- und DDRGK1-Knockdown-LSK-Zellen nach der Transplantation zeigt (linkes Feld). Das Balkendiagramm zeigt den Prozentsatz der Annexin V-positiven Zellen innerhalb der LSK-Zellen (rechtes Feld, n=3). Die Daten sind als Mittelwerte±s.d. dargestellt. *P<0,05 durch Student’s t-test. (b) Q-PCR-Analyse der relativen mRNA-Expressionsniveaus von DDRGK1, BiP und CHOP in von Spendern stammenden Kontroll- und DDRGK1-Knockdown-LSK-Zellen nach Transplantation (n=3). Die Daten sind als Mittelwerte±s.d. dargestellt. **P<0.01 und ***P<0.001 durch Student’s t-test. (c) Western-Blot-Analyse von p-IRE1α, IRE1α, p-PERK, PERK und ATF6 in von Spendern stammenden GFP+Lineage-c-Kit+-Zellen, angereichert aus Kontroll- oder DDRGK1-Knockdown-Empfängermäusen. *Stellt eine unspezifische Bande dar. (d) RT-PCR-Analyse des XBP-1-Spleißens in von Spendern stammenden Kontroll- und DDRGK1-knockdown LSK-Zellen nach der Transplantation. MEF-Zellen mit Tg-Behandlung dienten als XBP-1-Splicing-Kontrolle.

Um zu untersuchen, ob die beeinträchtigte HSZ-Funktion auf die Aktivierung der ER-Stressreaktion in DDRGK1-Knockdown-HSZ zurückzuführen ist, analysierten wir die Expressionsniveaus von BiP und CHOP mittels Q-PCR in den transplantierten Kontroll- und DDRGK-Knockdown-HSZ. Die Ergebnisse zeigten, dass die mRNA-Niveaus von BiP und CHOP in DDRGK1-Knockdown-HSZ deutlich erhöht waren (Abb. 8b). Darüber hinaus untersuchten wir die Proteinkonzentrationen von ER-Stresssensoren in den Kontroll- und DDRGK-knockdown Lineage-c-Kit+ BM-Zellen. In Übereinstimmung mit der Beobachtung in Krebszelllinien zeigte der Knockdown von DDRGK1 verringerte Proteinkonzentrationen von IRE1α und p-IRE1α und eine erhöhte Konzentration von p-PERK, während sich die ATF6-Konzentrationen in den Kontroll- und DDRGK1-Knockdown-Gruppen nicht unterschieden (Abb. 8c). Dementsprechend war der XBP1s-Spiegel in den von Spendern stammenden DDRGK1-Knockdown-LSK-Zellen verringert (Abb. 8d). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass der Knockdown von DDRGK1 die IRE1α-Signalisierung beeinträchtigte, aber den PERK-Signalweg aktivierte, und bestätigen, dass DDRGK1 für die ordnungsgemäße Aufrechterhaltung der ER-Homöostase und damit für das Überleben und die Aufrechterhaltung von HSCs entscheidend ist.