Plasmidkonstruktion

Jedes in dieser Studie getestete chimäre Anti-HA-ScFv wurde durch Aufpfropfen von sechs CDR-Schleifen eines Anti-HA-Antikörpers 12CA5 auf jedes ausgewählte ScFv-Gerüst konstruiert. Das \(\chi _{15{\mathrm{{F}}}11}^{{\mathrm{{HA}}}}\) Plasmid wurde in zwei Schritten konstruiert: (1) ein CDR-Loop-gepfropfter scFv gblock und ein durch EcoRI-Restriktionsstellen linearisierter H4K20me1 mintbody 15F11-Vektor38 wurden mittels Gibson-Assembly (von House hergestellter Mastermix) ligiert; (2) der Linker, der das scFv und EGFP verbindet, sowie EGFP wurden durch einen gblock ersetzt, der für einen flexiblen (G4S) × 5-Linker und das mEGFP durch Gibson-Assembly über NotI-Restriktionsstellen kodiert. Für die anderen vier chimären scFv-Plasmide wurde jeder CDR-Loop-gepfropfte scFv gblock in den \(\chi _{15{\mathrm{{F}}}11}^{{\mathrm{{HA}}}}\) Vektor ligiert, der durch EcoRI-Restriktionsstellen über Gibson-Assembly linearisiert wurde.

Das Zielplasmid 1 × HA-mCh-H2B wurde konstruiert, indem das sfGFP eines Addgene-Plasmids sfGFP-H2B (Plasmid # 56367) durch einen 1 × HA-Epitop-getaggten mCherry gblock ersetzt wurde, in dem eine NotI-Restriktionsstelle zwischen dem 1 × HA-Epitop und dem mCherry für die folgende Klonierung eingefügt wurde. Das 4 × HA-mCh-H2B wurde konstruiert, indem der 1 × HA-Tag des 1 × HA-mCh-H2B-Konstrukts durch einen 4 × HA-Epitop-gblock über AgeI- und NotI-Restriktionsstellen ersetzt wurde. Das 10 × HA-mCh-H2B (smHA-mCh-H2B) wurde konstruiert, indem das 1 × HA-Tag des 1 × HA-mCh-H2B-Konstrukts durch das smHA ersetzt wurde, das aus dem Addgene-Plasmid smHA-KDM5B-MS2 (Plasmid # 81085) unter Verwendung der Primer NZ-098 und 099 amplifiziert wurde (alle Primersequenzen sind in der ergänzenden Tabelle 1 aufgeführt). Das smHA-H2B wurde konstruiert, indem das 1 × HA-mCh des 1 × HA-mCh-H2B-Konstrukts durch smHA ersetzt wurde, das aus dem Plasmid smHA-KDM5B-MS2 unter Verwendung der Primer NZ-098 und 100 amplifiziert wurde.

Ein weiteres Zielplasmid 4 × HA-mCh-β-Actin wurde konstruiert, indem das H2B des 4 × HA-mCh-H2B durch ein β-Actin-Amplikon über BglII- und BamHI-Restriktionsstellen ersetzt wurde. Das β-Actin-Amplikon wurde von einem Addgene-Plasmid smFlag-ActinB-MS2 (Plasmid # 81083) unter Verwendung der Primer NZ-073 und NZ-074 amplifiziert.

Das 4 × HA-mRuby-Kv2.1-Plasmid wurde erzeugt, indem zunächst das 4 × HA-Tag von 4 × HA-mCh-H2B unter Verwendung der Primer NZ-105 und 106 amplifiziert wurde. Dann wurde das 4 × HA-Amplikon in ein veröffentlichtes Plasmid pCMV-mRuby2-Kv2.161 (ein Geschenk von Dr. Michael Tamkun) eingeführt, das durch einen Restriktionsverdau mit AgeI unter Verwendung der Gibson-Montage linearisiert worden war. Das smHA-Kv2.1-Plasmid wurde durch PCR-Amplifikation der Kv2.1-Kodierungssequenz der Ratte aus pBK-Kv2.140 und anschließende Ligation in die AsiSI- und PmeI-Restriktionsstellen auf dem Plasmid smHA-KDM5B-MS2 unter Verwendung der Primer Kv2.1-1 und 2.

Das H2B-mCh-1 × HA wurde in zwei Schritten hergestellt: (1) Ersetzen des 1 × HA-Tags von 1 × HA-mCh-H2B durch H2B über AgeI- und NotI-Stellen, wobei das H2B aus 1 × HA-mCh-H2B mit den Primern NZ-092 und 093 amplifiziert wurde; (2) Ersetzen des H2B am C-Terminus von mCherry durch ein 1 × HA-Tag über BglII- und BamHI-Stellen, wobei das 1 × HA-Tag durch überlappende PCR mit den Primern NZ-094 und 095 synthetisiert wurde. Das Mito-mCh-1 × HA wurde konstruiert, indem das H2B in H2B-mCh-1 × HA durch AgeI- und NotI-Stellen durch Mito gblock23 ersetzt wurde. Das Mito-mCh-smHA wurde konstruiert, indem der 1 × HA-Tag von Mito-mCh-1 × HA durch smHA ersetzt wurde, das mit den Primern NZ-096 und 097 aus dem smHA-KDM5B-MS2 amplifiziert wurde. Das mCh-H2B wurde erzeugt, indem das sfGFP des Plasmids sfGFP-H2B durch einen mCherry gblock mittels Gibson-Assembly ersetzt wurde.

Die Plasmide FB-mCh, FB-Halo und FB-SNAP wurden durch Ersetzen des mEGFP des Plasmids \(\chi _{15{\mathrm{{F}}}11}^{{\mathrm{{HA}}}}\)) mit mCherry-, HaloTag- bzw. SNAP-tag gblocks erzeugt.

pET23b-FB-GFP, das Plasmid für die rekombinante Frankenbody-Expression und -Reinigung, wurde von Gibson mit einem FB-GFP-Amplikon und einem veröffentlichten Plasmid pET23b-Sso7d62,63 zusammengesetzt, das durch NdeI- und NotI-Restriktionsstellen linearisiert wurde. Das FB-GFP-Amplikon wurde aus \(\chi _{15{\mathrm{{F}}}11}^{{\mathrm{{HA}}}}\)) durch PCR mit den Primern NZ-075 und 077 amplifiziert.

Für den Translationsassay wurden die Reporterkonstrukte smHA-KDM5B-MS2 und SunTag-kif18b von Addgene (Plasmid # 81085 und # 74928) bezogen, und das SunTag scFv-Plasmid (Plasmid # 60907) wurde durch Entfernen des im Linker kodierten HA-Epitops modifiziert. Das HA-Epitop wurde durch ortsgerichtete Mutagenese mit QuikChange Lightning (Agilent Technologies) gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung der Primer HAout-1 und 2 entfernt.

Die g-Blöcke wurden von Integrated DNA Technologies synthetisiert und die rekombinanten Plasmide wurden von Quintara Biosciences sequenzverifiziert. Die Sequenzen der Primer sind in der ergänzenden Tabelle 1 aufgeführt. Alle Plasmide, die für die bildgebende Übersetzung verwendet wurden, wurden mit dem NucleoBond Xtra Midi EF Kit (Macherey-Nagel) in einer Endkonzentration von etwa 1 mg mL-1 hergestellt.

U2OS-Zellkultur

U2OS-Zellen (ATCC HTB-96) wurden in einem Inkubator bei 37 °C, befeuchtet, mit 5 % CO2 in DMEM-Medium (Thermo Scientific), ergänzt mit 10 % (v/v) fötalem Rinderserum (Altas Biologicals), 1 mM l-Glutamin (Gibco) und 1 % (v/v) Penicillin-Streptomycin (Gibco oder Invitrogen), gezüchtet.

Transfektion und Bead-Loading

Für das Tracking der Proteinlokalisierung wurden die Zellen 2 Tage vor dem Imaging in eine 35 mm MatTek-Kammer (MatTek) plattiert und 18-24 h vor dem Imaging mit dem LipofectamineTM LTX-Reagenz mit PLUS-Reagenz (Invitrogen) gemäß den Anweisungen des Herstellers transfiziert.

Für die Bildgebung der Translation mit mRNA, die mit MCP-Halo-Protein markiert ist, wurden die Zellen am Tag vor der Bildgebung in eine 35 mm MatTek-Kammer (MatTek) plattiert. Am Tag des Imaging wurde das Medium in der MatTek-Kammer vor dem Laden der Beads durch Opti-MEM (Thermo Scientific) mit 10 % fötalem Rinderserum ersetzt. Eine Mischung aus Plasmiden (smHA-KDM5B-MS2/FB) und gereinigtem MCP-HaloTag-Protein17 wurde wie zuvor beschrieben6,17,26 per Bead geladen. Nachdem das Opti-Medium aus der MatTek-Kammer entfernt worden war, wurden 4 µl einer Mischung aus Plasmiden (je 1 µg) und MCP-HaloTag (130 ng) in PBS auf die Zellen pipettiert und ~106 µm große Glasperlen (Sigma Aldrich) gleichmäßig darauf verteilt. Anschließend wurde die Kammer siebenmal kräftig ausgeklopft, und Opti-Medium wurde wieder zu den Zellen gegeben. 3 Stunden nach dem Laden der Beads wurden die Zellen mit 1 ml 0,2 nM des JF646-HaloTag-Liganden48 gefärbt, der in phenolfreier vollständiger DMEM verdünnt war. Nach einer 20-minütigen Inkubation wurden die Zellen dreimal in phenolfreiem, vollständigem DMEM gewaschen, um Glaskügelchen und nicht gefärbte Farbstoffe zu entfernen. Die Zellen waren dann für die Bildgebung bereit.

Für die bildgebende Translation ohne mRNA-Markierung wurden die auf MatTek-Kammern plattierten Zellen mit den benötigten Plasmiden, smHA-KDM5B-MS2/FB mit oder ohne SunTag-kif18b/Sun (ohne HA-Epitop), unter Verwendung des LipofectamineTM LTX-Reagenz mit dem PLUS-Reagenz (Invitrogen) gemäß den Anweisungen des Herstellers am Tag der Bildgebung transfiziert. 3 Stunden nach der Transfektion wurde das Medium durch phenolfreies vollständiges DMEM ersetzt. Die Zellen waren dann für die Bildgebung bereit.

Aufreinigung von FB-GFP

E. coli BL21 (DE3) pLysS-Zellen, die mit pET23b-FB-GFP transformiert wurden, wurden bei 37 °C in 2xYT-Medium, das Ampicillin (100 mg L-1) und Chloramphenicol (25 mg L-1) enthält, unter Schütteln bis zu einer Dichte von OD600 0,6 gezüchtet. Isopropyl-β-d-thiogalactosid (IPTG) wurde in einer Endkonzentration von 0,4 mM zugegeben, um die Proteinexpression zu induzieren, und die Temperatur wurde auf 18 °C gesenkt. Die Zellen wurden nach 16 Stunden durch Zentrifugation geerntet und in PBS-Puffer, der mit 300 mM NaCl, Proteaseinhibitoren (ThermoFisher) und 0,2 mM AEBSF (20 mL L-1 Kultur) angereichert war, resuspendiert und durch Sonikation lysiert. Das Lysat wurde durch Zentrifugation geklärt. Der Überstand wurde auf zwei verbundene HisTrap HP 5 mL Säulen (GE Healthcare) aufgetragen, gewaschen und mit einem linearen Gradienten von 0-500 mM Imidazol eluiert. Die POI-haltigen Fraktionen wurden gepoolt, mit einer Amicon Ultra-15 30 kDa MWCO Zentrifugalfiltereinheit (EMD Millipore) konzentriert und auf eine Größenausschluss-Säule HiLoad Superdex 200 PG (GE Healthcare) in HEPES-Puffer (25 mM HEPES pH 7,9, 12,5 mM MgCl2, 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 0,01% NP40, 10% Glycerin und 1 mM DTT) aufgetragen. Die Fraktionen, die FB-GFP-Protein enthalten, wurden gesammelt, konzentriert und bei -80 °C gelagert, nachdem sie mit flüssigem Stickstoff eingefroren worden waren.

Immunfärbung

U2OS-Zellen wurden transient mit 4 × HA-mCh-H2B oder 4 × HA-mCh-β-Actin mit LipofectamineTM LTX-Reagenz und dem PLUS-Reagenz (Invitrogen) transfiziert. 26 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen mit 4 % Paraformaldehyd (Electron Microscopy Sciences) 10 Minuten lang bei Raumtemperatur fixiert, 20 Minuten lang in 1 % Triton 100 in PBS, pH 7,4, permeabilisiert, 20 Minuten lang in Blocking One-P (Nacalai Tesque) blockiert und über Nacht bei 4 °C mit gereinigtem FB-GFP-Protein (0,5 µg mL-1 in 10 % Blocking-Puffer) gefärbt. Am nächsten Morgen wurden die Zellen mit PBS gewaschen, und der POI wurde mit einem konfokalen Olympus IX81 Spinning-Disc-Mikroskop (CSU22-Kopf) unter Verwendung eines ×100-Ölimmersionsobjektivs (NA 1,40) unter den folgenden Bedingungen abgebildet: 488 nm (0,77 mW; gemessen an der hinteren Brennebene des Objektivs; alle Messungen der Laserleistung beziehen sich auf die hintere Brennebene des Objektivs) und 561 nm (0,42 mW) sequentielle Bildgebung für 50 Zeitpunkte ohne Verzögerung, 2 × 2 Spinrate, 100 ms Belichtungszeit. Die Bilder wurden mit einer Photometrics Cascade II CCD-Kamera unter Verwendung der SlideBook-Software (Intelligent Imaging Innovations) aufgenommen. Die Bilder der Immunfärbung wurden durch Mittelung von 50-Zeitpunkt-Bildern für jeden Kanal mit Fiji64 erstellt.

Western blots

U2OS-Zellen wurden transient mit 4 × HA-mCh-H2B oder 4 × HA-mCh-β-actin mit LipofectamineTM LTX-Reagenz mit dem PLUS-Reagenz transfiziert. 10 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen geerntet und in 120 µL RIPA-Puffer mit cOmplete Protease Inhibitor (Roche) lysiert. 6,5 µL jedes Zelllysats wurden auf ein NuPAGETM 4-12% Bis-Tris-Proteingel (Invitrogen) geladen und 60 min bei 100 V und 25 min bei 200 V laufen gelassen. Die Proteine wurden auf eine PVDF-Membran (Invitrogen) übertragen, 1 h lang in Blocking-Puffer (5% Milchpulver in 0,05% TBS-Tween 20) blockiert und über Nacht entweder mit gereinigtem FB-GFP-Protein (0,5 µg mL-1 in Blocking-Puffer) oder mit dem Anti-HA-Eltern-Antikörper 12CA5 (Sigma-Aldrich Cat #11583816001; 2000-fache Verdünnung mit Endkonzentration 0,5 µg mL-1 in Blocking-Puffer) gefärbt. Für den primären Antikörper 12CA5 wurde zusätzlich eine 1-stündige Inkubation mit Anti-Maus-Antikörper/Alexa488 (Thermo Fisher Cat #A11001; 5000-fache Verdünnung in Blocking-Puffer) durchgeführt. Der POI wurde anhand der GFP-Fluoreszenz für FB-GFP oder Alexa 488 für den Anti-HA-Antikörper mit einem Typhoon FLA 9500 (GE Healthcare Life Sciences) unter folgenden Bedingungen nachgewiesen: Anregungswellenlänge 473 nm, LPB-Filter (≥510 nm), 300-V-Photomultiplier-Röhre und 10 µm Pixelgröße. Die unbeschnittenen und unbearbeiteten Western Blots sind in der ergänzenden Abb. 3 zu sehen.

Fluoreszenzerholung nach Photobleichung

Um die Bindungsaffinität von FB an HA-Epitope in lebenden Zellen zu untersuchen, wurden FRAP-Experimente an Zellen durchgeführt, die 24 Stunden vor FRAP transient mit 4 × HA-mCh-H2B (1,25 µg) und FB-GFP (1,25 µg) transfiziert wurden. Die Bilder wurden mit einem konfokalen Olympus IX81 Spinning-Disk-Mikroskop (CSU22-Kopf) aufgenommen, das mit einer Phasor-Photomanipulationseinheit (Intelligent Imaging Innovations) und einem ×100-Ölimmersionsobjektiv (NA 1,40) gekoppelt war. Vor dem Photobleaching wurden 20 bzw. 10 Bilder mit einem Zeitabstand von 1 bzw. 5 s aufgenommen. Die Bilder wurden mit einem 488-nm-Laser (0,77 mW) mit 100 ms Belichtungszeit und anschließend mit einem 561-nm-Laser (0,42 mW) mit 15 ms Belichtungszeit aufgenommen. Die Rotationsscheibe wurde auf eine Rotationsrate von 1 × 1 eingestellt. Nach der Aufnahme von Pre-FRAP-Bildern wurde der p488-nm-Laser (von der Phasor-Einheit für das Photobleaching) mit 17 mW bei 100 ms Belichtungszeit oder 4 mW bei 500 ms Belichtungszeit verwendet, um eine kreisförmige Region im Zellkern zu photobleachen. Nach dem Photobleaching wurden 30 Bilder ohne Verzögerung oder mit 500 ms Verzögerung aufgenommen, und dann wurden 100 Bilder mit einer Verzögerung von 1 s und 100 Bilder mit einer Verzögerung von 5 s mit denselben Bildgebungseinstellungen wie die Bilder vor dem FRAP aufgenommen. Die Fluoreszenzintensität über die Zeit des photobleichten Flecks wurde mit der Slidebook-Software exportiert. Die Fluoreszenzintensität des Zellkerns und des Hintergrunds wurden mit Fiji64 ermittelt, nachdem sie mit dem StackReg Fiji Plugin65 um die Zellbewegung korrigiert worden waren. Die FRAP-Kurve und die Hälfte wurden mit easyFRAP-web66 gemäß den Anweisungen auf der Website erstellt. Abbildung 4b, d wurden mit Mathematica (Wolfram Research) erstellt.

MCP-Reinigung

MCP-HaloTag wurde durch immobilisierte Metall-Affinitätschromatographie gereinigt17. Kurz gesagt wurde der His-markierte MCP-HaloTag durch eine gepackte Ni-NTA-Agarose-Säule (Qiagen) gemäß den Anweisungen des Herstellers mit geringfügigen Änderungen gereinigt. E. coli, das das interessierende Protein exprimiert, wurde in einem PBS-Puffer mit einem vollständigen Satz von Proteaseinhibitoren (Roche) und 10 mM Imidazol lysiert. Das Harz wurde mit PBS-Puffer gewaschen, der 20 und 50 mM Imidazol enthielt. Das Protein wurde dann in einem PBS-Puffer mit 300 mM Imidazol eluiert. Das eluierte His-markierte MCP wurde in einem HEPES-Puffer (10 % Glycerin, 25 mM HEPES pH 7,9, 12,5 mM MgCl2, 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 0,01 % NP-40-Detergens und 1 mM DTT) dialysiert, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 °C gelagert.

Zellvorbereitung für die Verfolgung der naszierenden Kette

Das Reporterplasmid smHA-KDM5B-MS2 (Addgene Plasmid #81085) und das FB-Konstrukt wurden entweder ohne das MCP-HaloTag-Protein transient transfiziert oder mit MCP-HaloTag-Protein in U2OS-Zellen geladen, die 4-6 h vor der Bildgebung auf 35 mm MatTek-Kammern plattiert wurden. Wurde das MCP-HaloTag-Protein mit Beads beladen, wurden die Zellen drei Stunden später mit dem JF646-HaloTag-Liganden angefärbt und anschließend mit phenolrotfreiem DMEM-Medium gewaschen. Wurde kein MCP-HaloTag-Protein benötigt, wurde das Medium der Zellen 3 Stunden nach der Transfektion in phenolfreies komplettes DMEM-Medium gewechselt. Die Zellen waren dann für die Bildgebung bereit.

Für die Multiplex-Bildgebung wurden zwei Reporterplasmide, smHA-KDM5B-MS2 und SunTag-kif18b, sowie zwei Sonden, FB-mCh und Sun-GFP (ohne HA-Epitop), 4-6 Stunden vor der Bildgebung transient in U2OS-Zellen transfiziert, die auf einer MatTek-Kammer plattiert waren. 3 Stunden später wurde das Medium der Zellen durch phenolfreies vollständiges DMEM-Medium ersetzt. Die Zellen waren dann für die Bildgebung bereit.

Bildgebungsbedingungen für Translations- und Kolokalisationsassays

Um einzelne mRNAs und ihren Translationsstatus mit FB abzubilden, wurde ein speziell angefertigtes Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop auf der Grundlage eines schrägen Beleuchtungsschemas (HILO) verwendet17,67. Kurz gesagt, die Anregungsstrahlen, 488, 561, 637 nm Festkörperlaser (Vortran), wurden gekoppelt und außerhalb der Achse auf die hintere Brennebene des Objektivs (APON 60XOTIRF, Olympus) fokussiert. Alle angegebenen Laserleistungen wurden in der Rückfokusebene des Objektivs gemessen. Die Emissionssignale wurden durch einen ultraflachen dichroitischen Spiegel (T660lpxr, Chroma) geteilt. Die längeren Emissionssignale (Fernrot) wurden nach der Aufspaltung durch einen Bandpassfilter (FF01-731/137-25, Semrock) geleitet. Die kürzeren Emissionssignale (rot und grün) wurden nach der Aufspaltung entweder durch einen Bandpassfilter für rot (FF01-593/46-25, Semrock) oder einen Bandpassfilter für grün (FF01-510/42-25, Semrock) geleitet, die in einem Filterrad (HS-625 HSFW TTL, Finger Lakes Instrumentation) installiert waren. Die längeren (fernroten) und die kürzeren (roten und grünen) Emissionssignale wurden von zwei getrennten EM-CCD-Kameras (iXon Ultra 888, Andor) durch Fokussierung mit einem achromatischen 300-mm-Doublettenobjektiv (AC254-300-A-ML, Thorlabs) erfasst. Die Kombination aus ×60-Objektiv von Olympus, 300-mm-Tubuslinse und iXon Ultra 888 ergibt ×100-Bilder mit 130 nm Pixel-1. Ein Aufsatzinkubator für Temperatur (37 °C), Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2 (Okolab) ist auf einem piezoelektrischen Tisch (PZU-2150, Applied Scientific Instrumentation) für die Lebendzellbildgebung ausgestattet. Die Laser, die Kameras, der piezoelektrische Tisch und das Filterrad wurden von einem Open-Source-Mikrocontroller, dem Arduino Mega Board (Arduino), synchronisiert. Die Bildaufnahme wurde mit der Open-Source-Software Micro-Manager (1.4.22)68 durchgeführt.

Die Bildgröße wurde auf 512 × 512 Pixel2 (66,6 × 66,6 µm2) in der Mitte eingestellt, und die Integrationszeit der Kamera wurde auf 53,64 ms festgelegt. Die Auslesezeit der Kameras aus der Kombination unserer Abbildungsgröße, des Auslesemodus (30 MHz) und der vertikalen Verschiebungsgeschwindigkeit (1,13 µs) betrug 23,36 ms, was zu unserer Abbildungsrate von 13 Hz (70 ms pro Bild) führte. Rote und grüne Signale wurden abwechselnd abgebildet. Die Position des Emissionsfilters wurde während der Auslesezeit der Kamera geändert. Um das Durchscheinen zu minimieren, wurde das ferne rote Signal gleichzeitig mit dem grünen Signal abgebildet. Um die gesamte Dicke der Zellen zu erfassen, wurden 13 z-Stapel mit einer Schrittweite von 500 nm (insgesamt 6 µm) mit dem piezoelektrischen Tisch aufgenommen. Daraus ergab sich eine Gesamtzellabbildungsrate von 1 Hz für die Abbildung entweder roter oder grüner Signale und 0,5 Hz für die Abbildung sowohl roter als auch grüner Signale unabhängig von der Fernrotabbildung.

Für die Abbildungen 1c, d, 2a, e wurde eine einzelne Zellebene kontinuierlich mit 6,5 Hz für 100 Zeitpunkte abgebildet und über die Zeit gemittelt (Laser: 488 nm, 130 µW; 561 nm, 4 µW (Abb. 1c), 90 µW (Abb. 1d), 19 µW (Abb. 2a), 155 µW (Abb. 2e); 637 nm, 220 µW). In Abb. 2b (links) wurde die Zelle kontinuierlich mit 0,5 Hz, 488 nm (100 µW) und 561 nm (10 µW) Lasern mit 13 z-stacks zu jedem Zeitpunkt abgebildet und über die Zeit gemittelt. Die 13 gemittelten z-Stapel wurden mit Fiji dekonvolviert. In Abb. 6b, c, e und f wurden die Zellen alle 10 s mit 13 Z-Stapeln pro Zeitpunkt abgebildet (Laser: 488 nm, 13 µW (Abb. 6b), 18 µW (Abb. 6c); 561 nm, 172 µW (Abb. 6f); 637 nm, 150 µW (Abb. 6b, c), 35 µW (Abb. 6e)). In Abb. 7b wurde die Zelle kontinuierlich bei 0,5 Hz mit 13 Z-Stapeln pro Zeitpunkt abgebildet (Laser: 488 nm, 130 µW; 561 nm, 172 µW). In Abb. 8b wurden die Zellen alle 14 s mit 13 Z-Stapeln zu jedem Zeitpunkt abgebildet (Laser: 488 nm, 70 µW). In Abb. 8c wurden die Zellen alle 40 Sekunden mit 13 Z-Stapeln pro Zeitpunkt aufgenommen (Laser: 488 nm, 130 µW). Für die Bestimmung der Geschwindigkeit der motorisierten Translationsflecken (Abb. 8e) wurden die Neuronen kontinuierlich mit 1 Hz und 13 z-Stapeln pro Zeitpunkt abgebildet.

Für Abb. 2b (rechts) und 2c wurde die Ko-Lokalisierung mit dem zuvor beschriebenen konfokalen Olympus IX81 Spinning-Disk-Mikroskop (CSU22-Kopf) mit einem ×100-Ölimmersionsobjektiv (NA 1,40) unter den folgenden Bedingungen abgebildet: 488 nm (0,77 mW) und 561 nm (0,42 mW) sequentielle Bildgebung für fünf Zeitpunkte ohne Verzögerung mit mehreren z-Schichten, um den gesamten Zellkörper für jeden Zeitpunkt abzudecken, 1 × 1 Spin-Rate, Belichtungszeit angepasst an die Zellhelligkeit. Die Bilder wurden mit einer Photometrics Cascade II CCD-Kamera unter Verwendung der SlideBook-Software (Intelligent Imaging Innovations) aufgenommen. Die in den Abbildungen gezeigten Bilder wurden durch Mittelung von fünf Zeitpunkten erzeugt, und dann wurde mit Fiji64 eine Maximalprojektion aller z-Scheiben durchgeführt.

Partikelverfolgung von Translationsstellen

Die Erkennung und Verfolgung einzelner Translationsstellen wurde auf Bildern der Maximalintensitätsprojektion mit einem benutzerdefinierten Mathematica (Wolfram Research) Code17 durchgeführt. Die Bilder wurden mit einem Bandpassfilter bearbeitet, um die Partikel hervorzuheben, und dann binarisiert, um ihre Intensitätsmittelpunkte als Positionen mit der integrierten Mathematica-Routine ComponentMeasurements zu erkennen. Die erkannten Partikel wurden verfolgt und über eine Suche nach dem nächsten Nachbarn zeitlich verknüpft. Die genauen Koordinaten (superaufgelöste Positionen) von mRNAs und Translationsstellen wurden durch Anpassung (mit der integrierten Mathematica-Routine NonlinearModelFit) der Originalbilder an 2D-Gaußkurven der folgenden Form bestimmt:

wobei IBG die Hintergrundfluoreszenz, I die Partikelintensität, (x0, y0) die Partikelposition und (σx, σy) die Spreizung der Partikel ist. Der Versatz zwischen den beiden Kameras wurde mit der eingebauten Mathematica-Routine FindGeometricTransform registriert, um die Transformationsfunktion zu finden, die die angepassten Positionen der Tetraspeck-Perlen mit einem Durchmesser von 100 nm gleichmäßig über das Bildfeld verteilt am besten ausrichtete.

Für die Abbildungen 6c, e, f, 7c, 8b, d wurden die Partikel mit einem benutzerdefinierten Mathematica-Code verfolgt und mit Mathematica aufgezeichnet. Für Abb. 7c wurden die durchschnittlichen mittleren quadratischen Verschiebungen aus den Gauß-angepassten Koordinaten (aus 2D-Projektionsbildern mit maximaler Intensität) berechnet. Die Diffusionskonstante wurde durch Anpassung der ersten fünf Zeitpunkte an eine Linie mit der Steigung m = 4D ermittelt, wobei D der Diffusionskoeffizient ist. Die einzelnen motorisierten Translationsflecken (Abb. 8e) wurden mit dem Fiji-Plugin TrackMate69 nach der Maximalprojektion verfolgt und mit Mathematica aufgezeichnet. Der gesamte Mathematica-Code ist auf Anfrage erhältlich.

Einzelmolekülverfolgung von 1×HA-markierten Proteinen in Zellen

Am Tag vor der Bildgebung wurden die Zellen auf MatTek-Kammern plattiert und transient mit 1 × HA-mCh-H2B und FB-Halo unter Verwendung des LipofectamineTM LTX-Reagenz mit dem PLUS-Reagenz (Invitrogen) gemäß den Anweisungen des Herstellers transfiziert. 3 Stunden nach der Transfektion wurde das Medium zu vollständigem DMEM gewechselt. Vor der Bildgebung wurden die Zellen mit dem mit Natriumborhydrid (NaBH4) behandelten Halo-Liganden TMR (Promega)45 gefärbt. Kurz gesagt wurde 1 µL des 1 mM Halo-Ligand-TMR-Farbstoffs 10 Minuten lang in 200 µL einer 50 mM NaBH4-Lösung (10 Minuten lang in PBS, pH 7,4, vorgelöst) reduziert. Anschließend wurden 200 µL des reduzierten TMR mit 800 µL phenolrotfreiem DMEM verdünnt, um 1 mL reduziertes TMR-Medium herzustellen. Das Medium der transfizierten Zellen wurde durch das reduzierte TMR-Medium ersetzt, und die Zellen wurden dann für 30 Minuten zur Färbung in einen Inkubator (5 % CO2, 37 °C) gestellt. Die Zellen wurden dann dreimal mit phenolrotfreiem DMEM gewaschen. Zwischen den Waschvorgängen wurden die Zellen 5 Minuten lang in einem Inkubator (5 % CO2, 37 °C) bebrütet.

Die Zellen wurden mit einem speziell angefertigten Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop mit schräger Beleuchtung (HILO) abgebildet17,67. Das Bildfeld wurde auf 256 × 256 Pixel2 (33,3 × 33,3 µm2) und die Integrationszeit der Kamera auf 30 ms eingestellt. Die Zellen wurden mit einem 7,7 mW 561 nm-Laser bei einer Bildgebungsrate von 43,8 ms pro Bild für insgesamt 10.000 Zeitpunkte (7,3 min) abgebildet. Während der Bildgebung wurde alle 10 s ein 6,2 mW 405 nm-Laser für 50 ms eingeschaltet, um den reduzierten Halo-TMR-Liganden zu photoaktivieren. Einzelne Moleküle wurden mit dem Fiji-Plugin TrackMate69 verfolgt. Um sicherzustellen, dass die Spuren FB-Halo an 1 × HA-mCh-H2B gebunden darstellen, wurden die Spuren in Mathematica weiter gefiltert. Der Filter eliminierte Spuren mit einer Länge von weniger als 16 Frames. Außerdem mussten alle Sprünge zwischen den Bildern kleiner als 220 nm sein. Dieses Kriterium wurde bereits von anderen verwendet, um Transkriptionsfaktoren, die an Chromatin gebunden sind, von denen zu unterscheiden, die nicht gebunden sind46. Schließlich wurden die Spuren in Mathematica entweder nach der Zeit, zu der sie aufgenommen wurden (wie in der ergänzenden Abb. 5), oder nach der durchschnittlichen Sprunggröße zwischen den Einzelbildern (wie in Abb. 5) farbkodiert.

Puromycin-Behandlung

U2OS-Zellen, die vorübergehend mit smHA-KDM5B-MS2 und FB transfiziert wurden, oder mit smHA-KDM5B-MS2, FB und MCP-HaloTag beladene Beads wurden wie oben beschrieben mit 10 Sekunden Abstand zwischen den Einzelbildern aufgenommen. Nach der Aufnahme von 5 oder 10 Zeitpunkten als Vorbehandlungsbilder wurden die Zellen unmittelbar vor der Aufnahme des 6. oder 11. Zeitpunkts mit einer Endkonzentration von 0,1 mg mL-1 Puromycin behandelt. Nach der Zugabe von Puromycin wurden die Zellen unter den gleichen Bedingungen wie bei der Vorbehandlung abgebildet, bis die Translationsflecken verschwanden.

Neuronenkultur und Transfektion

Die kortikalen Neuronen der Ratte wurden aus den verworfenen Kortices von Föten am Embryonaltag (E)18 gewonnen, die zuvor zur Gewinnung des Hippocampus seziert worden waren, und in Neurobasal-Medium (ThermoFisher Scientific) mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS, Atlas Biologicals) und 10 % Dimethylsulfoxid (Sigma-Aldrich, D8418) in flüssigem Stickstoff eingefroren. Kryokonservierte kortikale Rattenneuronen wurden in einer Dichte von ∼15.000-30.000 Zellen pro cm2 auf MatTek-Schalen (MatTek) plattiert und in Neurobasal-Medium mit 2 % B27-Zusatz (ThermoFisher Scientific), 2 mM l-Alanin/l-Glutamin und 1 % FBS (Atlas Biologicals) kultiviert. Transfektionen wurden nach 5-7 Tagen in der Kultur mit Lipofectamine 2000 (ThermoFisher Scientific) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Neuronen, die 4 × HA-mRuby-Kv2.1 und FB-GFP ko-exprimieren, wurden 1-2 Tage nach der Transfektion abgebildet (Abb. 2b). Neuronen, die smHA-Kv2.1 und FB-GFP ko-exprimieren, wurden 1-7 Tage nach der Transfektion abgebildet (ergänzende Abb. 2 links). Für Translationsassays wurden die Neuronen 4-12 Stunden nach der Transfektion abgebildet. Alle Neuronen-Imaging-Experimente wurden in einer temperaturkontrollierten (37 °C), befeuchteten, 5% CO2-haltigen Umgebung in Neurobasal-Medium ohne Phenolrot (ThermoFisher Scientific) durchgeführt. Die Identität der Neuronen wurde bestätigt, indem die vom Zellkörper ausgehenden Prozesse über Hunderte von Mikrometern verfolgt wurden, um sicherzustellen, dass es sich um echte Neuriten handelte.

Überwachung der Zebrabärbling-Entwicklung

Alle Zebrabärbling-Experimente wurden vom Tokyo Tech Genetic Experiment Safety Committee (I2018001) genehmigt, und der Umgang mit den Tieren wird gemäß den Richtlinien durchgeführt. Um FB-GFP im Zebrafischembryo sichtbar zu machen, wurden mRNAs für FB-GFP und N × HA-mCh-H2B hergestellt. DNA-Fragmente, die FB-GFP und N × HA-mCh-H2B kodieren, wurden in ein Plasmid eingefügt, das den T7-Promotor und poly A70 enthält. Die nachfolgenden Plasmide (T7-FB-GFP und T7-N × HA-mCh-H2B) wurden mit der XbaI-Restriktionsstelle für die In-vitro-Transkription mit dem mMESSAGE mMACHINE-Kit (ThermoFisher Scientific) linearisiert. Die RNA wurde mit dem RNeasy Mini Elute Cleanup Kit (QIAGEN) gereinigt und in Wasser resuspendiert. Vor der Mikroinjektion wurden Zebrabärblingeier (AB) durch Einweichen in 2 mg mL-1 Pronase (Sigma Aldrich; P5147) in 0,03 % Meersalz für 10 Minuten dechorionisiert. Eine Mischung (~0,5 nL) mit mRNA (jeweils 200 pg für FB-GFP und N × HA-mCh-H2B) wurde in den Dotter (in der Nähe des Zellteils) von Embryonen im 1-Zell-Stadium injiziert. Für eine Negativkontrolle wurde die HA-mCh-H2B-mRNA weggelassen. 5-10 Minuten nach der mRNA-Injektion wurde ein Cy5-markierter Fab, der spezifisch für die endogene Histon H3 Lys9-Acetylierung (CMA310)25 ist, injiziert (100 pg in ~0,5 nL). Die injizierten Embryonen wurden bei 28 °C bis zum Vier-Zell-Stadium inkubiert und in 0,5 % Agarose (Sigma Aldrich, A0701) in 0,03 % Meersalz eingebettet, wobei das Tier mit dem Pol nach unten auf einer 35-mm-Glasbodenschale (MatTek) lag. Die Fluoreszenzbilder wurden mit einem konfokalen Mikroskop (Olympus; FV1000) aufgenommen, das mit einem auf 28 °C eingestellten Heiztisch (Tokai Hit) und einem UPLSAPO ×30 Silikonöl-Immersionsobjektiv (NA 1,05) ausgestattet war und mit der integrierten FV1000-Software FLUOVIEW ver.4.2 betrieben wurde. Drei Farbbilder wurden nacheinander alle 5 Minuten mit Lasern von 488, 543 und 633 nm (640 × 640 Pixel; 0,662 µm Pixel-1, Lochblende 800 μm; 2,0 μs Pixel-1) ohne Mittelwertbildung aufgenommen. Projektionen mit maximaler Intensität wurden aus 20 z-Stapeln mit 5 μm erstellt.

Kerne in Zebrafisch-Embryonen wurden in 4D mit dem Fiji-Plugin TrackMate69 verfolgt. Die Ergebnisse wurden mit Mathematica nachbearbeitet und aufgezeichnet. Um die Anzahl und Fläche der Kerne und die durchschnittliche Kern-, Zytoplasma- und Kern:Zytoplasma-Intensität im Zeitverlauf zu quantifizieren, wurde die Intensität aller Kerne in Projektionen mit maximaler Intensität mit der integrierten Mathematica-Funktion ComponentMeasurements gemessen. ComponentMeasurements erfordert binäre Masken der zu messenden Objekte. Binäre Masken der Zellkerne wurden mit der integrierten Mathematica-Funktion Binarize mit einem geeigneten Intensitätsschwellenwert erstellt, um nur die Zellkerne in Bildern von Cy5-markiertem Fab (spezifisch für endogene Histon H3 Lys9-Acetylierung) hervorzuheben. Die Masken des Zytoplasmas um die Kerne wurden erstellt, indem die Kernmasken um 4 Pixel erweitert wurden (mit dem eingebauten Befehl Dilation) und dann von der erweiterten Maske die ursprünglichen, um 1 Pixel erweiterten Kernmasken subtrahiert wurden. Auf diese Weise entstehen ringförmige Masken um jeden Kern, aus denen die durchschnittliche zytoplasmatische Intensität gemessen wurde.

Oberflächenplasmonenresonanz

Die Bindungskinetik von gereinigtem FB an das HA-Epitop-Tag wurde mittels Oberflächenplasmonenresonanz (OpenSPR, Nicoyalife) gemessen. Nachdem das mit Biotin markierte HA-Peptid von einem Streptavidin-Sensorchip (Nicoyalife) eingefangen worden war, wurde verdünntes gereinigtes FB-GFP in PBS-Laufpuffer, pH 7,4, 5 Minuten lang langsam über den Sensorchip fließen gelassen, um eine Interaktion zu ermöglichen. Der Laufpuffer wurde dann 10 Minuten lang fließen gelassen, um die Dissoziationsdaten zu sammeln. Die unspezifische Bindungskurve wurde ermittelt, indem dieselbe Konzentration von FB-GFP in demselben Puffer über einen anderen Streptavidin-Sensorchip (Nicoyalife) geleitet wurde. Die Daten der Kontrolle wurden genau wie im Experiment erfasst. Bei 100 und 30 nM FB-GFP war die Bindungsreaktion deutlich höher als bei der Kontrolle, wobei die nicht-spezifische Bindungsinteraktion vernachlässigbar war. Daher wählten wir diese beiden Konzentrationen für die Anpassung der Bindungskinetik. Nach Abzug der Kontrolle ergab sich die Kurve der Signalantwort im Vergleich zur Zeit, wie in der ergänzenden Abb. 4 dargestellt. Die Parameter der Bindungskinetik wurden durch Anpassung der Kurve an ein Eins-zu-Eins-Bindungsmodell mit der Software TraceDrawer (Nicoyalife) ermittelt (siehe ergänzende Abb. 4).

Zusammenfassung der Berichterstattung

Weitere Informationen zum Forschungsdesign sind in der Nature Research Reporting Summary verfügbar, die mit diesem Artikel verlinkt ist.