IFN-γ-ELISpot-Assay-Optimierung nach PBMC-Stimulation mit T-aktivierten® IE-1 und pp65 CMV-Antigenen

Für den ELISpot-Assay wurden frisch isolierte PBMC verwendet. Um einen Verlust der T-Zell-Funktionalität, z. B. durch aktivierte Granulozyten, zu vermeiden, wurden heparinisierte Blutproben ohne weitere Zusätze innerhalb von 8 Stunden verarbeitet. Für die Entwicklung des ELISpot-Assay-Protokolls wurde eine Gesamtzahl von 2 × 105 PBMC pro Vertiefung gewählt, da diese Zellzahl unterhalb der Konfluenz liegt und normalerweise aus Proben von weniger als 15 ml Vollblut gewonnen werden kann. Das CMV-Immediate-Early-Protein IE-1 und das Late-Tegument-Protein pp65 sind gut charakterisierte immundominante T-Zell-Antigene. IE-1 in voller Länge und ein C-terminales Fragment von pp65 mit 181 Aminosäuren wurden hergestellt und in Gegenwart von Harnstoff (T-activation®) formuliert, um ihre stimulierende Kapazität für verschiedene Arten von CMV-reaktiven Effektorzellen der zellvermittelten Immunität zu erhöhen. Die optimale T-activated®-Antigenkonzentration wurde zunächst durch Dosis-Wirkungs-Experimente ermittelt. Frisch isolierte PBMC eines gesunden CMV-seropositiven Spenders wurden mit 31,6 fg/ml bis 31,6 μg/ml T-activated® pp65 oder mit 0,01 bis 31,6 μg/ml T-activated® IE-1 stimuliert, und die Anzahl der IFN-γ sezernierenden Zellen wurde mittels IFN-γ ELISpot bestimmt. T-activated® pp65 zeigte eine viel stärkere Fähigkeit, IFN-γ sezernierende Effektorzellen zu stimulieren als T-activated® IE-1 und erreichte ein Plateau der Ansprechbarkeit zwischen 0,316 und 3,16 ng/ml pp65 gegenüber etwa 31,6 μg/ml für IE-1 (Abb. 1). Dementsprechend wurden T-activated®-Antigenkonzentrationen von 3 μg/ml pp65 und 15 μg/ml IE-1 für weitere PBMC-Stimulationen und ELISpot-Assays ausgewählt.

Die Sensitivität und Spezifität des Tests wurden bestimmt, indem PBMC, die von jeweils 10 CMV-seropositiven und CMV-seronegativen gesunden Spendern isoliert wurden, mit den definierten pp65- und IE-1 T-activated®-Antigenkonzentrationen stimuliert wurden. Die Anzahl der reaktiven Effektorzellen wurde mittels IFN-γ-ELISpot quantifiziert. Eine signifikante Stimulation wurde mit einem Mann-Whitney U-Test als statistisch signifikanter Unterschied zwischen den SFC-Werten der nicht stimulierten und der CMV-Antigen-stimulierten Bedingungen (jeweils in vierfacher Ausführung) definiert. T-activated® pp65 und IE-1 induzierten eine signifikante Aktivierung von reaktiven Effektorzellen in 10 von 10 bzw. 9 von 10 PBMC-Präparaten von einzelnen CMV-seropositiven Spendern (Abb. 2). In diesem Kollektiv zeigte T-activated® pp65 mit einem Median von 399 SFC/200.000 PBMC (Bereich 12-864 SFC/200.000 PBMC) eine insgesamt größere Kapazität zur Aktivierung ansprechender Zellen, verglichen mit T-activated® IE-1 mit einem Median von 26 SFC/200.000 PBMC (Bereich 1,3-96 SFC/200.000 PBMC). Dennoch wurde in einzelnen Proben CMV-seropositiver Spender ein deutliches Ansprechen von bis zu 96 SFC/200.000 PBMC auf T-activated® IE-1 festgestellt (Abb. 2). Alle 10 PBMC-Proben (100%) von verschiedenen CMV-seronegativen Spendern zeigten negative Testergebnisse nach Stimulation mit pp65 (Median 0,3 SFC/200.000 PBMC; Bereich 0-2,8), während 9 von 10 (90%) PBMC-Proben von CMV-seronegativen Personen nach Stimulation mit IE-1 negativ waren (Median 2,9 SFC/200.000 PBMC; Bereich 0,3-6,8). Die Fleckenzahl in CMV-seronegativen IE-1-stimulierten PBMC war höher als in CMV-seronegativen pp65-stimulierten PBMC, überstieg jedoch nicht 7 SFC/200.000 PBMC (Abb. 2).

IFN-γ wird nachweislich während der Antigenstimulation kontinuierlich sezerniert. Daher ist die Signalintensität im IFN-γ-ELISpot abhängig von der Dauer der Stimulation. Die in der Literatur angegebene Dauer der Antigenstimulation im IFN-γ-ELISpot liegt normalerweise zwischen 16 und 24 Stunden. Um den Einfluss der Inkubationszeit auf die Testergebnisse zu untersuchen, wurden IFN-γ-ELISpot an PBMC von drei unabhängigen CMV-seropositiven gesunden Spendern nach Stimulation mit T-aktivierten® pp65- und IE-1-Antigenen für 17, 19 und 21 Stunden durchgeführt. Es wurden keine statistisch signifikanten Unterschiede in den SFC-Zahlen zwischen den drei Bedingungen festgestellt (Abb. 3), was die Signalstabilität in diesem Zeitbereich belegt. Daher wurde für den optimierten ELISpot-Test eine Inkubationszeit von 19 h gewählt.

Zahlreiche Protokollvariablen können die ELISpot-Testergebnisse beeinflussen. So enthält das für die Primärzellkultur verwendete Medium häufig Serum, das verschiedene chargenabhängige, nicht charakterisierte bioaktive Moleküle in unterschiedlichen Konzentrationen enthält. Um standardisierte Zellkulturbedingungen zu definieren, wurden die Auswirkungen verschiedener serumhaltiger Medien (RPMI 1640, ergänzt mit 5 % FCS, humanem AB, synthetischem NTA oder synthetischem NTS) und serumfreier Medien (AIM-V®, UltraCulture) auf die Testleistung untersucht. Serumfreie Medien erbrachten die besten Effektorzellreaktionen, vergleichbar mit denen von RPMI 1640, ergänzt mit 5 % FCS (Abb. 4a). Darüber hinaus wies AIM-V® unter unstimulierten Bedingungen die geringsten Hintergrundsignale auf (Abb. 4b), wodurch das Signal-Rausch-Verhältnis maximiert wurde. Folglich wurde das ELISpot-Protokoll unter Verwendung von AIM-V® serumfreiem Medium weiter etabliert.

ELISpot-Assays können mit verschiedenen Membranmaterialien durchgeführt werden, darunter Nitrocellulose (NC), gemischter Celluloseester (MCE) und Polyvinylidenfluorid (PVDF). Wir verglichen die IFN-γ-ELISpot-Ergebnisse von PBMC-Proben von sechs gesunden Personen (jeweils vier Wiederholungen, zwei Präparate pro Spender) unter Verwendung der am häufigsten verwendeten MCE-Platten, PVDF-Platten und PVDF-Streifen von Millipore (Merck Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland). PVDF-Membranen erfordern vor der Bindung des Fängerantikörpers einen Aktivierungsschritt mit Ethanol. Darüber hinaus waren bei PVDF-basierten Platten im Vergleich zu MCE-Platten strengere Waschschritte vor der Spotentwicklung erforderlich, um eine unerwünschte Hintergrundfärbung der Membranen zu vermeiden. Nichtsdestotrotz war die Auflösung der detektierten Spots in Bezug auf Schärfe und Homogenität auf PVDF-Membranen besser (nicht gezeigt), was zu einer höheren Spotanzahl im Vergleich zu MCE-Membranen führte (bis zu 10-mal mehr im Fall von IE-1-Stimulationen, mit einer medianen SFC von 155 bzw. 13/200.000 PBMC; Abb. 5). Da PVDF 8-Well-Streifen leistungsfähiger waren und ihre Verwendung eine Kostenreduzierung ermöglichen könnte, insbesondere wenn einzelne Patientenproben in der klinischen Routine getestet werden, wurde das PVDF 8-Well-Streifenformat für die optimierte Assayentwicklung gewählt.

Die optimale Beschichtung der Mikrotiterplatten mit dem Capture-Antikörper ist entscheidend für eine robuste Testleistung. Die Dichte des an die PVDF-Membran gebundenen IFN-γ-Fängerantikörpers sollte nicht limitierend sein und insbesondere die zuverlässige Detektion hoher Spotzahlen ermöglichen. PVDF-Streifen wurden mit steigenden Konzentrationen (2,5 bis 7,5 μg/ml) des Anti-IFN-γ-Antikörpers beschichtet. PBMC von fünf CMV-seropositiven Spendern wurden in die beschichteten Vertiefungen ausgesät und entweder unstimuliert gelassen oder mit T-activated® IE-1 oder pp65 stimuliert. Im Bereich von 2,5 bis 7,5 μg/ml hatten steigende Antikörperkonzentrationen keine Auswirkung auf die Hintergrundfärbung in unstimulierten PBMC (mediane SFC von 0 bis 0,5/200.000 PBMC unabhängig von der IFN-γ-Fangantikörperkonzentration; Abb. 6a-b). In ähnlicher Weise waren die IE-1-spezifischen niedrigen bis mittleren SFC-Werte (Mediane von 19 bis 26 SFC/200.000 PBMC) in allen Beschichtungsantikörper-Bedingungen vergleichbar (Abb. 6a). Dasselbe galt für pp65-spezifische Reaktionen bis zu ~300 SFC/200.000 PBMC (Spender d032, d120 und d241; Abb. 6c). Im Gegensatz dazu nahm bei einzelnen Spendern mit höheren Spotzahlen (z. B. d172, d202; Abb. 6c) der Nachweis von pp65-reaktiven Zellen dosisabhängig mit der Konzentration des IFN-γ-Fangantikörpers zu, der für die Beschichtung verwendet wurde, insbesondere zwischen 2,5 und 5 μg/ml Antikörper. Bei Antikörperkonzentrationen von 5 μg/ml und mehr blieb die Anzahl der Flecken stabil (Abb. 6b-c). Aufgrund dieser Ergebnisse wurde eine Konzentration von 5 μg/ml IFN-γ-Fangantikörper für die Beschichtung im optimierten ELISpot-Protokoll gewählt.

ELISpot-Assays beruhen auf dem Nachweis des eingefangenen Zytokins durch zytokinspezifische Antikörper, die entweder direkt an ein Reporterenzym (einstufige Assay-Entwicklung), wie alkalische Phosphatase (AP), oder an eine Kombination aus einem biotinylierten Sekundärantikörper und einem Streptavidin-konjugierten Reporterenzym (zweistufige Assay-Entwicklung) gekoppelt sein können. Eine einstufige Assayentwicklung spart Zeit bei der Handhabung und verhindert Bedienerfehler. AP-konjugierter mAb (7-B6-1) (MicroCoat Biotechnologie GmbH, Bernried, Deutschland) wurde als Detektionskonjugat für das standardisierte ELISpot-Protokoll verwendet. Es wurden verschiedene Inkubationsparameter (z. B. 0,5 – 3 h bei 37 °C, 2 h bei Raumtemperatur) getestet. Die Spotanzahl war unter allen Bedingungen vergleichbar. Die Spotmorphologie und damit die korrekte Detektion war jedoch bei einer Inkubation mit dem AP-Konjugat für 2 h bei RT am besten, verglichen mit den anderen Bedingungen (nicht gezeigt). Eine Erhöhung der Konzentration des Detektionskonjugats von 0,025 auf 0,4 U/ml führte zu leicht erhöhten SFC-Medianwerten für pp65, und die maximale Spotanzahl übertraf die der zweistufigen Assayentwicklung (nicht gezeigt). Daher wurde eine einstufige Assayentwicklung für 2 Stunden bei RT mit 0,4 U/ml Detektionskonjugat gewählt.

Schließlich wurde die Standardisierung der SFC-Färbereaktion in Angriff genommen, um die Assayoptimierung abzuschließen. Die Dauer der Inkubation mit dem AP-Substrat wirkt sich auf die Spotgröße und/oder den Hintergrund aus und ist daher für eine zuverlässige Spotauszählung entscheidend. Als Färbelösung wurde ein einstufiges chromogenes alkalisches Phosphatasesubstrat NBT/BCIP (Thermo Fischer Scientific, Waltham, USA) verwendet, und es wurden Inkubationszeiten von 2 bis 13 Minuten in der Dunkelheit untersucht. Die SFC-Zahlen waren unter allen Bedingungen vergleichbar. Kürzere Inkubationszeiten führten jedoch zu kleineren Fleckendurchmessern, während längere Inkubationszeiten den Hintergrund erhöhten (Daten nicht gezeigt). Daher wurde für das optimierte ELISpot-Protokoll eine Färbedauer von sechs Minuten im Dunkeln festgelegt.

Linearität und Präzision des optimierten CMV-ELISpot-Assays

Das optimierte ELISpot-Protokoll wurde verwendet, um den Arbeitsbereich von PBMC zu bestimmen, der die Linearität des Assays gewährleistet. PBMC von einem gesunden CMV-seropositiven Spender wurden in einer Dichte von 2 × 104 bis 2,5 × 105 PBMC pro Vertiefung ausgesät. Bei Zellzahlen zwischen 6 × 104 und 2 × 105 PBMC pro Vertiefung waren die ELISpot-Zahlen direkt proportional zur Anzahl der ausgesäten PBMC nach Stimulation entweder mit IE-1 (lineare Regressionsanalyse; R2 = 0,97) oder pp65 (R2 = 0,99) (Abb. 7a). Aufgrund der in der Regel niedrigeren Spotanzahl nach Stimulation mit IE-1 wurde für den standardisierten ELISpot-Assay die Verwendung von 2 × 105 PBMC pro Vertiefung gewählt, um ausreichende SFC-Werte zu gewährleisten.

Um die Linearität zwischen der Anzahl der CMV-reaktiven Effektorzellen und der gezählten SFC weiter zu überprüfen, wurde eine zunehmende Anzahl von PBMC von einem CMV-seropositiven gesunden Spender ausgesät und die Gesamtzahl der PBMC mit PBMC von einem CMV-seronegativen Spender auf 2 x 105 pro Vertiefung eingestellt. Zwei Spenderpaare (d034 + d219, d204 + d067), die in einer 19-stündigen Co-Kultur keine Allo-Reaktivität zeigten, wurden für diese Experimente ausgewählt. Aufgrund der niedrigen SFC-Zahlen (unter 20 SFC/200.000 PBMC) wiesen die Ergebnisse der IE-1-Stimulation im Vergleich zu pp65 eine erhöhte Variabilität auf und erlaubten keine zuverlässige Linearitätsberechnung (R2-Werte unter 0,96; Daten nicht gezeigt). Die ELISpot-Assay-Ergebnisse nach pp65-Stimulation zeigten eine gute lineare Korrelation für beide Spenderpaare, mit R2-Werten von 0,99 (d034 + d219) und 0,98 (d204 + d067) in der linearen Regressionsanalyse (Abb. 7b).

Präzision und Wiederholbarkeit des optimierten Assays wurden durch Berechnung der Intra-Assay-, Inter-Assay-, Inter-Operator- und Inter-Site-Variabilität bewertet. In jedem Fall wurden PBMC von drei CMV-seropositiven gesunden Spendern in vierfacher Ausführung getestet, und die Variabilität wurde durch Berechnung des Variationskoeffizienten (CV) bewertet, der als das Verhältnis der Standardabweichung zum Mittelwert definiert ist. Der CV für ELISpot-Werte < 10 SFC/200.000 PBMC wurde nicht berechnet (siehe Berechnung des Positivitäts-Cut-offs unten). Der Intra-Assay-Variationskoeffizient erreichte 14 % für die IE-1-Stimulation und 6 % für die pp65-Stimulation (Zusätzliche Datei 1: Tabelle S1). Der CV inter-assay lag bei IE-1 unter 17 % und bei pp65 unter 22 % (Zusätzliche Datei 1: Tabelle S2). Der Variationskoeffizient zwischen den Operatoren lag bei IE-1 und pp65 unter 13 % bzw. 18 % (Zusätzliche Datei 1: Tabelle S3). Schließlich wurde die Variation zwischen den Standorten, die für die Assay-Validierung zu diagnostischen Zwecken wesentlich ist, bewertet. Vollblutproben wurden gleichzeitig von drei CMV-seropositiven gesunden Spendern entnommen und (unter konstanten Bedingungen bei RT) an vier verschiedene Labore in Deutschland versandt. Die PBMC wurden frisch isoliert und die ELISpot-Assays gemäß dem optimierten Protokoll von insgesamt 7 Mitarbeitern durchgeführt. Der CV zwischen den Standorten erreichte ein Maximum von 39 % für IE-1 und von 28 % für pp65 (Additional File 1: Table S4).

Um statistisch signifikante ELISpot-Ergebnisse zu erzielen, wurde die Auswertung von mindestens vier unabhängigen Messungen empfohlen. Um den Einfluss von Intra-Replikat-Variationen auf das Testergebnis zu untersuchen, verglichen wir die ELISpot-Ergebnisse von Fünffach- und Vierfachmessungen jeder Kontrolle und Antigenstimulation. Es wurde keine signifikante Abweichung der Testergebnisse festgestellt (Daten nicht gezeigt). Daher ermöglichen vierfache Messungen von unstimulierten und T-aktivierten® IE-1- und pp65-stimulierten Bedingungen die Zuverlässigkeit des Tests sowie die Praktikabilität in Kombination mit der Verwendung von 8-Well-Streifen.

Staphylococcal Enterotoxin B (SEB) ist ein starkes Superantigen und Phytohämagglutinin (PHA) ein starkes Mitogen, die beide eine massive IFN-γ-Sekretion durch T-Zellen induzieren. SEB und PHA sind daher geeignete Positivkontrollen für die Lebensfähigkeit der Zellen, die erfolgreiche Stimulierung der Zytokinsekretion und die allgemeine Funktionalität der T-Zellen. Dies ist besonders wichtig für die Interpretation der Ergebnisse, wenn eine niedrige T-Zell-Frequenz erwartet wird, z. B. bei Empfängern einer allogenen Stammzelltransplantation. Bei dem optimierten ELISpot-Assay werden die Testproben entweder mit SEB oder PHA in zweifacher Ausführung stimuliert.

Zusätzlich wurde eine von Effektorzellen unabhängige Bedienerkontrolle eingerichtet, um die ordnungsgemäße Durchführung des Assays zu überprüfen. Diese Bedienerkontrolle basiert auf dem Nachweis von rekombinantem IFN-γ bei direkter Inkubation mit dem immobilisierten Anti-human-IFN-γ-mAbfangantikörper (1-D1K). Diese Kontrolle, die ebenfalls in zweifacher Ausführung durchgeführt wird, sollte eine homogene Dunkelfärbung der PVDF-Membran ergeben.

Technische Assay-Validierung: Definition eines Positivitäts-Cut-off

Um die Interpretation der Ergebnisse des IFN-γ-ELISpot-Assays zu erleichtern und die Spezifität zu maximieren (d. h. falsch-positive Ergebnisse unter unstimulierten Bedingungen und unter stimulierten Bedingungen bei CMV-seronegativen Personen zu vermeiden), wurde ein technischer Cut-off definiert. IFN-γ-ELISpot-Assays wurden nach dem optimierten Protokoll an PBMC von 45 gesunden Spendern durchgeführt, von denen 32 CMV-IgG-seropositiv waren (Tabelle 1).

Median und Bereich der SFC-Werte von unstimulierten PBMC von CMV-seronegativen und CMV-seropositiven Personen waren vergleichbar. Die Spot-Zahlen in IE-1- und pp65-stimulierten PBMC von CMV-seronegativen Probanden waren niedrig. Bei CMV-seropositiven Personen erreichten die SFC-Werte in IE-1- und pp65-stimulierten PBMC 1114 und 954 Spot-Zahlen/200.000 PBMC (Median von 22 bzw. 265; Abb. 8). Für die Bestimmung eines technischen Cut-offs wurden die Spot-Zahlen in der unstimulierten Kontrolle sowie in T-aktivierten® pp65- und IE-1-stimulierten Bedingungen von CMV-seronegativen und CMV-seropositiven Personen berücksichtigt. Die Positivitätsschwelle wurde mit Hilfe der z-Statistik (α-Niveau = 0,05) für die log10-transformierten geometrischen Mittelwerte bestimmt. Werte = 0 wurden durch Werte nahe der Nachweisgrenze ersetzt, die mit 0,5 angenommen wurde. Die Standardabweichung (SD) der ELISpot-Messungen für die unstimulierte Kontrolle, die IE-1-Stimulation und die pp65-Stimulation betrug 0,234, 0,192 bzw. 0,136. Bei einer SD von 0,2 und unter der Annahme, dass für jede Negativkontrolle und jede Testprobe 4 Wiederholungen gemessen werden, wurde das Kriterium berechnet, dass das Verhältnis der geometrischen Mittelwerte von stimulierten zu nicht stimulierten Werten mindestens 2,5 beträgt. Andererseits wurden Präzisionsprofile sowohl von IE-1- als auch von pp65-spezifischen Testergebnissen erstellt, wobei ein Variationskoeffizient (CV) von nicht mehr als 40 % als Akzeptanzgrenze für die Gültigkeit des Assays zur Bestimmung der jeweiligen Bestimmungsgrenze (LoQ) verwendet wurde. Die Präzisionsprofile für IE-1- und pp65-spezifische ELISpot-Ergebnisse von 45 gesunden Spendern ergaben LoQ-Werte von 8,6 bzw. 7,1 (Zusätzliche Datei 2). Bemerkenswert ist, dass eine ähnliche Analyse, die an einer Kohorte von 124 Hämodialysepatienten durchgeführt wurde, vergleichbare SD-Werte unter unstimulierten und antigenstimulierten Bedingungen ergab (Bereich 0,199-0,240) und zu LoQ-Werten von 7,8 (IE-1) und 8,3 (pp65) führte. Auf der Grundlage dieser Analysen wurde ein Cut-off-Wert von 10 SFC/200.000 PBMC gewählt, um positive Testergebnisse zu definieren.

Gesamt, Bei Verwendung von T-activated® pp65- und IE-1-Antigenen und dem optimierten IFN-γ-ELISpot-Assay gelten die Testergebnisse als positiv, wenn das geometrische Mittel der Spots, die aus pp65- oder IE1-Stimulationen resultieren, ≥ 10 SFC/200.000 PBMC ist und wenn das Verhältnis der geometrischen Mittel der stimulierten zu den nicht stimulierten Bedingungen ≥ 2 ist.5. Nach diesen Definitionen ergab das Kollektiv von 45 gesunden Spendern (32 CMV IgG-seropositiv, 13 CMV IgG-seronegativ) eine Sensitivität (definiert als die positive Übereinstimmung mit der CMV IgG-Serologie, die als primäres Referenzmessverfahren verwendet wird) von 97% und eine Spezifität (negative Übereinstimmung mit der CMV IgG-Serologie) von 85% (Abb. 8).

Funktionelle Assay-Validierung: T-aktivierte Antigene stimulieren ein breites Spektrum klinisch relevanter CMV-reaktiver Effektorzellen

Harnstoff-formulierte rekombinante (T-aktivierte®) Proteine werden sowohl durch den exogenen (MHC Klasse II) als auch den endogenen (MHC Klasse I) Antigenprozessierungs- und Präsentationsweg prozessiert. Die Stimulierung von PBMC durch T-activated®-Proteine entspricht daher eher einer natürlichen Infektion, was möglicherweise zur Aktivierung eines breiten Spektrums klinisch relevanter CMV-reaktiver Zellen (z. B. Th-, CTL-, NK-, NKT-Zellen) führt, was zu der hohen Empfindlichkeit des IFN-γ-ELISpot-Tests beitragen könnte. Zur weiteren Charakterisierung der Zellen, auf die die T-aktivierten® IE-1- und pp65-Antigene abzielen, und zur Untersuchung der möglichen interindividuellen Variabilität der Effektorzellenreaktion wurden parallel zu den IFN-γ-ELISpot-Tests intrazelluläre IFN-γ-Färbungen und Durchflusszytometrieanalysen durchgeführt. Frisch isolierte PBMC von sechs CMV-seropositiven gesunden Spendern wurden 19 Stunden lang mit T-aktivierten® IE-1- und pp65-Proteinen stimuliert und die IFN-γ-produzierenden Zellen gemäß dem optimierten ELISpot-Assay gezählt. Dieselben PBMC-Präparate (jeweils 4 Wiederholungen) wurden 6 Stunden lang mit derselben Charge von T-aktivierten® IE-1- und pp65-Proteinen in Gegenwart von ko-stimulierenden Anti-CD28- und Anti-CD49d-Antikörpern stimuliert. Die Oberflächenmarker (CD3, CD4, CD8, CD56) und die intrazelluläre IFN-γ-Färbung wurden mittels Durchflusszytometrie analysiert, wie im Abschnitt Methoden beschrieben. IFN-γ+-Subpopulationen von CD3+CD4+ (Th), CD3+CD8+ (CTL), CD3+CD56+ (NKT-ähnliche) und CD3-CD56+ (NK)-Lymphozyten wurden gemäß der in Zusatzdatei 3 dargestellten Gating-Strategie gezählt. Alle sechs Spender unterschieden sich in ihrer Fähigkeit, eine IE-1- und/oder pp65-abhängige Reaktion im IFN-γ-ELISpot-Assay auszulösen. Auch die Intensität der Reaktion war bei den sechs Spendern sehr unterschiedlich und reichte von 7 bis 1.054 SFC (IE-1-Stimulation) und von 28 bis 780 SFC (pp65-Stimulation) pro 200.000 PBMC (Abb. 9a). Ebenso unterschieden sich die einzelnen Spender in der Häufigkeit und dem Verhältnis der verschiedenen Zellsubpopulationen, die mittels Durchflusszytometrie untersucht wurden (Abb. 9b). Interessanterweise wiesen gesunde CMV-seropositive Personen mit niedrigeren Spot-Zahlen (d120, d300, d343; Abb. 9a) auch eine geringere Häufigkeit von IFN-γ+-Lymphozyten in der Durchflusszytometrie auf (Abb. 9b), was die Fähigkeit des ELISpot-Assays unterstreicht, niedrige von hohen Respondern zu unterscheiden. Die Aktivierung jeder untersuchten Lymphozyten-Subpopulation wurde bei einigen, aber nicht bei allen Spendern festgestellt. So wurde beispielsweise bei 4 von 6 Spendern (d120, d172, d300, d343) eine schwache bis starke Aktivierung der CD4+ T-Zellen als Reaktion entweder auf IE-1, pp65 oder auf beide nachgewiesen. Ebenso zeigten 5 von 6 Spendern (d172, d290, d300, d343, d361) eine CD8+ T-Zellaktivierung unter einer oder beiden Stimulationsbedingungen. CD3-CD56+ (NK-Zellen) wurden bei einem Spender (d120) als Reaktion auf beide Antigene festgestellt. CD3+CD56+ (NKT-ähnliche) Zellen wurden bei 4 von 6 Personen (d120, d172, d300, d361) sowohl als Reaktion auf IE-1 als auch auf pp65 schwach aktiviert (Abb. 9b). Bemerkenswerterweise korrelierte eine starke pp65-spezifische CD4+-Aktivierung in d172 mit einer starken pp65-spezifischen Reaktion im ELISpot, und eine starke pp65-spezifische (d290) und IE-1-spezifische (d361) CD8+-Aktivierung war mit einer hohen Spotanzahl im entsprechenden ELISpot verbunden (Abb. 9a-b), was darauf hindeutet, dass diese CMV-reaktiven Effektorzellen wesentlich zu den nachgewiesenen ELISpot-Signalen beitragen. Insgesamt belegen diese Daten die Fähigkeit der T-aktivierten® IE-1- und pp65-Proteine, ein breites Spektrum an CMV-spezifischen Effektorzellen zu stimulieren. Diese Experimente zeigten auch die große Heterogenität der Reaktionen bei gesunden CMV-seropositiven Personen. Insbesondere die Beobachtung, dass einige Personen sowohl auf IE-1 als auch auf pp65 reagieren, unterstreicht die Bedeutung der Bewertung der Reaktion auf beide Antigene. Die Überwachung sowohl IE-1- als auch pp65-spezifischer Reaktionen im optimierten IFN-γ-ELISpot-Assay könnte die Gesamtempfindlichkeit des Tests verbessern.