In den letzten zehn Jahren haben chemogenetische und optogenetische Techniken die integrativen Neurowissenschaften revolutioniert, indem sie neue Werkzeuge zur reversiblen Beeinflussung der Aktivität spezifischer Populationen oder Neurotransmittersysteme mit größerer Selektivität bereitstellen (Sternson und Roth, 2014; Roth, 2016; Wiegert et al., 2017). Im Vergleich zur Optogenetik, die eine schnelle und phasische neuronale Modulation mit hoher zeitlicher Auflösung ermöglicht, erlaubt die Chemogenetik eine umfassendere Modulation von Systemen, was insbesondere für Studien nützlich ist, die sich auf tonische Phänomene konzentrieren (z. B. die Untersuchung der Bedeutung von Dopamin in Motivationsprozessen; Whissell et al., 2016). Unter den chemogenetischen Werkzeugen sind Designer-Rezeptoren, die ausschließlich durch Designer-Drogen aktiviert werden (DREADDs), weit verbreitet und werden als biologisches „Schloss-und-Schlüssel“-System für die selektive Manipulation der Zellaktivität durch G-Protein-Signalpfade bezeichnet. Dieses erstmals von der Gruppe von Roth entwickelte, sehr elegante System (Armbruster et al, Bei diesem G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR) handelt es sich um einen Muscarinrezeptor: das Schloss, das so mutiert wurde, dass es nur auf Clozapin-N-Oxid (CNO) anspricht, der Schlüssel, ein abgeleiteter Metabolit des atypischen Antipsychotikums Clozapin, das ansonsten möglicherweise keine pharmakologische Aktivität aufweist.

Seit 2016 haben jedoch einige Veröffentlichungen besorgniserregende Fragen zur Verwendung von CNO aufgeworfen. Erstens können relativ hohe Dosen von CNO (10 mg/kg), die systemisch verabreicht werden, eine pharmakologische Off-Target-Aktivität haben, was durch die Induktion von Verhaltenseffekten bei Ratten und Mäusen, die nicht durch DREADDs vermittelt werden, belegt wird (MacLaren et al., 2016; Gomez et al., 2017; Baerentzen et al., 2019). Darüber hinaus zeigten Gomez et al. (2017), dass CNO die Blut-Hirn-Schranke nicht ohne Weiteres überwindet, möglicherweise eine geringe DREADD-Bindungsaffinität aufweist und zu Clozapin rückverstoffwechselt wird, das zum eigentlichen Effektor der DREADDs wird. Aufgrund dieser auffälligen Beobachtungen schlugen sie die direkte Verwendung niedriger Clozapin-Dosen (0,1 mg/kg) zur Aktivierung der DREADDs anstelle von CNO vor. Die Verwendung niedriger Clozapin-Dosen anstelle hoher CNO-Dosen, die sich allmählich in Clozapin umwandeln, führt jedoch zu zwei wesentlichen Einschränkungen. Erstens ist es nicht offensichtlich, dass Clozapin bei akuter Injektion oder längerer Diffusion auf DREADDs in gleicher Weise wirkt (Mahler und Aston-Jones, 2018). Zweitens hat Clozapin als atypisches Antipsychotikum zahlreiche endogene Targets wie serotonerge, muskarinerge oder dopaminerge Rezeptoren mit relativ starken Affinitäten (Meltzer, 1989; Schotte et al., 1993; Brunello et al., 1995; Ashby und Wang, 1996; Armbruster et al., 2007), die selbst bei niedrigen Dosen wahrscheinlich Off-Target-Effekte hervorrufen. Tatsächlich wurde festgestellt, dass die für DREADD-Experimente empfohlene Dosis von 0,1 mg/kg Clozapin das angstbezogene Verhalten bei Mäusen (Manzaneque et al., 2002) sowie bei Ratten (eine Wirkung, die auch wir beobachtet haben; R. Goutaudier und S. Carnicella, unveröffentlichte Beobachtungen) signifikant erhöht, wobei Clozapin auch die Fortbewegung durch potenzielle Sedierung beeinflusst und die kognitive Flexibilität beeinträchtigt (Ilg et al., 2018).

Obgleich das Auftreten dieser Effekte von der verwendeten Spezies, dem Stamm oder dem Geschlecht abhängen kann und sehr diskret sein kann (da nicht alle Verhaltensdimensionen betroffen sind), haben sie das Potenzial, die Leistung der Tiere bei einer Vielzahl von Verhaltensaufgaben erheblich zu beeinträchtigen. Hoher Stress und Angst können zum Beispiel bei Gedächtnis- oder Schmerzstudien störende Faktoren sein (Sousa et al., 2006; Sorge et al., 2014). Außerdem kann das Verhalten im Zusammenhang mit Drogenmissbrauch oder psychiatrischen Störungen wie Schizophrenie, Angst oder kognitiver Flexibilität den gesamten Phänotyp verändern (Floresco et al., 2009; Koob und Schulkin, 2018). Aufgrund dieser Beobachtungen sind bei Clozapin wichtige Vorsichtsmaßnahmen erforderlich, um verzerrte Verhaltensstudien zu vermeiden.

Wäre ein neues Molekül, das speziell für DREADDs entwickelt wurde, selektiver? Verbindung 21 (C21) ist ein synthetischer DREADD-Ligand, der 2015 entwickelt wurde (Chen et al., 2015) und 2018 sowohl in vitro als auch in vivo teilweise charakterisiert wurde (Thompson et al., 2018). Auch hier wurde beschrieben, dass es bei niedrigen Dosen (<3 mg/kg) keine verhaltensbezogenen Off-Target-Effekte hat und das Verhalten von DREADD-exprimierenden Tieren verändern kann. Diese Studie wurde von Jendryka et al. (2019) bestätigt, die pharmakokinetische und pharmakodynamische Experimente mit Mäusen und C21 (3 mg/kg) durchführten. Sie zeigten, dass 30 Minuten nach der Verabreichung von C21 die Konzentration des Moleküls im Liquor >10-mal höher war als die geschätzte EC50 für die DREADD-Aktivierung (Liquor = 40 nm und EC50DREADDs = 3 nm), und zwar ohne Rückmetabolisierung in Clozapin. Die Ergebnisse einer aktuellen BioRxiv-Preprint-Studie an Ratten, Mäusen und Makaken (Bonaventura et al., 2018) deuten jedoch darauf hin, dass, obwohl C21 eine geringe Hirnpenetranz aufweist, bereits eine Dosis von 1 mg/kg die Hirnfunktion in Wildtyp-Mäusen verändern kann. Darüber hinaus wurde in vitro in Rattengehirnschnitten sowie in vivo bei Mäusen und Makaken in einer Positronen-Emissions-Tomographie-Studie eine schwache Affinität und Belegung für DREADDs beobachtet. Auf der Grundlage derselben experimentellen Untersuchung wie für C21 schlugen sie als Alternative zwei andere Liganden, JHU37152 und JHU37160, vor, die eine höhere In-vivo-Potenz für DREADDs und potenziell weniger Off-Target-Effekte aufweisen (Bonaventura et al., 2018). Obwohl diese neue Generation von DREADD-Liganden vielversprechend erscheint, sind sie aufgrund ihrer Neuartigkeit noch wenig charakterisiert und bleiben strukturell homolog zu Clozapin und CNO. Eine umfassende Charakterisierung in zellulären und verhaltensbiologischen Untersuchungen wird daher von entscheidender Bedeutung sein, um die potenziellen Fallstricke, die für CNO gefunden wurden, auszuschließen.

Eine alternative Lösung zur Verbesserung der Selektivität chemogenetischer Ansätze wäre die Verwendung einer anderen Schloss-Schlüssel-Kombination. So ist der κ-Opioidrezeptor-DREADD (KORD) ein mutierter hemmender GPCR, der vom menschlichen κ-Opioidrezeptor abgeleitet ist (Vardy et al., 2015). Im Vergleich zu klassischen DREADDs, die Clozapin, CNO, C21 oder JHU-Verbindungen binden, wird KORD durch Salvinorin B aktiviert, einen drogenähnlichen Metaboliten des KOR-selektiven Agonisten Salvinorin A. Obwohl dieser chemogenetische Ansatz elegant in Kombination mit einem aktivierenden DREADD verwendet wurde, um ein „EIN- und AUS“-System innerhalb derselben neuronalen Population zu schaffen (Vardy et al, 2015, Aldrin-Kirk et al., 2016), wird jedoch nur in geringem Umfang verwendet, da er die neuronale Aktivität nur über einen kurzen Zeitraum reduziert (Aldrin-Kirk und Björklund, 2019). Darüber hinaus weist Salvinorin B bei hohen Konzentrationen eine gewisse Affinität zu endogenem KOR auf und wurde bisher noch nicht eingehend charakterisiert, wie es derzeit für DREADD-verwandte Verbindungen geschieht (Roth, 2016). Das Ersetzen des GPCR durch einen mutierten Ionenkanal, einen anderen alternativ konzipierten Rezeptor, der als Liganden-gesteuerter Ionenkanal (LGIC) bezeichnet wird, ist eine vom Stenson-Labor entwickelte Option (Magnus et al., 2011). Im Vergleich zu DREADDs kombinieren LGICs die ligandenbindende Domäne eines mutierten nikotinischen Rezeptors mit der Ionenporendomäne eines anderen ausgewählten Rezeptors, um einen chimären Ionenkanal zu schaffen. Ähnlich wie bei den DREADDs wird dieser Hybridkanal durch einen kleinen Agonisten aktiviert, der von Quinuclidinylbenzamid, einem Agonisten des α7 nikotinischen Acetylcholinrezeptors, abgeleitet ist, und ermöglicht den Ionenaustausch durch die neuronale Membran. Neben anderen Einschränkungen, die diesem Ansatz eigen sind (Aldrin-Kirk und Björklund, 2019), hat er mit den DREADDs auch die Verwendung eines pharmakologischen Liganden gemeinsam, der je nach den Versuchsbedingungen potenziell mit endogenen Rezeptoren interagieren kann. Schließlich gehen alle diese Sperren von endogenen Rezeptoren aus und können daher die mit der Pharmakologie verbundenen Einschränkungen nicht beseitigen.

Abgesehen von diesen jüngsten Entwicklungen und den noch offenen Fragen sollte eine entscheidende Frage gestellt werden: Wird man jemals einen völlig selektiven und inerten Schlüssel finden? Wahrscheinlich nicht. Man darf nicht vergessen, dass DREADDs chemogenetische Werkzeuge sind, die Genetik und Pharmakologie kombinieren. Obwohl genetische Ansätze eine starke Kontrolle der Expression der Schlösser (d. h. der DREADDs) in bestimmten Zellpopulationen oder Subpopulationen mit konditionalen Ansätzen ermöglichen, leiten sie sich von endogenen GPCRs ab und unterliegen als solche den gleichen Grenzen wie die klassische Pharmakologie für den Schlüssel. Es ist daher unwahrscheinlich, dass Moleküle gefunden werden, die eine hohe Bindungsaffinität für DREADDs aufweisen, ohne eine Affinität für einige der zahlreichen Rezeptoren zu besitzen, die bereits im Gehirn vorhanden und eng mit DREADDs verwandt sind. Clozapin hat beispielsweise eine sehr hohe Affinität für DREADDs, aber auch für den serotonergen Rezeptor 5-HT2 (Ki = 10-8 für beide; Armbruster et al., 2007; Gomez et al., 2017), und eine hohe Affinität für eine breite Palette anderer GPCRs (Ki = 10-7 bis 10-6; Armbruster et al., 2007). Selbst synthetische Liganden, die speziell für diese chemogenetische Technik entwickelt wurden, weisen beträchtliche Affinitäten zu endogenen Rezeptoren auf. So haben JHU37152 und JHU37160 zwar eine geringere Affinität für 5-HT-Rezeptoren als Clozapin, weisen aber insgesamt ein ähnliches Zielprofil wie dieses Medikament auf, mit einer noch höheren Affinität für die muskarinischen Rezeptoren (Bonaventura et al., 2018), was auf potenziell stärkere Off-Target-Effekte hindeutet. C21 weist auch eine höhere Affinität für den histaminergen H1-Rezeptor als für DREADDs auf (Ki > 10-8 bzw. Ki = 10-7,2; Thompson et al., 2018) und hat ein größeres Bindungspotenzial an Opioidrezeptoren als Clozapin (Bonaventura et al., 2018). Um die Fallstricke dieses wirkungsvollen Ansatzes zu minimieren, müssen unabhängig von der Wahl des Schlüssels kritische Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden (Abb. 1).

Vor jedem Verhaltensexperiment müssen zunächst die experimentellen Bedingungen getestet werden, um den besten Liganden und die optimale(n) Dosis(en) zu finden, je nach experimentellem Ansatz. DREADDs dürfen nicht als schlüsselfertiges Werkzeug betrachtet werden; zelluläre, neurochemische oder elektrophysiologische Experimente sollten vor der Verhaltensstudie durchgeführt werden (Mahler et al., 2014; Beloate et al., 2016; Boekhoudt et al., 2016), um die Wirksamkeit des Liganden in der gewählten Dosis in dem betreffenden System zu bestätigen. Darüber hinaus müssen auch DREADD-freie Kontrolltiere einbezogen werden, um die Abwesenheit aspezifischer neurobiologischer Wirkungen des Liganden oder des Rezeptors an sich, der möglicherweise durch einen Neurotransmitter aktiviert wird oder eine konstitutive Aktivität aufweist, zu überprüfen (Saloman et al., 2016).

Zweitens sollten, wenn möglich, zwei verschiedene DREADD-Liganden getestet werden, um zu bestätigen, dass die beobachteten Verhaltenseffekte spezifisch durch DREADD vermittelt werden. Die spezifischen pharmakologischen Wirkungen auf DREADDs wären ähnlich, aber die Off-Target-Effekte könnten unterschiedlich sein.

Drittens, und das ist der kritischste Punkt, müssen konventionelle pharmakologische Kontrollen verwendet werden. Es sollte die gleiche Philosophie wie in der Pharmakologie angewandt werden, und wie bei neurobiologischen Experimenten müssen Gruppen von transgenen Tieren ohne exprimierende DREADDs (z. B. DREADDs leere virale Vektoren) integriert werden, um die selektiven Effekte des Liganden und der gewählten Dosis zu überprüfen (Smith et al., 2016, Campbell und Marchant, 2018; Mahler und Aston-Jones, 2018; für ein Beispiel für experimentelle Studien, die diesem Design folgen, siehe auch Xia et al., 2017; Cope et al., 2019). Diese Aussage mag trivial erscheinen, aber das Streben nach einem absolut selektiven Liganden und die Attraktivität dieses Ansatzes haben bereits zu einigen übermütigen Verhaltensstudien geführt, die manchmal in völliger Abwesenheit dieser Kontrolle durchgeführt wurden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass DREADDs einen präzisen Weg zur Manipulation neuronaler Schaltkreise und des Verhaltens bieten und eine großartige Alternative zur Optogenetik darstellen, um eine spezifische zelluläre Subpopulation tonisch zu manipulieren, wodurch sich spannende neue Forschungswege eröffnen. So wie die thermischen Eigenschaften des Lichts in der Optogenetik jedoch zu unspezifischen Effekten führen können (siehe auch Owen et al., 2019), ist bei der Chemogenetik größere Vorsicht geboten, und Standardkontrollen müssen obligatorisch sein. Die Grenzen von DREADD müssen erkannt werden, und es muss Zeit darauf verwendet werden, mögliche Off-Target-Effekte zu vermeiden oder zu kontrollieren und zu überprüfen, dass dieser Ansatz nicht per se zu Verzerrungen führt. Die Nutzung der Stärken der Genetik unter Berücksichtigung der Schwächen der Pharmakologie wird das Potenzial dieses Ansatzes maximieren.