Abstract

Hintergrund und Ziel. Ein zuverlässiges nicht-invasives Vorhersageinstrument für das Screening, die Diagnose und/oder das Staging von Darmkrebs (CRC) vor der Operation ist entscheidend für die Wahl der Behandlung und die Prognose. Methoden. Patienten, die zwischen dem 1. Januar 2015 und dem 31. Dezember 2018 zur Erstbehandlung eines kolorektalen Karzinoms aufgenommen wurden, wurden erfasst und überprüft. Die Daten zu CD16+CD56+ natürlichen Killerzellen (NK) wurden nach den Stadien des CRC analysiert. Ergebnisse. Die Anzahl der qualifizierten Teilnehmer in den gesunden, Stadium I, Stadium II, Stadium III und Stadium IV CRC-Patienten waren 60, 66, 60, 70 und 68, jeweils. Es gab einen signifikanten Unterschied bei den zirkulierenden CD16+CD56+ NK-Zellen zwischen der gesunden Gruppe und der CRC-Gruppe () sowie zwischen der gesunden Gruppe und der CRC-Gruppe im Stadium III bzw. IV ( bzw. 0,001). Der Prozentsatz der zirkulierenden CD16+CD56+ NK-Zellen in den Lymphozyten war negativ mit dem Auftreten von CRC korreliert. Beim Vergleich des Pools der Darmkrebsfälle im Stadium I und II mit dem Pool der Darmkrebsfälle im Stadium III und IV anhand der zirkulierenden CD16+CD56+ NK-Zellen betrug die Fläche unter der Receiver Operating Characteristic-Kurve 0,878. Bei einem optimalen Cutoff-Wert von 15,6 % lag die OR bei 0,06 (0,03, 0,11), die Sensitivität bei 86,5 %, die Spezifität bei 72,5 %, der positive prädiktive Wert bei 74,2 % und der negative prädiktive Wert bei 85,5 %. Schlussfolgerungen. Zirkulierende CD16+CD56+ NK-Zellen können als Screening- und Diagnose-/Staging-Instrument für CRC verwendet werden.

1. Einleitung

Das kolorektale Karzinom (CRC) tritt jährlich in etwa einer Million Fällen auf und verursacht jährlich den Tod von fast 700.000 Menschen, womit es die viertgefährlichste Krebsart der Welt ist. Die derzeitige Screening-Strategie für Darmkrebs ist mit einer geringen Sensitivität und/oder Spezifität bei stuhlbasierten Tests, langwierigen Darmvorbereitungsschritten vor Röntgenuntersuchungen und einem hohen Perforationsrisiko bei endoskopischen Untersuchungen konfrontiert. In der Tat sollte der beste Screening- und Follow-up-Test für CRC mit hoher Compliance leicht durchgeführt und wiederholt werden können, insbesondere in Anbetracht der bis zu 25 % inoperablen Fälle zum Zeitpunkt der Diagnose und der 50 %igen Rezidivrate bei Fällen im Frühstadium nach der Operation.

Das Staging und die Prognose von CRC beruhen hauptsächlich auf der Pathologie nach chirurgischen Eingriffen. Ein Konsens-Immunoscore auf Paraffinschnitten für die Klassifizierung und Prognose von CRC war ein praktisches Beispiel . Obwohl in mehreren Studien ergänzende und nicht-invasive Biomarker für die Diagnose von CRC eingesetzt wurden, fehlt noch immer ein zuverlässiges Prognoseinstrument mit hoher Sensitivität und Spezifität für die Diagnose und/oder die Stadieneinteilung von CRC vor der Operation.

Das Immunsystem ist bekanntermaßen an der Entstehung und dem Fortschreiten von CRC beteiligt. Es hat sich gezeigt, dass die Immuninfiltration verschiedener Immunzellen bei CRC mit der Metastasierung und der Prognose zusammenhängt. Darüber hinaus können die zirkulierenden Immunzellen die lokale Immunreaktion in der Mikroumgebung des Tumors widerspiegeln und damit potenziell wichtige Informationen über das Fortschreiten der Krankheit bei CRC liefern. Natürliche Killerzellen (NK) als eine wichtige Untergruppe der Immunzellen, deren Aktivität durch ein sich entwickelndes und empfindliches Gleichgewicht zwischen aktivierenden und hemmenden Signalen ausgelöst wird, die von Zelloberflächenrezeptoren empfangen werden, gelten als interessante Ziele für translationale und klinische Studien .

In der vorliegenden Studie analysierten wir CD16 und CD56 doppelt-positive NK-Zellen bei Gesunden und in verschiedenen Stadien von CRC-Patienten vor der Erstbehandlung und versuchten, den Wert von CD16+CD56+ NK-Zellen bei der Vorhersage und Vorbehandlung von CRC herauszufinden.

2. Methoden

Es handelte sich um eine retrospektive Kohortenstudie, die am 2nd Affiliated Hospital der Harbin Medical University, einem Tertiärkrankenhaus im Nordosten Chinas, durchgeführt wurde. Vor der Datenerhebung wurde die Genehmigung der Ethikkommission eingeholt, und die informierte Zustimmung der Patienten wurde bei der Aufnahme eingeholt.

Klinische Aufzeichnungen von Patienten, die zwischen dem 1. Januar 2015 und dem 31. Dezember 2018 zur Erstbehandlung eines kolorektalen Karzinoms in der Abteilung für Onkologie aufgenommen wurden, wurden abgerufen und überprüft. Bei den eingeschlossenen Patienten sollten NK-Zelldaten aus der Vorbehandlung vorliegen (die letzten Daten vor der ersten Operation) sowie ein histologisch bestätigtes primäres CRC. Die Stadieneinteilung erfolgte auf der Grundlage der TNM-Terminologie (Tumor Node Metastasis). Ausgeschlossen wurden Patienten mit unklarer Diagnose, mit Komplikationen bei anderen Krebsarten, mit anderen chronischen Erkrankungen (wie Herz-Kreislauf-Erkrankungen und endokrine Erkrankungen) oder mit viralen oder bakteriellen Infektionen. Alters- und BMI-gleiche gesunde Teilnehmer (ohne klinische Beschwerden, die zum Zeitpunkt der Einschreibung gerade die jährliche körperliche Untersuchung absolviert hatten) wurden in die Kontrollgruppe aufgenommen.

Nüchterne periphere venöse Blutproben wurden von allen Teilnehmern vor der Behandlung (für die CRC-Gruppe) oder am Tag der jährlichen Untersuchung (für die gesunden Kontrollen) in einem heparinbeschichteten Röhrchen entnommen und bei 2-8°C aufbewahrt. 100 μl des frisch entnommenen Blutes wurden in ein durchflussspezifisches Röhrchen überführt. 20 μl eines BD Multitest 6-Farben-TBNK-Reagenzes (Ref. 644611, BD, USA, einschließlich CD3 FITC, CD16 PE+CD56 PE, CD45 PerCP-Cy5.5, CD4 PE-Cy7, CD19 APC und CD8 APC-Cy7) wurden für die durchflusszytometrische Untersuchung gemäß der Herstelleranleitung hinzugefügt, wobei CD16+CD56+ spezifisch die NK-Zellen innerhalb der Lymphozytenpopulation quantifizierte. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 15 Minuten lang im Dunkeln inkubiert und anschließend mit 2,5 ml Erythrozyten-Lysepuffer (Sigma-Aldrich) 10 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln behandelt. Das Gemisch wurde zweimal mit PBS-Puffer gewaschen, resuspendiert und in 0,5 ml PBS mit 0,9 % Formaldehyd (Sigma-Aldrich) fixiert und mit einem FACSCanto II-Durchflusszytometersystem (BD Biosciences) mit der FACSDiva™-Software Version 8.0 (BD Biosciences) analysiert. Von jeder Probe wurden mindestens 20.000 Zellen im P1-Gate analysiert.

2.1. Statistische Analyse

Diskrete Daten wurden als Anzahl der Fälle (Prozentsätze) ausgedrückt und mit dem Test oder dem exakten Test von Fisher analysiert, zusammen mit dem Odds Ratio (OR) und dem 95%-Konfidenzintervall (95% CI), je nachdem, was zutreffend war. Kontinuierliche Daten wurden als die dargestellt und mit dem -Test ausgewertet. Die Fläche unter der ROC-Kurve (Receiver Operating Characteristic) wurde verwendet, um den Wert der Vorhersage zu zeigen. SPSS 24.0 (IBM Corp., Armonk, NY) wurde für die statistische Analyse verwendet. Ein zweiseitiges Ergebnis wird als signifikant unterschiedlich angesehen.

3. Ergebnisse

Im vorgegebenen Studienzeitraum wurden 2.714 CRC-Patienten in unser Krankenhaus aufgenommen. Nach den vorgegebenen Einschlusskriterien wurden 66 Patienten im Stadium I, 60 Patienten im Stadium II, 70 Patienten im Stadium III und 68 Patienten im Stadium IV in unsere Studie aufgenommen. Weitere 60 alters- und BMI-angepasste gesunde Teilnehmer wurden in die Kontrollgruppe aufgenommen. Es gab keine signifikanten Unterschiede in Bezug auf Alter, Geschlecht, Körpergewicht, Größe oder BMI zwischen den gesunden Kontrollen und den CRC-Fällen oder zwischen den verschiedenen Gruppen (, Tabelle 1).

3.1. Der prädiktive Wert von zirkulierenden CD16+CD56+ NK-Zellen bei CRC

Es gab einen signifikanten Unterschied bei zirkulierenden CD16+CD56+ NK-Zellen zwischen der gesunden Gruppe und CRC-Fällen (, Tabelle 1). Der Prozentsatz der zirkulierenden CD16+CD56+ NK-Zellen in den Lymphozyten war negativ mit dem Auftreten von CRC korreliert.

Die Receiver Operating Characteristic (ROC)-Kurve wurde verwendet, um die Rolle von CD16+CD56+ NK-Zellen bei der Vorhersage von CRC zu zeigen. Beim Vergleich von gesunden Kontrollen mit CRC-Fällen insgesamt (Abbildung 1) betrug die Fläche unter der Kurve (AUC) 0,725 (Tabelle 2). Bei einem optimalen Cutoff-Wert von 19,7 % lag die OR bei 0,08 (0,04, 0,15), die Sensitivität bei 80,0 %, die Spezifität bei 76,9 %, der positive prädiktive Wert (PPV) bei 44,0 % und der negative prädiktive Wert (NPV) bei 94.4%.

Abbildung 1

Receiver Operating Characteristic (ROC)-Kurve von NK-Zellen bei der Vorhersage von CRC-Fällen (gesunde vs. Fälle).

3.2. Zirkulierende CD16+CD56+ NK-Zellen in verschiedenen Stadien von CRC-Fällen

Es gab keine Unterschiede bei den zirkulierenden CD16+CD56+ NK-Zellen zwischen der gesunden Gruppe und der CRC-Gruppe im Stadium I oder II ( bzw. ,), aber signifikante Unterschiede bestehen zwischen der gesunden Gruppe und der CRC-Gruppe im Stadium III oder IV (, , bzw. , Tabelle 1). Da es keine Unterschiede bei den CD16+CD56+ NK-Zellen zwischen der gesunden Gruppe und der CRC-Gruppe im Stadium I oder II gab, lag die AUC beim Vergleich des Pools der gesunden Kontrollen und CRC-Fälle im Stadium I+II mit dem Pool der CRC-Fälle im Stadium III+IV (Abbildung 2) bei 0,892 (Tabelle 2). Bei einem optimalen Cutoff-Wert von 15,6 % lag die OR bei 0,07 (0,04, 0,12), die Sensitivität bei 84,4 %, die Spezifität bei 72,5 %, der PPV bei 80,5 % und der NPV bei 77,5 %.

Abbildung 2

Receiver Operating Characteristic (ROC)-Kurve von NK-Zellen in verschiedenen Stadien von CRC-Fällen (gesund+Stadium 1&2 vs. Stadium 3&4).

Beim Vergleich des Pools der CRC-Fälle im Stadium I und II mit dem Pool der CRC-Fälle im Stadium III und IV (Abbildung 3) betrug die AUC 0,878 (Tabelle 2). Bei einem optimalen Cutoff-Wert von 15,6 % lag die OR bei 0,06 (0,03, 0,11), die Sensitivität bei 86,5 %, die Spezifität bei 72,5 %, der PPV bei 74,2 % und der NPV bei 85,5 %.

Abbildung 3

Receiver Operating Characteristic (ROC)-Kurve von NK-Zellen in verschiedenen Stadien von CRC-Fällen (Stadien 1&2 vs. Stadien 3&4).

4. Diskussion

Grundsätzlich können NK-Zellen auf der Grundlage ihrer CD56-Expression in CD56bright und CD56dim unterteilt werden. Erstere Zellen sind an der Immunregulation und der Produktion proinflammatorischer Zytokine beteiligt, während letztere zytotoxisch sind. CD16 (FcγRIII) auf NK-Zellen vermittelt die antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität, und das Vorhandensein von CD16 schließt somit die Beteiligung bestimmter NK-Zellen aus, die mit T- oder B-Zellen korreliert sind.

In jüngster Zeit wurden in zwei Studien CD3-CD56+ als Marker für NK-Zellen verwendet. Eine Studie berichtete über das Vorhandensein von Untergruppen von NK-Zellen bei CRC-Patienten und kam zu dem Schluss, dass „der prozentuale Anteil von CD16+ NKT-ähnlichen Zellen unabhängig mit einem kürzeren krankheitsfreien Überleben bei CRC-Patienten assoziiert war“. Die Autoren nahmen jedoch nur eine begrenzte Anzahl von Patienten in die Studie auf, und die Stratifizierung nach verschiedenen Stadien sowie die Aufteilung in CD56-helle und CD56-dim NK-Zellen-Populationen schmälerten die Aussagekraft ihrer Daten zusätzlich. Darüber hinaus wurden einige dieser Patienten bereits vor der Entnahme der NK-Zellen radiologisch behandelt, was zu einer Heterogenität in der gepoolten Patientenpopulation führen könnte (eine Mischung aus ursprünglich behandelten und nachbehandelten Patienten). In einer anderen Studie wurde eine negative Korrelation zwischen peripheren NK-Zellen und dem TNM-Stadium des kolorektalen Karzinoms festgestellt, wobei ein signifikanter Unterschied bei den NK-Zellen zwischen Gesunden und den Stadien I und II sowie zwischen Gesunden und dem Stadium IV, aber nicht zwischen Gesunden und dem Stadium III bestand. Dieser uneinheitliche Trend könnte auf die geringe Zahl der in jeder Gruppe eingeschlossenen Patienten zurückzuführen sein. In unserer Studie haben wir mehr Patienten erfasst, und es wurden nur Patienten ohne vorherige Behandlung in die Analyse aufgenommen, was den natürlichen Zustand des Körpers unter der Belastung durch CRC zeigen könnte. Daher sind unsere Daten, da sie homogen sind, als Screening-Test vor der ersten Behandlung geeignet.

Eine weitere Stärke unserer Studie liegt im Ausschluss von Fällen viraler oder bakterieller Infektionen. Auf der Oberfläche von NK-Zellen gibt es aktivierende und hemmende Rezeptoren. NK-Zell-aktivierende Rezeptoren, wie z. B. Ly49H, KIR2DL3 oder KIR3DS1, sind notwendig, um Infektionen mit dem Cytomegalovirus, Hepatitis-C-Virus bzw. Epstein-Barr-Virus zu beseitigen. Andererseits sind auch hemmende NK-Zell-Rezeptoren, wie CD94-NKG2A oder KIRs, bei Virusinfektionen beteiligt. Das Gleichgewicht zwischen aktivierenden und hemmenden Rezeptoren wird durch die Rezeptor-Liganden-Bindung aufrechterhalten. Direkte Toll-like-Rezeptoren (TLRs) können durch Lipopolysaccharid, einen Bestandteil gramnegativer Bakterien, aktiviert werden. Die Stimulation von TLRs auf NK-Zellen ist Berichten zufolge auch an der Aktivierung von NK-Zellen beteiligt. Daher wird der Ausschluss von Fällen viraler oder bakterieller Infektionen die Heterogenität dieser Fälle bei der Analyse von CRC-Fällen verringern.

Es gibt Berichte über die Prognose von CRC auf der Grundlage von immunhistochemischen Färbungen zum Nachweis von Genmutationen oder -polymorphismus oder Aktivierung, was nur nach chirurgischen Eingriffen möglich ist. Eine Kategorie von zirkulierenden Biomarkern für Darmkrebs fällt in den Bereich der Genregulation (microRNA oder Methylierung). Eine andere Kategorie ist die Metabolomanalyse im Serum. In diesem Sinne haben die zirkulierenden CD16+CD56+ NK-Zellen eine prädiktive Rolle sowohl beim Screening als auch beim Staging vor chirurgischen Eingriffen.

5. Schlussfolgerung

Zusammenfassend haben wir festgestellt, dass der Prozentsatz der zirkulierenden CD16+CD56+ NK-Zellen negativ mit dem Auftreten von CRC und dem Staging von CRC korreliert ist. Bei einem Grenzwert von 19,7 % und 15,6 % konnte der Prozentsatz der zirkulierenden CD16+CD56+ NK-Zellen zwischen gesunden und CRC-Fällen bzw. zwischen Fällen im Stadium I+II und III+IV unterscheiden.

Datenverfügbarkeit