Immunoblotting-Verfahren

Diese Analysetechnik läuft in folgenden Schritten ab. Die Proteine werden in der Regel mit Hilfe der Natriumdodecylsulfat (SDS)-Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach Größe getrennt. Anschließend werden sie im Trocken-, Halbtrocken- oder Nassblotting-Verfahren auf eine synthetische Membran übertragen. In dem von einer Stromquelle erzeugten elektrischen Feld wandern die mit negativ geladenem SDS beschichteten Proteine in Richtung der positiven Elektrode. Wenn die Proteine aus dem Gel herauswandern, werden sie auf einer Membran aufgefangen. Die Bindung der Proteine an die Membran ist ein irreversibler Mechanismus. Die Membranen können aus Nitrocellulose, Polyvinylidendifluorid (PVDF) oder Nylon bestehen. Die Membran kann dann mit Serumalbumin oder Milchlösung blockiert werden, um eine unspezifische Antikörperbindung zu verhindern. Anschließend wird die Membran mit Antikörpern untersucht, die für das zu untersuchende Protein spezifisch sind. Diese Methode ähnelt der Immunhistochemie, erfordert jedoch keine Fixierung. Bei dieser Technik wird die Spezifität der Antigen-Antikörper-Erkennung ausgenutzt. Der Nachweis erfolgt in der Regel mit chromogenen oder peroxidisch gebundenen sekundären Antikörpern, die eine chromogene oder chemilumineszente Reaktion katalysieren.