Genom samling og annotation

For at samle H. medicinalis-genomet ekstraherede vi DNA fra en voksen igle. Før behandlingen blev iglen holdt uden fodring i mindst 2 måneder. Vi skabte et sæt af tre shotgun-biblioteker for at udføre sekventering ved hjælp af tre forskellige platforme (Supplerende tabel 1). Alle læsedatasæt blev kombineret, og en enkelt samling blev oprettet af SPAdes . Den resulterende samling indeholdt 168 624 contigs med en N50 contig-længde på 12,9 kb (Supplerende tabel 2).

Foreløbig analyse (contigs BlastN) afslørede tilstedeværelsen af bakterielle sekvenser i den resulterende samling. Derfor foretog vi binning for at skelne de iglekontigs (en iglebin). Vi opbyggede en fordeling af contigs i henhold til deres GC-overflod, tetranukleotidfrekvenser og læsedækning. For at øge binningsnøjagtigheden blev læsedækningen bestemt ved at kombinere DNA-læsningerne med læsningerne svarende til et kombineret transkriptom af H. medicinalis (se nedenfor). Diskrimineringen af de eukaryotiske og prokaryotiske contigs er illustreret i Fig. 1a/b, Supplerende tabel 3 og Supplerende data 2. Derudover udvalgte vi de mitokondrielle contigs for at samle iglens mitokondrielle genom .

De eukaryote contigs gennemgik en scaffolding-procedure ved hjælp af parrede læsninger. Scaffolds blev genereret ved hjælp af Illumina paird-end og mate-pair read datasæt ved hjælp af SSPACE . Efter stilladsering bestod samlingen af 14 042 sekvenser med en N50-stilladslængde på 98 kb (Supplerende tabeller 4 og 5). Længden af iglens genom anslås at være 220-225 Mb. Den samlede længde af det sammensatte genomudkast er 187,5 Mbp, hvilket svarer til 85 % af den teoretiske størrelse af iglens genom (se supplerende tabel 6). Der blev forudsagt i alt 14.596 proteinkodende gener.

Der blev også identificeret nye homologer af gener, der koder for kendte antikoagulanter eller blodmålsrelaterede proteiner. De multiple aminosyreudligninger for hver af disse proteinfamilier (Supplerende figurer 1, 2) Baseret på genomsekvensdataene og ved hjælp af kendte proteinsekvenser bestemte vi organiseringen af disse gener (Supplerende tabel 7, fig. 1b). Positioner og længder af exoner og introner blev forudsagt ved hjælp af de respektive cDNA- og proteinsekvenser som referencer. I nogle tilfælde er gener lokaliseret i fælles stilladser og danner tandem eller klynger Fig. 1b.

mRNA-seq, transkriptom samling og annotation

For at opnå vævsspecifikke mRNA-prøver fra tre medicinske iglearter, H. medicinalis, H. verbаna og H. orientalis, isolerede vi spytceller og muskler fra kryosektioner af de forreste kropsdele ved hjælp af lasermikrodissektion (Fig. 2a). Derefter konstruerede vi to cDNA-biblioteker med og uden normalisering for hver mRNA-prøve ved hjælp af oligo-dT-præmmeren og sekventerede dem på Ion Torrent PGM (Supplerende tabel 8). Fire læsedatasæt svarende til de konstruerede cDNA-biblioteker blev brugt til de novo-assemblering af et kombineret transkriptom for hver medicinsk igle-art ved hjælp af Trinity RNA-assembler (Supplerende tabel 9). Vi brugte de kombinerede transkriptomer til at kortlægge ikke-normaliserede vævsspecifikke læsninger. Read-kortlægning var nødvendig for at udføre efterfølgende differentiel ekspressionsanalyse.

Gene Ontology (GO)-analyse af de detekterede transkripter blev udført ved hjælp af Blast2GO og BlastX. ‘nr’-databasen tjente som referencedatabase. GO-analysen viste, at alle tre medicinske iglearter havde lignende transkriptfordelinger på tværs af GO-kategorier (Supplerende figur 3). Taxonomifordelingen af de nærmeste BlastX-hits var også ens (Supplerende figur 4). Størstedelen af de identificerede transkripter blev fundet at matche to arter af Annelida: 59.8% til H. robusta og 10.7% til C. teleta. Denne analyse bekræftede også fraværet af kontaminering af transkripter, der ikke er afblødte.

Forudsigelsen af kodningsregioner (eller åbne læserammer, ORF’er) og annotering af transkriptomiske data blev udført ved hjælp af Transdecoder og Trinotate. ORF’er blev oversat ved hjælp af BlastP-algoritmen, og proteinsekvenserne blev annoteret ved hjælp af EuKaryotic Orthologous Groups (KOG)-klassifikation ved hjælp af eggNOG-databasen (Supplerende figur 5). KOG-klassifikationen viste, at alle tre medicinske iglearter har lignende transkriptfordelinger på tværs af KOG-kategorierne. Alle tre medicinske iglearter viste sig også at dele langt størstedelen af deres ortologe klynger (Supplerende figur 6).

Differentiel ekspressionsanalyse

For at estimere de relative ekspressionsniveauer af de transkriptioner, der er identificeret i spytcellerne og musklerne, og for at identificere transkriptioner, der er unikke for spytcellerne, kortlagde vi de vævsspecifikke cDNA-reads uden normalisering i forhold til det kombinerede transkriptom for hver medicinsk igleart. Vi kortlagde også de vævsspecifikke cDNA-reads af H. medicinalis i forhold til dens genomsamling. Differentielt udtrykte gener blev påvist i henhold til en nyere protokol . For at identificere gener, der er differentielt udtrykt i spytcellerne og musklerne, blev der konstrueret et individuelt MA-plot for hver medicinsk igle-art ved hjælp af dens kombinerede transkriptom (Fig. 2b, Supplerende figur 7). Et yderligere MA-plot blev konstrueret for H. medicinalis ved hjælp af dens genomsamling (Fig. 2c). Gener med en q-værdi (FDR) < 0,05 blev anset for at være differentielt udtrykt.

Vi identificerede 102, 174 og 72 differentielt udtrykte transkripter i spytcellerne hos henholdsvis H. medicinalis, H. orientalis og H. verbana. Da de tre er nært beslægtede medicinske iglearter, blev proteinsekvenserne af de differentielt udtrykte transkripter grupperet i ortologe klynger for at forenkle den efterfølgende funktionelle analyse. Vi identificerede 25 differentielt udtrykte, ortolog klynger, der deles af tre iglearter og 44 ortolog klynger, der deles af mindst to iglearter (Fig. 3, Supplerende tabeller 10-11). Størstedelen af sekvenserne i de identificerede ortologklynger svarer til hypotetiske proteiner, der er annoteret i genomet af H. robusta. Analyse af bevarede domæner i de identificerede ortolog klynger gjorde det muligt at bestemme sekvenser, der tilhører kendte proteinfamilier.

Vi analyserede også de differentielt udtrykte gener i H. medicinalis ved hjælp af dens genomsamling. cDNA-reads for spytcellerne, musklerne og det neurale væv (reads blev indhentet fra Sequence Read Archive (SRA)) blev kortlagt på genomsamlingen. For det neurale væv brugte vi et læsedatasæt for ganglion 2 på grund af dets lokalisering i de præorale segmenter. Differentiel ekspressionsanalyse identificerede 42 gener, der er unikke for spytcellerne hos H. medicinalis (Supplerende tabel 12).

Proteomik af spytcellesekretion

Til proteomisk analyse indsamlede vi SCS’er fra tre medicinske iglearter, H. medicinalis, H. orientalis og H. verbana, som blev opretholdt uden fodring i mindst 2 måneder. SCS’erne blev indsamlet i henhold til en tidligere rapporteret metode med nogle ændringer (se Metoder).

Proveforberedelsesmetoden er afgørende for det resulterende repertoire af de identificerede proteiner, fordi SCS’erne består af både lav- og højmolekylære komponenter og indeholder proteinasehæmmere, glykoproteinkomplekser og lipider. Sidstnævnte kan danne komplekser med proteiner . Derfor kombinerede vi flere prøveforberedelsesmetoder og flere massespektrometriske teknikker for at dække det bredest mulige repertoire af SCS-proteiner. Proteomiske datasæt opnået ved forskellige prøveforberedelsesmetoder og massespektrometriteknikker blev kombineret for at skabe en endelig liste over de identificerede proteiner for hver medicinsk igle-art.

Vi identificerede 189, 86 og 344 proteiner i SCS’erne hos henholdsvis H. medicinalis, H. orientalis og H. verbana og grupperede dem i ortologe klynger som beskrevet ovenfor. Alle tre medicinske iglearter viste sig at dele 39 ortolog klynger, og 50 ortolog klynger blev delt af mindst to arter (Fig. 3, Supplerende tabel 13). Kombinationen af de transkriptomiske og proteomiske data afslørede 25 ortologiske klynger af gener, der udtrykkes unikt i spytcellerne (Supplerende tabel 11). En liste over de enkelte komponenter i leech SCS er angivet i fig. 3. Overraskende nok viste gener, der kodede for kendte antikoagulanter i SCS og blodmålsrelaterede proteiner, ikke differentieret ekspression mellem spytceller og muskler. For at validere dette resultat undersøgte vi ekspressionen af saratin, eglin C, bdelliner, hirustasin, destabilase, metallocarboxypeptidaseinhibitor, apyrase og angiotensinkonverterende enzym (ACE) ved realtids-PCR af yderligere, uafhængige vævsspecifikke cDNA-biblioteker, der er konstrueret til spytceller og muskler. Realtids-PCR-resultaterne for hirudin og destabilase (supplerende figur 8) bekræftede dette resultat. Dette indikerer, at gener, der koder for antikoagulerende stoffer og blodmålsrelaterede proteiner, ikke kun er involveret i blodtilførslen, men bidrager til andre, endnu ukendte fysiologiske funktioner.

Nedenfor karakteriserer vi SCS-komponenter, der er klassificeret i funktionelle grupper, og beskriver deres mulige roller i hæmostase. Sekvenserne af proteiner og deres alignment er præsenteret i de supplerende figurer 9-24.

Enzymer

Proteaser

Resultaterne af denne undersøgelse viser, at metalloproteaser af М12-, M13- og M28-familierne er de vigtigste enzymatiske komponenter i SCS. M12B-peptidaserne (ADAM/reprolysin) er en stor familie af desintegrinlignende metalloproteinaser, der har en bred vifte af funktioner og er involveret i mange fysiologiske processer . Disse enzymer findes ofte i slangegift, mens transkriptionerne er observeret i sialotranskriptomer fra forskellige hæmatofagearter . I forbindelse med hæmostase kan sekreterede proteaser af М12-familien deltage i hæmningen af blodpladernes adhæsion og i blødgøringen af blodproppen på grund af nedbrydningen af fibrinogen. Disse proteiner udviser metalafhængig proteolytisk aktivitet mod ekstracellulære matrixproteiner (gelatine, fibrinogen, fibronectin) og påvirker derved reguleringen af inflammation og immunreaktioner.

I pattedyr er proteaser af M13-familien involveret i dannelsen og udviklingen af det kardiovaskulære system og i reguleringen af neuropeptider i centralnervesystemet . En af deres vigtigste funktioner er aktivering af biologisk aktive peptider, især peptider, der er involveret i reguleringen af blodtrykket (angiotensin og bradykininin). Hos pattedyr er ACE en vigtig del af renin-angiotensinsystemet (RAS). ACE udtrykkes i sialotranskriptomerne hos iglen (Theromyzon tessulatum), keglesneglen (Conidae), vampyrsneglen (Colubraria reticulata) og dipterarterne (Diptera) .

De identificerede sekvenser af M28-familiens exopeptidaser tilhører Q-type carboxypeptidaser, også kendt som lysosomale dipeptidaser eller plasma-glutamat-carboxypeptidase (PGCP). Disse peptidaser har vist sig at være involveret i reguleringen af metabolismen af sekreterede peptider i blodplasmaet og centralnervesystemet hos pattedyr . Disse enzymer synes at tjene til at deaktivere visse signalpeptider i blodet og er komponenter i hæmoglobinolytiske systemer hos hæmatofage parasitter, idet de spiller en rolle som fordøjelsesekopeptidaser . Især indeholder sekret fra iglernes spytkirtler carboxypeptidaseinhibitorer, som formodentlig forhindrer, at andre typer peptidaser fordøjer blodmåltidet i utide .

Superoxiddismutase (EC 1.15.1.1.1)

Vi identificerede sekvenser af enzymer fra den sekreterede superoxiddismutasefamilie (SODC, Cu/Zn-type). Denne familie af metalloproteiner er hovedsagelig typisk for eukaryoter og er involveret i inaktivering af frie radikaler, hvilket forsinker oxidative processer. I blodet katalyserer superoxiddismutase omdannelsen af superoxid til molekylær oxygen og hydrogenperoxid og forhindrer dannelsen af peroxynitrit og hydroxylradikaler . Det er interessant, at peroxynitrit kan undertrykke den hæmostatiske funktion ved nitrering af vigtige prokoagulerende stoffer, mens hydrogenperoxid er et vigtigt signalmolekyle, der er involveret i reguleringen af mange processer (koagulation, trombose, fibrinolyse, angiogenese og proliferation). Hos flåter formodes SODC at deltage i reguleringen af koloniseringen af tarmkanalen med bakterier, herunder sygdomsfremkaldende agenser . I SCS synes SODC at udvise en antibakteriel virkning sammen med andre proteiner fra det medfødte immunsystem og forhindrer uønsket blodoxidation under fodring og fordøjelse. Navnlig er hæm-holdige forbindelser og frit jern involveret i dannelsen af frie radikaler og fremkaldelse af oxidativ stress .

Carbonsyreanhydrase (EC 4.2.1.1.1)

Dette enzym er en nøglekomponent i bicarbonatbuffersystemet og er involveret i reguleringen af pH-værdierne i blodet, fordøjelseskanalen og andre væv . Hos hæmatofage dyr kan dette enzym opretholde optimale betingelser for fordøjelsen af et blodmåltid . Kulsyreanhydrase synes at forårsage en lokal stigning i acidose på bidestedet, hvilket nedsætter aktiviteten af blodkoagulationsfaktorer.

Hyaluronidase (EC 3.2.1.35)

Disse enzymer er almindelige i proteom- og transkriptomdata fra hæmatofage og giftige dyr. Spytsekretionerne fra forskellige iglearter er kendt for at indeholde hyaluronidase (heparinase, orgelase) . I proteomet og transkriptomet fandt vi tre klynger, der indeholdt et domæne af glykosylhydrolasefamilie 79 (O-glykosylhydrolaser). Denne familie omfatter heparinaser, som spiller en vigtig rolle i bindevæv. I giftstoffer og spytkirtelsekret katalyserer disse enzymer hydrolysen af hyaluronsyre, hvilket resulterer i tab af den ekstracellulære matrix’ strukturelle integritet og dermed letter indtrængningen af antikoagulanter og andre aktive molekyler dybere ind i vævet . Desuden undertrykker og hæmmer det lavmolekylære heparin, der produceres ved heparinases spaltning, blodkoagulationen .

Apyrase (EC 3.6.1.5)

Apyraser er nukleotidaser, der er involveret i den enzymatiske nedbrydning af ATP og ADP til AMP. Sekreterede apyraser og 5′-nukleaser er velkendte og velkarakteriserede komponenter af spytkirtelsekret fra giftige og hæmatofage dyr, herunder igler . Apyraser er antikoagulanter, fordi de fjerner ADP, en vigtig inducerende faktor for blodpladeaggregation på steder med vævsskader .

Adenosin/AMP deaminase (EC:3.5.4.4)

katalyserer den hydrolytiske deaminering af adenosin til inosin. Adenosindeaminaser er velundersøgte og er fundet i spyt fra forskellige blodsugende insekter . ADA findes også i spytkirtelsekretet fra vampyrsneglen C. reticulata, som tilhører Spiralia, samt i igler . ADA menes at spille en vigtig rolle i fjernelsen af adenosin på grund af dets inddragelse i smerteopfattelsesprocesser .

Proteinaseinhibitorer

Antistasiner

Vi identificerede sekvenser svarende til proteinaseinhibitor I15 (igle antistasin) Fig. 4. Proteiner af denne familie findes almindeligvis i blodsugende igler og spiller en nøglerolle i hæmningen af blodkoagulationen. Deres vigtigste mål er serinproteaser, der deltager i hæmostase, som f.eks. faktor Xa, kallikrein, plasmin og thrombin . Ghilanten, en antistasin fra Haementeria ghilianii, blev påvist at hæmme blodpladeaggregation , og gigastasin fra den gigantiske Amazonasegl (Hementaria ghilianii) blev for nylig rapporteret at hæmme komplement C1 kraftigt . Antistasin fra Hementeria officinalis er den nærmeste homolog af de sekvenser, der er identificeret i vores undersøgelse.

CAP/CRISP

Superfamilien af cystein-rige sekretoriske proteiner/antigen 5/pathogenese-relaterede 1-proteiner (CAP) omfatter adskillige proteinfamilier, især cystein-rige sekretoriske proteiner (CRISP) Fig. 5a. De findes almindeligvis i giftstoffer fra slanger og andre krybdyr, og de fleste af dem er toksiner . I nogle undersøgelser blev CRISP’er fra hæmatofage arter anset for at være involveret i hæmostase (HP1). De identificerede sekvenser viser lighed med proteinsekvenser fra den hæmatofage parasitære nematode Ancylostoma caninum (krogorm), såsom kaliumkanalblokkeren AcK1 og den mulige trombocytaggregationsinhibitor HPI , samt med slangetoksinerne triflin (Protobothrops flavoviridis) og natrin-1 (Naja atra) . Blandt de differentielt udtrykte gener identificerede vi sekvenser med et nyt “Cys-rich”-motiv Fig. 5b. Denne gruppe af proteiner er karakteriseret ved tilstedeværelsen af et signalpeptid og to cysteinmønstre CX {5,14} CX {7} CX {8} СС {2} С og CX {7,17} CX {9} CX {8} СС {2} С.

Eglin-lignende

Egliner er små cysteinfrie proteiner, der tilhører I13-familien af serinproteinaseinhibitorer . Egliner fra igler har hæmmende aktivitet mod neutrofile elastaser og kathepsiner G og også at deltage i beskyttelsen af afgrødens indhold mod utidig proteolyse . Det skal bemærkes, at de sekvenser, der er identificeret i den foreliggende undersøgelse, har lav homologi med den klassiske eglin fra igler Fig. 6a.

Cystatin

Vi identificerede kun en cystatin-sekvens i proteomet af H. verbana. Cystatiner er små proteininhibitorer af cysteinproteaser (cathepsiner B, H, C, L, S) og findes ofte i sialotranskriptomerne fra forskellige flåter . Hos flåter spiller cystatiner en vigtig rolle i processer i forbindelse med immunforsvaret, regulering af endogene cysteinproteaser, der er involveret i fordøjelsen af blod og hæmafgiftning . Nematoden Nippostrongylus brasiliensis anvender cystatiner til at unddrage sig værtens immunsystem .

PAN-domæne

Dette domæne findes i talrige proteiner, herunder blodproteinerne plasminogen og koagulationsfaktor XI . PAN/æbledomænet i plasmaprækallikrein er kendt for at formidle dets binding til kininogen med højmolekylær vægt, og PAN/æbledomænet i faktor XI binder til faktor XIIa og IX, blodplader, kininogen og heparin . Det blev konstateret, at spytkirtelsekretet fra iglen H. officinalis indeholder leech antiplatelet protein (LAPP), som har et PAN-domæne og er involveret i hæmostase. Dette protein udviser affinitet for kollagenerne I, III og IV og hæmmer derved kollagenmedieret trombocytadhæsion .

Alpha-2-macroglobulin (α2M)

Det meget bevarede, multifunktionelle α2M er involveret i inhiberingen af en lang række proteaser (serin-, cystein-, asparagin- og metalloproteaser), interagerer med cytokiner og hormoner og spiller en rolle i zink- og kobberchelation . Det kan virke som en plasminhæmmer og derved hæmme fibrinolyse, men i nogle tilfælde hæmmer det koagulationen ved at inaktivere thrombin og kallikrein . Dette protein menes ikke kun at være involveret i iglens immunprocesser, men også at være en vigtig komponent i spytkirtelsekretionen, der forbedrer antikoagulationsprocesserne.

Molekyler involveret i adhæsion

Ficolin

Ficoliner er en komponent i det medfødte immunsystem og udløser en lektinafhængig vej for komplementaktivering . Hos hvirvelløse dyr er ficoliner involveret i genkendelse af bakterielle cellevægskomponenter . Det fibrinogenlignende domæne er til stede i proteiner med affinitet for erytrocytter, f.eks. tachylectin-5A (TL5A). TL5A udviser stærk hæmagglutinerende og antibakteriel aktivitet i tilstedeværelse af Ca2+ -ioner . I krybdyrgifte formodes ficolinlignende proteiner, ryncolin (fra Cerberus rynchops) og veficolin-1 (UniProt: E2IYB3) (fra Varanus komodoensis), at udløse trombocytaggregation og blodkoagulation.

F5/8 type C-domæne

En række identificerede sekvenser indeholder et eller flere discoidinmotiver (DS), kendt som F5/8 type C-domænet. Dette domæne findes i mange transmembranproteiner og ekstracellulære proteiner, f.eks. neuropiliner, neurexin IV og discoidin-domænereceptorproteiner og i proteiner, der er involveret i hæmostase, såsom koagulationsfaktor V og VIII . DS-domænet spiller en vigtig rolle i bindingen af forskellige ligandmolekyler, herunder fosfolipider og kulhydrater . På grund af disse egenskaber er DS-holdige proteiner aktivt involveret i celleadhæsion, migration og proliferation og aktivering af signalkaskader . Igle DS-domæneholdige proteiner synes at fungere som lektiner med høj affinitet for galactose og kan være komponenter i iglens medfødte immunsystem. Desuden kan de binde sig til kollagen eller fosfatidylserin på overfladen af blodplader og endothel og således ved kompetitiv hæmning forringe interaktionerne mellem hæmostatiske faktorer.

Low-density lipoprotein receptor a-familie

Low-density lipoprotein receptor (LDLR) familien er en vigtig komponent i blodplasmaet og er involveret i genkendelse og endocytose af low-density lipoproteiner i pattedyrsblod . I modsætning til kendte homologe proteiner er disse receptorer sekretoriske snarere end membranproteiner, og de indeholder fire LDLR klasse A (cysteinrige) gentagelser. Det antages, at nogle hvirvelløse dyr, herunder segmentorme, ikke er i stand til at syntetisere kolesterol og steroidhormoner, og under fødslen optager iglerne hovedsagelig kolesterol fra værtens blod som en eksogen kilde . Vi antager, at dette protein kan udnyttes af iglen til at opsamle og transportere kolesterolrige lipoproteinkomplekser.

R-type lectin

Proteiner, der indeholder ricin-type beta-trefoil lectin-domænet, er fundet i prokaryoter og eukaryoter. Hos dyr udviser R-type lektiner forskellige aktiviteter . De er til stede i scavengerreceptorer (mannose-, fucose- og kollagenreceptorer), N-acetylgalactosaminyltransferaser, hæmolytiske toksiner (CEL-III fra Cucumaria echinata) og apoptoseinducerende cytotoksiner . Tidligere blev lignende sekvenser identificeret i transkriptomer fra igler; forfatterne antog imidlertid, at dette molekyle har en mitokondriel lokalisering . Endnu en bemærkelsesværdig tæt homolog er det galaktosebindende lektin EW29 fra regnormen Lumbricus terrestris . EW29 består af to homologe domæner og har eksperimentelt vist, at den udviser hæmagglutinerende aktivitet . Da mange kendte R-type lektiner er involveret i adhæsion og udløser hæmolyse , er dette molekyle af interesse for yderligere undersøgelser.

vWFA-domæne

Dette domæne findes i forskellige plasmaproteiner: komplementfaktorer, integriner og kollagenerne VI, VII, XII og XIV . Et protein, der er identificeret i igleproteomet, er et sekretet protein, der består af fire kopier af vWFA-domænet Fig. 7. Sekvensen indeholder flere formodede genkendelsessteder: det metalionafhængige adhæsionssted (MIDAS), integrin-collagen-bindingsstedet og glycoprotein Ib-bindingsstedet (GpIb). Ifølge BlastX-analysen er dette domæne homologe med type VI-kollagen. I betragtning af proteinets domæneorganisering og tilstedeværelsen af glykoprotein- og kollagenbindingssteder indebærer en af de formodede virkningsmekanismer binding til overfladen af endothelet eller blodpladerne og forhindrer derved deres interaktion med kollagen. Denne binding ligger til grund for den kompetitive hæmning under hæmostase (trombocytespjældning) .