Baggrundsinformation

DNA-transfektion ved elektroporation er en etableret teknik, der kan anvendes til måske alle celletyper. Den giver en høj frekvens af stabile transformanter og har en høj effektivitet med hensyn til transient genekspression. Elektroporation har nu vist sig at være effektiv til at overføre plasmid-DNA in vivo til en række forskellige vævstyper. Elektroporation udnytter det faktum, at cellemembranen fungerer som en elektrisk kondensator, der ikke kan lade strømmen passere (undtagen gennem ionkanaler). Når membraner udsættes for et elektrisk højspændingsfelt, bryder de midlertidigt sammen og danner porer, der er store nok til, at makromolekyler (og mindre molekyler som f.eks. ATP) kan trænge ind i eller ud af cellen. Genlukningen af membranporerne er en naturlig nedbrydningsproces, som er forsinket ved 0 °C.

I den tid, porerne er åbne, kan nukleinsyre trænge ind i cellen og i sidste ende i kernen. Lineært DNA med frie ender er mere rekombinant og er mere tilbøjeligt til at blive integreret i værtskromosomet for at give stabile transformanter. Supercoiled DNA er lettere pakket ind i kromatin og er generelt mere effektivt til forbigående genekspression.

Brugen af højspændingselektriske stød til at indføre DNA i celler blev først udført af Wong og Neumann ved hjælp af fibroblaster (Wong og Neumann, 1982; Neumann et al., 1982). Teknikken blev derefter generaliseret (Potter et al., 1984) til alle celletyper – selv dem som f.eks. lymfocytter, der i modsætning til fibroblaster ikke kan transficeres med andre procedurer (f.eks, calciumfosfat eller DEAE-dextran DNA-koprecipitater).

Oliver Smithies og kolleger brugte derefter elektroporation til at indføre DNA i embryonale stamceller (ES-celler) og designede målrettede vektorer, der gjorde det muligt for det indførte DNA at rekombineres med homologe regioner i genomet og enten indføre et ændret gen eller en forstyrrende sekvens for at generere ES-celler med et specifikt gen “knocked in” eller “knocked out”. De ændrede ES-celler blev derefter brugt til at frembringe de tilsvarende knockin- eller knockout-mus. Elektroporation var nødvendig til disse genoverførselsanvendelser, fordi det introducerer DNA i cellerne i en nøgen form, som let kan deltage i homolog rekombination. Denne udvidelse af elektroporation førte til, at Dr. Smithies i 2007 modtog Nobelprisen for medicin eller fysiologi. Metoden til elektroporation af ES-celler er stort set den samme som for andre pattedyrceller. Hvis der ønskes homolog generstatning, skal der designes vektorer, der muliggør “positiv-negativ” screening (Bronson og Smithies, 1994; Joyner 2000), således at den ene udvælgelse genvinder alle celler, hvor det elektropraterede DNA er blevet indsat i genomet, og den anden udvælgelse er imod ES-kloner, hvor DNA’et er indsat tilfældigt. Knockin/out-mus kan derefter genereres ved at fusionere de udvalgte klonede ES-celler med embryoner, reimplantere for at muliggøre udvikling og avle de resulterende kimærer for at generere mus, hvor alle celler bærer det ændrede gen.

Men selv om hele planter eller bladvæv er blevet rapporteret som transfekterbare ved elektroporation, skal planteceller generelt fremstilles til protoplaster, før DNA let kan indføres i dem (alternativ protokol; Fromm et al., 1985; Ou-Lee et al., 1986). Ligesom pattedyrceller kan planteprotoplaster elektroporeres under en række forskellige elektriske forhold (kritiske parametre). Både høj spænding med lav kapacitet (kort impulsvarighed) og lav spænding med høj kapacitet (lang impulsvarighed) er blevet anvendt til at opnå en vellykket genoverførsel (Chu et al., 1991). In vivo EP blev oprindeligt anvendt til at overføre kemoterapeutiske midler til solide tumorer og er gået videre fra prækliniske undersøgelser til kliniske forsøg (Gothelf, et al., 2003). In vivo-overførsel af plasmid-DNA ved hjælp af elektroporation blev først rapporteret i begyndelsen og midten af 1990’erne (Titomarov, et al., 1991; Heller, et al., 1996; Nishi, et al., 1996) og var et logisk fremskridt baseret på succesen med in vitro-transfektioner med elektroporation og påvisningen af, at proceduren kunne udføres sikkert in vivo ved overførsel af små molekyler som f.eks. kemoterapeutiske midler. Anvendelsen af elektroporation in vivo til levering af plasmid-DNA har oplevet en enorm vækst i antallet af prækliniske undersøgelser, der er blevet gennemført, og er for nylig blevet overført til klinikken (Heller, et al., 2006a og Bodles-Brakhop, et al.,2009).

Den brede anvendelse af elektroporation er blevet muliggjort i vid udstrækning af tilgængeligheden af kommercielle apparater, der er sikre og lette at anvende, og som giver yderst reproducerbare resultater. Udformningerne af disse apparater varierer betydeligt, men falder i to grundlæggende kategorier, der anvender forskellige metoder til at styre pulsvarighed og spænding (de to elektriske parametre, der styrer poredannelsen). Den ene type anvender et kondensatorudladningssystem til at generere en eksponentielt aftagende strømimpuls, mens den anden type genererer en ægte firkantet bølge (eller en tilnærmelse af denne). Kondensatorudladningsinstrumenterne oplader deres interne kondensator til en bestemt spænding og udleder den derefter gennem celle-DNA-suspensionen. Både kondensatorens størrelse og spændingen kan varieres. Da strømimpulsen er en eksponentielt aftagende funktion af (1) den oprindelige spænding, (2) instrumentets kapacitetsindstilling og (3) kredsløbets modstand (herunder prøven), vil en ændring af kondensatorstørrelsen, så der kan lagres mere (eller mindre) ladning ved spændingen, resultere i længere (eller kortere) aftagende tider og dermed i en anden effektiv impulsvarighed. I modsætning hertil styrer firkantbølgegeneratorer både spænding og impulsvarighed med faststofskoblingsenheder. De kan også producere hurtigt gentagne pulser. Til in vivo-anvendelser foretrækkes firkantede generatorer. Ud over pulsvarighed og -amplitude har pulsantal og elektrodekonfiguration også indflydelse på effektiviteten af afgivelsen.

De fleste af vores in vitro-elektroporationsforsøg har anvendt Bio-Rad Gene Pulser, en kondensatorudladningsanordning, men kan direkte anvendes på andre kondensatorudladningsanordninger og med en vis tilpasning på firkantede bølgegeneratorer. Kondensatorudladningsapparater kan også fås hos GIBCO/BRL, BTX, Hoeffer Scientific og International Biotechnologies (se bilag 4 for leverandørernes adresser). Disse maskiner kan, enten i en enkelt enhed eller ved hjælp af tillægskomponenter, levere en række forskellige elektroporationsbetingelser, der passer til de fleste anvendelser. Kvadratbølgegeneratorer fås fra BTX, Baekon, CytoPulse Sciences, Sonidel, Bio-Rad, Jouan og IGEA og giver stor kontrol over pulsbredden, muliggør flere, hurtige impulser og kan være mere effektive til celler, der er meget følsomme eller på anden måde vanskelige at transficere. Anvendelse af elektroporation til genterapi på levende dyr eller mennesker kræver også god kontrol over elektroporationsparametrene for at sikre effektiv DNA-overførsel med minimal vævsskade, og dette kræver generelt firkantede generatorer. Der findes generatorer, der kan give impulser som enten konstant spænding eller konstant strøm. Ud over at levere kvadratbølgegeneratorer kan disse leverandører også levere elektroder, der er egnede til in vivo-elektroporation. Disse maskiner er generelt dyrere. Det er blevet klart, at vekselstrømpulser ved ~100 kHz kan være den mest effektive bølgeform til elektroporation og muligvis elektrofusion (Chang, 1989).

De fleste af vores in vivo-forsøg har benyttet BTX T820- eller T830-kvadratbølgegeneratorer. I disse eksperimenter er der anvendt kommercielt tilgængelige elektroder som f.eks. et 2-nåle-array, kaliperelektroder og pincetelektroder samt specialkonstruerede elektroder. Som nævnt ovenfor har de største leverandører af elektroporationsudstyr en række forskellige gennemtrængende og ikke-gennemtrængende elektroder til rådighed. Kvadratbølgegeneratorer giver bedre kontrol over impulsparametrene, hvilket er særlig vigtigt, når der udføres in vivo-tilførsel. Væksten i anvendelsen af in vivo-elektroporation er direkte forbundet med dens effektive indgivelse i musklerne . Anvendelsen af intramuskulær levering af gener ved hjælp af elektroporation har været særlig vigtig i forbindelse med vaccination (Abdulhagg, et al., 2008). Muskler har også vist sig at være et fremragende depot for genbaserede proteinerstatningsapplikationer (Trollet, et al., 2006). Levering til muskler kan også anvendes til levering af vacciner mod kræft (Bodles-Brakhop, et al., 2009). Levering til huden er også blevet accepteret som et alsidigt mål. Levering til huden kan anvendes til direkte behandling af kutane sygdomme, levering af proteiner til kredsløbet med henblik på systemisk behandling, kræftbehandling og til levering af DNA-vacciner (Hirao, et al., 2008, Roos, et al., 2006, Glasspool-Malone, et al., 2000).

Elektroporation kan være lettere at udføre end alternative teknikker, hvorfor den bliver mere og mere anvendt. Dens ulempe ved anvendelse til transient analyse er, at der er behov for næsten fem gange flere celler og DNA end ved enten calciumfosfat- eller DEAE-dextran-medieret transfektion (UNITS 9.1, 9.2 & 16.12). Den væsentligste forskel mellem elektroporation og calciumfosfat-koprecipitationsprocedurer er tilstanden af det integrerede DNA efter selektion i passende antibiotiske medier. I tilfælde af calciumphosphat er mængden af DNA, der optages og integreres i genomet i hver transficeret celle, i størrelsesordenen 3 × 106 bp. Som følge heraf integreres det transficerede DNA ofte som store tandem-arrays, der indeholder mange kopier af det transficerede DNA. Dette vil være en fordel, når der ønskes transfektion af genomisk DNA til modtagerceller og selektion for en fænotypisk ændring som f.eks. malign transformation; her er en stor mængde integreret DNA pr. modtagercelle afgørende. I modsætning hertil kan elektroporation indstilles til at resultere i en til mange kopier af indsat DNA pr. modtagercelle. Dette vil være en fordel for genekspressionsundersøgelser, da identiteten af den særlige kopi, der er ansvarlig for genekspressionen, kan kontrolleres, og som nævnt ovenfor er det afgørende for genmålretning af ES-celler med henblik på at generere transgene mus.