Infektion med Giardia lamblia er en af de mest almindelige årsager til diarrésygdomme på verdensplan (22). Dette protozoiske patogen koloniserer tyndtarmen og kan sætte sig fast på epitelet, men invaderer ikke slimhinden. Infektioner er normalt selvbegrænsende, da immunkompetente værter kan kontrollere og typisk udrydde G. lamblia, en proces, der involverer CD4 T-celler og dannelse af sekretorisk immunoglobulin A (IgA) og andre, dårligt forståede effektorer (6, 8, 9, 18). På trods af de ofte alvorlige kliniske symptomer, diarré, mavesmerter, malabsorption og vægttab, er infektionen ikke ledsaget af betydelig slimhindebetændelse (12). Disse observationer tyder på, at inflammatoriske mediatorer måske ikke er vigtige for parasitinduceret diarré, selv om de mekanismer, der styrer diarré ved giardiasis, er dårligt forstået. Giardia har ikke vist sig at frigive enterotoxiner, som kan være årsag til forstyrrelsen af tarmvæskeabsorptionen eller -sekretionen. Der sker en reduktion af den absorberende overflade som følge af tab af epitheliale mikrovilli ved infektion med Giardia hos mus (16), hvilket kan føre til osmotisk drevet diarré i forbindelse med malabsorption, men den absolutte reduktion af overfladen er beskeden i forhold til den forudsagte anatomiske reserve i tyndtarmen. Mennesker, der er inficeret med G. lamblia, udviser tegn på intestinal hypermotilitet ved radiologisk undersøgelse (15), et fænomen, der også er observeret hos eksperimentelt inficerede mongolske gerbiler (5). De underliggende mekanismer og den funktionelle betydning af disse fund er på nuværende tidspunkt uklare. Derfor var målet med den foreliggende undersøgelse at teste hypotesen om, at intestinal hypermotilitet repræsenterer en værtsforsvarsmekanisme mod Giardia ved hjælp af murine modeller af giardiasis.
Voksne C57BL/6, SCID og neuronale nitrogenoxidsyntase (nNOS)-deficiente mus blev fremskaffet fra The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Til infektioner med Giardia muris blev cyster renset ved saccharoseflotation, talt i et hæmocytometer under et fasekontrastmikroskop og givet ved oral gavage i vand med 104 cyster/mus i 0,2 ml (9). Til G. lamblia-infektioner blev trophozoitter af GS/M-stammen (ATCC 50580) (11) dyrket i TYIS-33-medium og givet ved oral gavage med 107 cyster/mus i 0,2 ml af det samme medium (9). Den lille tarmmotilitet blev bestemt ved hjælp af en modificeret testmåltidsmetode. Mus blev fastet natten over og fik 0,2 ml af en suspension af 106 fluorescerende polystyrenperler (Fluoresbrite YG-carboxylatmikrosfærer med en diameter på 10 μm; Polysciences, Inc., Warrington, PA) (19) og 6 % carminfarvestof i 5 % arabisk gummi arabicum i fosfatbufferet saltvand (PBS). Efter 20 min. blev tyndtarmen hurtigt fjernet, og placeringen af carminfarvefronten og hele tyndtarmens længde blev registreret. Tarmen blev derefter delt i otte lige store stykker, som hver især blev åbnet i længderetningen, lagt i 2 ml PBS og afkølet på is i 10 minutter. Blandingerne blev rystet kraftigt for at løsne trophozoitterne og perlerne, som derefter blev talt separat ved hjælp af henholdsvis fase-kontrast- og fluorescensmikroskoper. Den afstand, som carminfarvefronten tilbagelagde, blev udtrykt som en procentdel af hele tyndtarmens længde. Antallet af perler pr. segment blev udtrykt som en procentdel af det samlede antal perler i tyndtarmen. For at vurdere konsekvenserne af at hæmme tyndtarmens motilitet på giardial clearance blev musene først inficeret oralt med G. muris eller G. lamblia GS/M og behandlet ved oral gavage hver anden dag, begyndende på henholdsvis dag 7 eller dag 4, med 30 mg/kg loperamid eller med PBS som kontrol. Antallet af småintestinale trophozoitter blev bestemt på dag 21 for G. muris og på dag 9 for G. lamblia.
For at afgøre, om normale voksne mus er en egnet model til at studere tarmmotilitetens rolle i kontrollen af giardiainfektion, inficerede vi 8 til 10 uger gamle C57BL/6-mus med cyster af det naturligt forekommende murine patogen G. muris. Den lille tarmmotilitet blev bestemt ved hjælp af en testmåltidsmetode, hvor der blev anvendt karminfarvestof som en væskefasemarkør (14) og 10-μm polystyrenperler som en markør for partikler, der i størrelse svarer til Giardia-trofozoitter (19). Infektion med G. muris fremskyndede den lille tarmtransit, da fronterne af både carminfarvestof (Fig. (Fig.1A)1A) og polystyrenperler (Fig. (Fig.1B)1B) havde bevæget sig signifikant længere i inficerede mus end i uinficerede kontroller. En analyse af tidsforløbet af dette fænomen viste, at hypermotilitet opstod inden for en uge efter infektion, men toppede efter 2 til 3 uger, på et tidspunkt, hvor antallet af trophozoitter var faldet sammenlignet med antallet på tidspunktet for maksimal infektion efter 1 uge (Fig. (Fig.1A).1A). Således var de maksimale ændringer i den lille-intestinale motilitet forsinket i forhold til toppen i trophozoitbyrden, hvilket tyder på, at disse ændringer kan være forårsaget af en anden mekanisme end direkte giardial stimulering.
G. muris-infektion af vildtype-mus inducerer lille-intestinal hypermotilitet. (A) Voksne C57BL/6-mus blev inficeret oralt med 104 G. muris-cyster (uge 1 til 4) eller efterladt uinficeret som kontrol (uge 0). På de angivne tidspunkter efter infektion blev småtarmens motilitet (-) og trophozoitbelastning (○) undersøgt. Motilitetsdata er vist som den afstand, der tilbagelagt af et testmåltid indeholdende karminfarvestof i forhold til længden af hele tyndtarmen i løbet af en 20-minutters periode. Værdierne er middelværdier ± standardfejl af middelværdierne (SEM) af resultater for fire til syv dyr. Asteriskerne repræsenterer en signifikant (P < 0,05, t-test) stigning i motilitet i forhold til uinficerede kontroller. (B) Mus inficeret i 2 uger med G. muris (tomme søjler) og uinficerede kontroller (fyldte søjler) fik et testmåltid indeholdende 10-μm fluorescerende polystyrenperler, og perlepassagen blev vurderet efter 20 minutter. Antallet af perler i hvert af otte lige store tyndtarmsegmenter (som er nummereret i rækkefølge fra proximal duodenum til distalileum) er angivet som procentdele af det samlede antal perler i tyndtarmen. Der blev ikke fundet nogen signifikant forskel mellem antallet af resterende perler i maverne hos uinficerede og inficerede mus (henholdsvis 14,2 % ± 5,7 % mod 18,5 % ± 3,4 %). Værdierne er gennemsnit ± SEM for seks til syv dyr. Asterisker repræsenterer en signifikant (P < 0,05, t-test) stigning i forhold til uinficerede mus.
Dette fund minder om rapporter om Giardia-induceret tab af tarmepitheliale mikrovilli, hvor værtens adaptive immunrespons blev fundet at være ansvarlig (16, 17). For at vurdere, om lignende mekanismer kan være involveret i at forårsage små-tarm-hypermotilitet, evaluerede vi mus med svær kombineret immundefekt (SCID-mus). Disse mus mangler funktionelle T- og B-celler på grund af en defekt i den katalytiske underenhed af DNA-afhængig proteinkinase, PRKDC, som er nødvendig for normal V(D)J-rekombination, og de kan ikke udrydde Giardia (9, 18). G. muris-infektion af SCID-mus ændrede ikke den lille-intestinale transit, hvilket stod i skarp kontrast til observationerne hos de immunkompetente kontroller (Fig. (Fig.2).2). Disse resultater tyder på, at giardiasis-associeret små-tarm-hypermotilitet var afhængig af induktion af et normalt adaptivt immunrespons over for patogenet.
Afhængighed af intestinal hypermotilitet af intakte T- og B-cellefunktioner. Voksne C57BL/6 (wild-type ) og SCID-mus blev inficeret oralt med G. muris-cyster eller efterladt uinficeret som kontrol, og smaltarmmotilitet (A) og trophozoitantal (B) blev evalueret 2 uger efter infektion. Værdierne er gennemsnit ± SEM for fire til seks dyr. Asterisken betegner en signifikant stigning (P < 0,05, t-test) i forhold til uinficerede kontroller.
For at teste, om den observerede småintestinale hypermotilitet bidrog til clearance af Giardia, behandlede vi musene med loperamid, et lægemiddel, der hæmmer intestinal transit ved at aktivere μ-opioidreceptorer i mave-tarmkanalen (2, 13, 21). Lægemiddelbehandlingen blev påbegyndt på tidspunktet for den maksimale G. muris-infektion (dag 7) for at sikre, at farmakologisk inducerede ændringer i motilitet ikke ville forstyrre den indledende etablering af infektionen. Hæmningen af den lilleintestinale motilitet med loperamid kompromitterede markant giardial clearance, med 25-fold højere trophozoitantal i loperamidbehandlede mus end i PBS-behandlede kontroller efter 21 dage (Fig. (Fig.3).3). Loperamidbehandling havde ingen effekt på udviklingen af adaptiv immunitet, da titre af antigiardial IgA i tarmslimhindenes sekretioner ikke blev påvirket af behandlingen (data ikke vist). Desuden viste denne eksperimentelle strategi en lignende hæmmende virkning på murininfektion med G. lamblia GS/M, et humant giardialpatogen, der kan inficere normale voksne mus (3, 9). Mus behandlet med PBS havde stort set fjernet infektionen efter 9 dage, mens mus behandlet med loperamid fra dag 4 og fremefter fortsat havde et betydeligt antal G. lamblia trophozoitter i tyndtarmen (Fig. (Fig.3).3). Hæmning af tyndtarmens motilitet kompromitterede således clearance af Giardia i murinværten, uanset giardia-arten. Som en yderligere tilgang til at bestemme betydningen af intestinal motilitet i det antigiardiale værtsforsvar anvendte vi en genetisk tilgang, hvor forstyrrelse af genet for nNOS forstyrrer effektiv fremdrift i tarmen hos mus (20). Motilitetsanalyse bekræftede, at nNOS-deficiente mus udviste en konstitutiv forsinkelse i gastrointestinal transit sammenlignet med deres wild-type kuldemateriale (Fig. (Fig.4A).4A). Parallelt hermed klarede knockout-musene ikke G. lambliainfektion normalt (Fig. (Fig. (Fig.4B).4B). Således fandt vi ved hjælp af farmakologiske og genetiske tilgange, at nedsat intestinal motilitet var forbundet med forringelse af værtsforsvaret mod Giardia.
Farmakologisk hæmning af intestinal motilitet kompromitterer giardial clearance. Voksne C57BL/6-mus blev inficeret oralt med 104 G. muris-cyster eller med 107 G. lamblia GS/M-trofozoitter. Efter 7 dage (G. muris) eller 4 dage (G. lamblia) fik musene loperamid (Lop) eller PBS oralt hver anden dag. Antallet af trophozoitter i tyndtarmen blev bestemt på de angivne tidspunkter efter infektion. Værdierne er gennemsnit ± SEM for otte til ti dyr. *, P < 0,05, som bestemt ved t-test.
Mus, der mangler nNOS, udviser nedsat gastrointestinal transit og øget modtagelighed for Giardia-infektion. (A) Voksne mus med mangel på nNOS (nNOS-/-) og deres wild-type kuldemateriale kontroller (WT) blev testet for gastrointestinal motilitet ved hjælp af et karminfarvestof testmåltid. Værdierne er gennemsnit ± SEM for mindst tre dyr. *, P < 0,05 (t-test) i forhold til resultaterne for vildtype-mus. (B) Mus blev inficeret oralt med 107 trophozoitter af G. lamblia GS/M, og antallet af trophozoitter i tyndtarmen blev bestemt på de angivne tidspunkter efter infektion. Værdierne er gennemsnit ± SEM for tre til fire dyr. *, P < 0,05, i forhold til antallet på dag 4.
Vores undersøgelse viser, at intestinal hypermotilitet er et vigtigt værtsforsvar mod Giardia, en konklusion, der også blev nået i en anden nylig rapport (10). Dette forsvar synes at afhænge af udviklingen af et normalt adaptivt immunrespons mod parasitten, da det ikke opstod hos mus, der manglede T- og B-celler, selv om det i princippet er muligt, at T- eller B-celler bidrager til hypermotilitet uafhængigt af deres rolle i den adaptive antigiardiale immunitet. Immunafhængig hypermotilitet fungerer i værtens forsvar mod andre tarmparasitter, især helminths. F.eks. er udryddelse af rundormen Trichinella spiralis, som tilbringer en betydelig del af sin livscyklus i tyndtarmen, stærkt korreleret med øget intestinal motilitet (4, 23). Ligeledes er uddrivelse af krogorm Nippostrongylus brasiliensis hos rotter ledsaget af hypermotilitet i tyndtarmen, hvilket tyder på en rolle i værtens forsvar mod denne helminth (7). Fælles for alle disse enteriske patogener er deres primære, om ikke eksklusive, lokalisering i tarmlumen. Anatomisk set er dette infektionssted placeret uden for det egentlige epitelbeklædte legeme og er derfor ikke let tilgængeligt for mange immune effektorceller og -molekyler, såsom neutrofiler eller komplement, som opererer effektivt i kroppen. Faktisk udgør et effektivt antimikrobielt forsvar i tarmlumen en særlig udfordring for værten, som har et begrænset repertoire af forsvarsmekanismer på dette sted. Af disse er sekretorisk IgA almindeligvis anset for at være en vigtig luminal forsvarsmekanisme, men dens faktiske betydning for tarmclearance synes at være varierende og kan afhænge af dårligt definerede værts- og parasitfaktorer (6, 9, 18). Vores data og tidligere arbejde med helminths (4, 23) indikerer, at intestinal hypermotilitet er en anden vigtig forsvarsmekanisme mod kolonisering af tarmlumen.
Immunafhængig hypermotilitet kan give en mekanistisk forklaring på den diarré, der er forbundet med giardiasis, som det er bemærket i tidligere rapporter (5, 15). I princippet kan diarré være forårsaget af nedsat væskeoptagelse eller øget sekretion eller en kombination af disse to mekanismer. Der findes kun få beviser for øget ion- og væskesekretion ved giardiasis, hvilket efterlader nedsat væskeabsorption som den sandsynlige årsag. Forkortet kontakttid med luminalvæsker, som kan være indtaget eller stamme fra mave- eller pancreassekretion, vil forventeligt kompromittere effektiviteten af ionetransporten gennem epitelet, især når hypermotilitet kombineres med det rapporterede tab af absorberende epiteloverflader (16). Det skal dog bemærkes, at musene ikke udviser åbenlys diarré ved Giardia-infektion. Ikke desto mindre er det muligt, at der forekommer en ubalance i tarmvæsken hos både mennesker og dyr, og at den forbliver kompenseret hos mus, men ikke hos mennesker. Hvis hypermotilitet faktisk bidrager til patogenese af diarré, vil vores konstatering af, at SCID-mus ikke udviser Giardia-induceret hypermotilitet, betyde, at patienter med cellulære immundefekter, der er forbundet med øget modtagelighed for Giardia-infektioner (f.eks. kronisk variabel immundefekt), kan være mindre tilbøjelige til at udvikle infektionsassocieret diarré. Desuden tyder vores resultater på, at forsigtighed er påkrævet, når man overvejer at anvende intestinale motilitetshæmmere i behandlingen af Giardia-induceret diarré (1), da en sådan behandling kan forlænge den underliggende infektion.