NS2B-NS3 protease
Tredimensionelle strukturdata (3D) af målproteinet er blevet etableret som et primært krav for lægemiddelopdagelse. Både røntgenkrystallografiske strukturer og homologimodeller genereret for målproteiner er blevet anvendt til at identificere potentielle ligander fra kemiske databaser, men 3D-krystallografiske strukturer er blevet dokumenteret som værende mere effektive end in silico-genererede homologimodeller. Derfor blev 3D-strukturen af DENV NS2B-NS3-protease, der er blevet foreslået som et vigtigt terapeutisk mål mod DENV-infektion, hentet fra PDB (Protein Data Bank) med PDB ID: 2FOM40. Krystalstrukturen af NS2B-NS3pro blev opløst med en opløsning på 1,5 Å og viste to proteinkæder, dvs. kæde A foldet til at danne NS2B-kofaktor og kæde B, der omfatter NS3pro-domænet (fig. 2a). Heri blev protease-domænet (NS3pro) i kæde B (fig. 2b) udvalgt til strukturbaseret virtuel screening med udvalgte triterpenoider fra G. lucidum.
3D-struktur af DENV NS2B-NS3-protease: (a) bånddiagram af de to proteinkæder; kæde A (grøn farve) viser NS2B-kofaktoren og kæde B (rød farve) repræsenterer NS3pro-domænet, og (b) grafisk repræsentation af DENV-protease NS3pro-domænet mærket med det samlede antal aminosyrerester, atomer, tunge atomer og nettoladning samt forudsagte sekundærstrukturelementer (rør = alfa-helix, pile = beta-ark).
Virtuel screening og docking-simuleringsanalyse
For nylig har strukturbaseret virtuel screening vundet popularitet med henblik på opdagelse af nye ledende forbindelser fra store bioaktive kemiske biblioteker mod udvalgte mål. Denne fremgangsmåde omfatter simuleret docking af ligander ved det aktive område af den udvalgte receptor, efterfulgt af rangordning og scoring af inhibitorer23. I dette arbejde udførte vi strukturbaseret virtuel screening af 22 kendte antivirale triterpenoider fra G. lucidum mod NS3pro ved hjælp af Glide-modulet i Schrodinger-suiten (tabel S1). Disse inhibitorer blev yderligere analyseret ved hjælp af XP-dokningsprotokollen i Glide-modulet for at indsamle oplysninger om bindingsenergi samt yderligere bindingsmønstre med resterne på det aktive sted. Det blev observeret, at alle de udvalgte triterpenoider udviste betydelige bindingsaffiniteter over for NS2B-NS3pro undtagen Ganoderinsyre G (tabel S1). Molekylær docking af referenceinhibitoren 1,8-Dihydroxy-4,5-dinitroanthraquinon mod det samme aktive sted gav også en docking-score på -5,377 kcal/mol. Derfor blev triterpenoider med docking-scoringer, der var bedre end en tærskelværdi på -5 kcal/mol, udvalgt til molekylær interaktionsanalyse. Vi udvalgte i alt fire triterpenoider, nemlig Ganodermanontriol (-6,291 kcal/mol), Lucidumol A (-5,993 kcal/mol), Ganoderic acid C2 (-5,948 kcal/mol) og Ganosporeric acid A (-5,830 kcal/mol) som mulige inhibitorer for NS3pro-domænet af DENV-protease. Disse docking-scores blev betragtet som signifikante i sammenligning med den kendte inhibitor 1,8-dihydroxy-4,5-dinitroanthraquinon (-5,377 kcal/mol) og de rapporterede bioaktive molekyler Nimbin (-5,56 kcal/mol), Desacetylnimbin (-5,24 kcal/mol) og Desacetylsalannin (-3,43 kcal/mol) fra Azadirachta indica med DENV NS3pro41. Disse resultater viser potentialet af bioaktive triterpenoider fra G. lucidum som inhibitorer af DENV-protease og tyder på, at de kunne anvendes til udvikling af antivirale lægemidler mod DENV-infektion.
Molekylær interaktion og MM/GBSA-analyse
Da molekylære kontakter i protein-ligand-dockede komplekser kan føre til en forbedret forståelse af molekylære mekanismer i biologiske systemer42 , blev molekylær kontaktprofilering også undersøgt for de udvalgte triterpenoider og referenceinhibitor med DENV-protease. NS3pro-Ganodermanontriol-komplekset udviste interaktion ved moderat enkelt- og dobbeltbrintbindinger i den aktive region med henholdsvis Lys73 (3 Å), Thr120 (2,94 Å) og Asn167 (3,26 Å, 2,86 Å) rester. Der blev også registreret yderligere hydrofobiske tiltrækninger i NS3pro-Ganodermanontriolkomplekset ved resterne Trp50, Val72, Ile123, Val154, Val155 og Ala164. Desuden udviste resterne His51, Thr118, Asn119, Thr120, Asn152, Asn167 og Gly153 polar- og glycininteraktioner med henholdsvis Ganodermanontriol. I mellemtiden blev der også registreret positive (Lys73 og Lys74) og negative ladningsinteraktioner (Asp75) med rester i NS3pro-Ganodermanontriol-komplekset (fig. 3a,b).
3D- og 2D-dokkerede komplekser af NS3pro-domænet, der udviser intermolekylære kontakter med de respektive screenede triterpenoider; (a,b) NS3pro-Ganodermanontriol-kompleks, (c,d) NS3pro-Lucidumol A-kompleks, (e,f) NS3pro-Ganoderic acid C2 (g,h) NS3pro-Ganosporeric acid A. I 2D-komplekser repræsenterer rester i grøn, violet, rød, blå og grå farve henholdsvis den hydrofobiske, positive, negative, polære og glycininteraktion, og lyserøde pile viser hydrogenbindingsdannelsen.
Interaktionsprofilerne for NS3pro-Lucidumol A afspejlede to enkelte hydrogenbindinger dannet med resterne Asp75 (3,31 Å) og Asn152 (2,48 Å) og dobbelt hydrogenbindingsdannelse ved Gly153 (2,11 Å, 2,84 Å), som også bidrager til en glycininteraktion med resterne Gly151. Desuden blev hydrofobiske (Val72, Leu128, Phe130, Pro132, Tyr150, Val154 og Tyr161) og polære interaktioner (His51, Ser135 og Asn152) også logget i det dokkede kompleks. Asp75 udviser negative ladningsinteraktioner ved proteasens aktive lomme med Lucidumol A (fig. 3c,d). Også docket Ganoderic acid C2 kompleks med NS3pro viste moderat dobbelt hydrogenbindingsdannelse med Gly151 (2,73 Å, 3,12 Å), mens enkelt hydrogenbindingsdannelse blev observeret ved resterne Trp50 (2,66 Å) og Arg54 (1,93 Å). Desuden blev der i dette kompleks også registreret saltbrodannelse mellem hydroxylgruppen af ganodersyre C2 og Arg54-resten af protease. Desuden blev der også registreret polære (His51- og Asn152-resten), negative (Asp75-resten) og positive (Arg54-resten) interaktioner i NS3pro-Ganodersyre C2-dockingen (fig. 3e,f). NS3pro-Ganosporeric acid A-komplekset viste tre enkeltstående hydrogenbindinger dannet ved resterne Thr120, Asn152 og Asn167, mens Trp50, Val72, Ile123, Val154, Val155 og Ala164 blev markeret som udvisende hydrofobiske interaktioner (fig. 3g,h). Desuden udviste den dockede NS3pro med Ganosporeric acid A polære (resterne Thr118,Asn119,Thr120, Asn152 og Asn167), positive (Lys73 og Lys74) og negative ladningsinteraktioner (Asp75).
Dertil kommer, at en referenceinhibitor, 1,8-Dihydroxy-4,5-dinitroanthraquinon, også blev docket på det aktive sted for NS3pro-protease, og der blev registreret signifikante interaktioner. Dette kompleks udviser enkelt hydrogenbindingsdannelse ved rest Phe130, mens His51 blev noteret for saltbro og pi-pi-interaktion med inhibitoren. Desuden blev hydrofobiske (Leu128, Phe130, Pr0132, Tyr150 og Tyr151), polære (His51, Ser131 og Ser135) og glycin- (Gly151 og Gly153) interaktioner også markeret i det dokkede kompleks.
Det blev konkluderet, at alle de screenede triterpenoider udviste hydrogenbinding med NS3pro ved den katalytiske triade (His51, Asp75 og Ser135-rest) sammen med nogle andre konserverede rester (Phe130, Tyr150, Asn152 og Gly153), som er blevet rapporteret til at spille en betydelig rolle i substratbinding for DENV-protease43,44. Desuden blev nogle yderligere rester også logget for at dele hydrogenbindinger med forskellige ligander. Disse observationer tyder på, at hydrogenbindinger mellem en ligand og en af de katalytiske triaderester i NS3pro kan forstyrre elektronoverførslen mellem carboxyl- og imidazolgrupperne i henholdsvis Asp75- og His51-resterne. En sådan forstyrrelse er blevet rapporteret til at føre til et mislykket nukleofilt angreb på hydroxylgruppen (ß-OH) af rest Ser135, som er afgørende for at igangsætte proteolytisk aktivitet43,44. Det blev derfor konkluderet, at de screenede triterpenoider kan have vist en stærk affinitet over for NS3pro-domænet af DENV gennem forskellige intermolekylære interaktioner, og det blev foreslået, at de kunne virke som lægemidler mod DENV-infektion gennem NS2B-NS3pro-hæmning.
Dertil kommer, at alle fire triterpenoider, Ganodermanontriol, Lucidumol A, Ganoderic acid C2 og Ganosporeric acid A, blev også analyseret ved hjælp af MM/GBSA-beregninger for at beregne bindingsaffiniteten af de respektive ligander ved det aktive sted. Disse beregninger viste relativt negative MM/GBSA-værdier for alle fire komplekser, dvs. NS3pro-Ganodermanontriol (-24,465 kcal/mol), NS3pro-Lucidumol A (-19,735 kcal/mol), NS3pro-Ganodersyre C2 (-19,735 kcal/mol) og NS3pro-Ganodersyre C2 (-19,735 kcal/mol).039 kcal/mol) og NS3pro-Ganosporeric acid A (-11,449 kcal/mol), mens referenceinhibitorkomplekset NS3pro-1,8-dihydroxy-4,5-dinitroanthraquinon gav en større værdi (-38,934 kcal/mol). Disse observationer tyder på, at de udvalgte triterpenoiders hæmningsaktivitet mod NS3pro kunne være svagere end referenceinhibitoren, men antydede også, at ganodermanontriols stærkere bindingsaffinitet med NS3pro i sammenligning med de andre triterpenoider blev understøttet af de forudsagte docking-scores. Desuden viser forudsagte ΔG-værdier og fysisk-kemiske komponenter, dvs. ΔGBind Coulomb, ΔGBind covalent, ΔGBind vdW (van der Waals-kræfter), ΔGBind Solv SA (opløsningsmiddeltilgængeligt overfladeareal) og ΔGBind Solv GB (solvationsenergi generaliseret Born) analyse for de udvalgte triterpenoider og positiv kontrol komplekseret med DENV NS3pro-protein, at, afhængigt af liganden, at ΔGBind Coulomb og/eller ΔGBind vdW bidrog mest til stabiliteten af triterpenoid- og referencehæmmerkomplekserne med DENV NS3pro-protein. (fig. 4, S2, tabel S2). Ganodermanontriol blev derfor konkluderet som det mest lovende funktionelle triterpenoid for DENV NS3pro-protein og blev yderligere analyseret sammen med de andre triterpenoider ved hjælp af molekylær dynamik og in vitro-analyse.
Fri bindingsenergi (kcal/mol) beregnet ved hjælp af MMGBSA-metoden for screenede triterpenoider dvs. (a) Ganodermanontriol, (b) Lucidumol A, (c) Ganoderic acid C2 og (d) Ganosporeric acid A komplekseret med DENV NS2B-NS3 protease efter molekylær docking-simulering.
Molekylær dynamik (MD)-analyse
Interaktionsoplysninger, der er forudsagt ud fra mål-ligand beregnet ved hjælp af den molekylære dockingtilgang, kan valideres yderligere ved molekylær dynamiksimulering og krystallografiske undersøgelser38,41. Heri blev stabiliteten af de udvalgte triterpenoid-NS3pro-domænekomplekser evalueret ved hjælp af 10 ns MD-simulering med hensyn til root mean square deviation (RMSD), root mean square fluctuation (RMSF) og protein-ligand kontaktkortanalyse.
RMSD-analysen af C-alpha- og backbone-atomer i DENV NS3pro komplekset med alle fire ligander viste stabile og acceptable afvigelser i løbet af 10 ns MD-simuleringen (fig. 5). Interessant nok blev den endelige fluktuation for receptoren registreret som <2 Å RMSD, mens Ganodermanontriol-inhibitoren viste en stabil og maksimal variation på 6 Å i komplekset med NS3pro-domænet ved slutningen af simuleringsintervallet (fig. 5a). Også RMSF beregnet for både individuelle rester af receptoren og atomer af liganden viste tolerable variationer (mindre end 2,8 Å) i løbet af simuleringsintervallet (fig. S3a, S4a). Der blev imidlertid også observeret ubetydelige RMSF-svingninger i løbet af en tidsramme på 5 til 7 ns i keto- og methylgrupperne i ligandens cyclopenta-phenanthren-7-on-ring (Fig. S3a).
RMSD for alfa-kulstofatomer af NS3pro-protein og triterpenoider fra G. lucidum som ligand, (a) NS3pro-Ganodermanontriol, (b) NS3pro-Lucidumol A, (c) NS3pro-Ganoderic acid C2 og (d) NS3pro-Ganosporeric acid A, i 10 ns bane af MD-simuleringer.
Likeledes viste RMSD-analysen for NS3pro-Lucidumol A-komplekset, at både receptor og ligand udgjorde variationer på mindre end 3 Å i løbet af 10 ns simuleringsintervallet (fig. 5b). I mellemtiden forudsagde RMSF-analysen for både NS3pro og Lucidumol A variationer <3 Å, og der blev også registreret acceptable afvigelser i methyl- og hydroxylgruppen i heptanområdet af liganden i løbet af 10 ns simuleringsintervallet (Fig. S3b). Tilsvarende viste liganden i NS3pro-Ganodersyre C2-komplekset acceptable afvigelser i de indledende 2-5 ns efterfulgt af stabilitet, og den endelige afvigelse blev registreret på mindre end 8 Å i løbet af simuleringsintervallet på 10 ns (Fig. S4b).
NS3pro-Ganodersyre C2-komplekset udviste også ubetydelige afvigelser i receptoren mellem 2-5 ns efterfulgt af stabilitet med en endelig variation registreret på mindre end 1,75 Å i løbet af simuleringsintervallet (Fig. 5c). Disse acceptable afvigelser i liganden (mindre end 6 Å) og receptoren (3 Å) blev også understøttet af den beregnede RMSF for de respektive komplekser (fig. S3c, S4c).
Dertil kommer, at simuleringsanalysen af liganden i NS3pro-Ganosporeric acid A-dokket komplekset udviste en indledende lav afvigelse i 6 ns i carboxylgruppen placeret ved heptandelen af ligandens indledende efterfulgt af erhvervelse af en stabil tilstand ved 4,6 Å RMSD indtil slutningen af 10 ns intervallet (fig. 5d). I mellemtiden udviste NS3pro stabile svingninger omkring 1,6 Å RMSD med ubetydelige afvigelser i det indledende N-terminale område (fig. 5d). Disse observationer antydede stabiliteten af det respektive dockede kompleks som understøttet af RMSF-kurverne for de individuelle rester (mindre end 3,5 Å) og atomer (3 Å) af henholdsvis receptoren og liganden (Fig. S3d, S4d).
Et protein-ligand-interaktionskort, der beskriver de individuelle resters bidrag til intermolekylær binding, blev også genereret ud fra simuleringens banekurver (Fig. 6). Protein-ligand-interaktionskortet for NS3pro-Ganodermanontriol-komplekset viste deltagelse af Met49, Val72, Lys73, Lys74, Asp75, Leu76, Trp83, Glu88, Thr118, Thr120, Ile123, Val147, Leu149, Asn152, Gly153, Val154, Val155, Ala164, Ile165, Ala166 og Asn167-rester, der danner hydrogenbindinger, hydrofobiske tiltrækninger, ioniske interaktioner og vandbroer (fig. 6a). Leu149- og Asn152-rester blev fremhævet for at bidrage med fremtrædende vandbroer og hydrogenbindingsattraktioner i løbet af 10 ns simuleringsintervallet (Fig. 6a). Residuen Asn152 blev også forudsagt til at danne hydrogenbindinger i dockingkomplekset (fig. 3a,b), hvilket tyder på betydningen af denne rest i NS3pro for interaktion med Ganodermanontriol.
Normaliseret stablet søjlediagram for dockede komplekser, i.dvs. (a) NS3pro-Gandomanontriol, (b) NS3pro-Lucidumol A, (cc) NS3pro-Ganoderic acid C2 og (d) NS3pro-Ganosporeric acid A med forskellige kontakter og interaktionsprofiler, der er beregnet under MD-simuleringen. Værdier for interaktionsfraktioner >1,0 er plausible, da nogle rester skaber flere interaktioner af den samme undertype.
Interaktionskortet NS3pro-Lucidumol A viste deltagelse af His51, Arg54, Val72, Lys73, Lys74, Asp75, Leu128, Asp129, Phe130, Pro132, Ser135, Tyr150, Gly151, Asn152, Gly153, Val154, Val155, Tyr161 og Asn167-rester i hydrogenbindinger, hydrofobiske interaktioner og vandbrodannelse, med Asp75- og Gly153-rester for de største bidrag i henholdsvis vandbrodannelse og hydrogenbindingsdannelse (Fig. 6b). Molekylær dockinganalyse antydede også Gly153’s rolle i hydrogenbinding med liganden (Fig. 3c,d), hvilket indikerede vigtigheden af denne rest i protein-ligand stabilitet. Desuden blev Tyr161, Asp75 og Leu128-rester også angivet for større bidrag i henholdsvis vandformidlede, hydrogenbindings- og hydrofobiske interaktioner med denne ligand (fig. 6b). Disse resultater tyder på, at Gly153, Tyr161, Asp75 og Leu128 var fremtrædende ansvarlige for den stabile konformation af NS3pro-Lucidumol A-komplekset i løbet af simuleringsintervallet.
I mellemtiden udviste NS3pro-Ganodersyre C2-komplekset bidrag fra Lys28, Ile36, Trp50, His51, Arg54, Val72, Lys74, Asp75, Leu128, Asp129, Phe130, Ser131, Pro132, Ser135, Tyr150, Gly151, Asn152, Gly153, Val155 og Tyr161-rester i forskellige molekylære interaktioner i protein-ligand-kortlægningen i løbet af simuleringen (fig. 6c). Interessant nok blev den største intermolekylære interaktion bidraget af Arg54 gennem hydrogenbindingsdannelse efterfulgt af vandbroer og ionisk tiltrækning (Fig. 6c). Denne rest blev også forudsagt i den molekylære dockinganalyse til at danne to hydrogenbindinger med ganodersyre C2 (fig. 3e,f), hvilket tyder på, at den er en nøglefaktor for opretholdelse af mål-ligandstabilitet under simuleringen.
Sådan viste NS3pro-Ganosporesyre A-interaktionsprofilen også, at Try50, His51, Arg54, Asp71, Val72, Lys73, Lys74, Asp75, Thr118, Asn119, Thr120, Gly121, Thr122, Ile123, Gly151, Asn152, Gly153, Val154, Val155, Tyr161 og Asn167-rester bidrog aktivt til vandbroer, hydrofobiske og ioniske interaktioner (fig. 6d). Lys73, Lys74, Val155 og Asn167-rester blev imidlertid forudsagt at yde de største bidrag til stabiliteten af NS3pro komplekseret med Ganosporeric acid A-ligand via hydrogenbindinger, efterfulgt af vandbroer, hydrofobiske og ioniske interaktioner (Fig. 6d). Asn167 blev også markeret for at udvise brintbindingsdannelse med Ganosporeric acid A i det dokkede kompleks, hvilket afslørede dets betydelige bidrag til kompleksets stabilitet. Disse resultater validerede og antydede den betydelige stabilitet af hver enkelt triterpenoid med NS3pro-domænet af DENV-protease i dockingkomplekser. Derfor blev det igen foreslået, at disse triterpenoider kunne anvendes i formuleringen af lægemidler til DENV-infektion.