3.4 Inosinmodificering og mRNA-omsætning
Adenosin til inosin (A-I) modifikation af mRNA’er katalyseres af adenosindeaminaser, der virker på RNA-enzymer (ADAR’er). Disse enzymer har en præference for dobbeltstrengede RNA-regioner, og omdannelsen af A-I (også beskrevet som redigering i dette afsnit) vil ændre baseparringsegenskaberne for de modificerede baser, da de nu vil baseparre på samme måde som guanin. Som det blev gjort tidligere, vil vi adskille de direkte virkninger af inosin på mRNA-stabiliteten fra dem, der skyldes indirekte virkninger. Indførelse af inosin i dobbeltstrengede områder af RNA kan udløse nedbrydning gennem rekruttering af ribonukleaser, der er specifikke for inosinholdige RNA’er. Det første enzym, der foreslås at formidle denne virkning, er Tudor-staphylococcal nuclease (SN), som viste sig at fremme spaltning af hyperediterede dobbeltstrengede RNA’er i ekstrakter . De fleste af de resultater, der er beskrevet i denne undersøgelse, viser en biokemisk aktivitet for Tudor-SN på hyperediterede substrater in vitro. Det fremgår imidlertid ikke klart af disse undersøgelser, hvor stor en del af de mRNA’er, der indeholder inosin, der er genstand for spaltning af Tudor-SN in vivo, og om Tudor-SN var den direkte endonuklease eller ej. Tudor-SN blev fundet lokaliseret i cytoplasmatiske stressgranuler , så det er muligt, at nogle af dets måltransskriptioner kan være præferentielt reguleret under stressbetingelser. Den anden nuklease, der vides at være specifik for inosinholdige RNA’er, er human endonuklease V (hEndoV), som kan kløve en række inosinholdige RNA-substrater in vitro . En undersøgelse foreslog, at hEndoV er den egentlige inosin-endonuklease, idet Tudor-SN giver en stimulerende aktivitet til hEndoV . Interessant nok lokaliseres hEndoV også til cytoplasmatiske stressgranuler , hvilket tyder på en funktion svarende til Tudor-SN i den potentielle regulering af niveauerne af inosinholdige mRNA’er under stress. Samlet set er det klart, at der findes inosin-specifikke nukleaseaktiviteter i eukaryote celler (Fig. 5), men deres bidrag til mRNA-spaltning og omsætning er stadig dårligt forstået. Derfor skal den fysiologiske indvirkning af Tudor-SN og/eller hEndoV’s kløvning af hyperediteret dsRNA udforskes mere grundigt.
ADAR-enzymer kan også spille en vigtig rolle i mRNA-stabilitet ved at regulere bindingen af RNA-bindende proteiner, der påvirker mRNA-nedbrydningen. ADAR’ernes indflydelse på niveauet af deres mål-mRNA’er blev målt globalt, og generelt korrelerer deres indflydelse på mRNA-niveauer ikke godt med deres evne til at fremme inosindannelse i disse mRNA’er . Det ser snarere ud til, at ADAR’ernes vigtigste indvirkning på mRNA-stabiliteten sker gennem rekruttering af det RNA-bindende protein HuR (ELAVL1), som er en vigtig regulator af mRNA-nedbrydningen. ADAR1 interagerer med HuR på en RNA-afhængig måde, og de fleste mRNA’er, der nedreguleres i fravær af ADAR1, indeholder HuR-bindingssteder . ADAR1 ser således ud til at påvirke stabiliteten af sine mRNA-mål gennem rekruttering af HuR til målpladser, der er placeret i nærheden. ADAR’er kan også regulere niveauerne af flere mRNA’er og ncRNA’er ved at forhindre bindingen af nedbrydningsfaktoren PARN, som er en poly(A)-specifik nuklease . Denne funktion synes også at være uafhængig af redigering, da en katalytisk inaktiv ADAR-mutant er i stand til at opfylde enzymets funktioner i forbindelse med styring af henfald. ADAR’ernes indvirkning på stabiliteten af deres mRNA-mål synes således for det meste at være uafhængig af deres evne til at fremme dannelsen af inosin.
En vigtig konsekvens af inosinmodifikation på mRNA-omsætningen skyldes inosins indvirkning på mikroRNA-medieret genregulering. Tilstedeværelsen af inosin kan påvirke to vigtige trin i denne vej: (i) biogenese af mikroRNA’er og (ii) specificiteten af mikroRNA’ernes målretning af mRNA’er. Med hensyn til inosins indvirkning på mikroRNA’ernes biogenese blev det vist, at primære forløbere for mikroRNA’er kan redigeres af ADAR1 eller ADAR2 . Tilstedeværelsen af inosin i disse forstadier har to skadelige virkninger på produktionen af modne mikroRNA’er . For det første reducerer inosin effektiviteten af Droshas behandling af de primære forstadier; for det andet bliver inosinholdige forstadier nu et mål for inosinspecifikke ribonukleaser som Tudor-SN og/eller hEndoV . Disse kombinerede virkninger af inosinmodifikation på de primære mikroRNA-prækursorer resulterer i et fald i niveauerne af mikroRNA’er, der produceres fra disse prækursorer, med en samtidig stigning i mål-mRNA’erne. Denne proces kan reguleres, da det blev påvist, at forløbere af mikroRNA miR-151 mikroRNA redigeres under den tidlige udvikling, hvilket resulterer i nedbrydning af forløberne ved Tudor-SN . Mere generelt nedbrydes forløbere af mikroRNA’er, der indeholder inosin, i løbet af postzygotiske stadier hos mus . Disse resultater viser, at A-I-redigering af mikroRNA-prækursorer kan regulere deres biogenese under udviklingen, hvilket igen direkte påvirker ekspressionen af deres mRNA-mål. Alligevel er ADAR’ernes virkning på mikroRNA-biogenese kompleks, fordi ADAR1 også blev vist at heterodimerisere med RNase III-enzymet Dicer for at øge effektiviteten af mikroRNA-processeringen , og dermed spille en positiv rolle i mikroRNA-biogenese. Kompleksiteten af de direkte og indirekte virkninger af ADAR’er på små RNA-biogenese blev også påvist i hele genomet i Caenorhabditis elegans. Endelig kan ADAR1 også binde siRNA’er uafhængigt af RNA-redigering i pattedyrceller, hvilket begrænser virkningen af siRNA-behandling . ADAR’er synes derfor at være et tveægget sværd for microRNA- og small RNA-medieret gensilens, da den undertrykkende virkning af inosinmodifikation på microRNA-prækursorbehandling og -stabilitet kan opvejes af ADAR’ernes evne til at fremme microRNA-behandling gennem deres tilknytning til Dicer og deres virkning på siRNA-tilgængeligheden. Ikke desto mindre spiller disse enzymer vigtige funktioner i kontrollen af celledifferentiering gennem redigering af mikroRNA-prækursorer. For eksempel blev hypereditering af mikroRNA-forløberen Let-7 af ADAR1 i leukæmi vist at fremme fornyelse af leukæmi-stamceller , hvilket fremhæver betydningen af finjustering af redigering af mikroRNA-forløbere under celledifferentiering.
Inosin påvirker også mikroRNA-medieret mRNA-regulering ved at påvirke RNA-dupleksdannelse, hvilket er afgørende for at bestemme specificiteten af mikroRNA-mRNA-interaktioner (Fig. 5). Dette blev først påvist ved at vise, at introduktion af inosin i miR-376 microRNA resulterede i repression af en anden gruppe af mRNA’er i forhold til dem, der blev reprimeret af det umodificerede miR-376 . Hvis det redigerede sted befinder sig i mikroRNA’ets frøsekvens, resulterer ændringen i en ændring af specificiteten for mikroRNA’erne, fordi inosin fortrinsvis baseparres med C. Omvendt vil A-I-redigering i 3′-UTR-sekvenser af mRNA’er ændre mikroRNA’ernes potentielle målretning af disse UTR’er og kan skabe nye mikroRNA-bindingssteder . Reguleret redigering blev vist at være potentielt vigtig i reguleringen af onkogener og tumorsuppressorgener gennem mikroRNA’er under celletransformation .
Endelig kan inosin påvirke mRNA-stabiliteten gennem indirekte virkninger. Inosinholdige mRNA’er har vist sig at være begrænset til kernen i LPS-stimulerede immunceller , hvilket forhindrer deres eksponering for det cytoplasmatiske mRNA-nedbrydningsmaskineri. Kernetilbageholdelse af disse mRNA’er ville imidlertid udsætte dem for fortrinsvis nedbrydning gennem nukleare nedbrydningsveje som f.eks. det nukleare exosom. Dette kan resultere i en stigning eller et fald i stabiliteten, afhængigt af den relative effektivitet af hver af disse nedbrydningsveje for specifikke mRNA’er. Inosin påvirker også alternativ splejsning, hvilket igen kan resultere i mRNA-isoformer med forskellige stabiliteter. Dette gælder især, hvis de alternativt splejsede arter indeholder bindingssteder for forskellige RNA-bindingsproteiner, som modulerer deres stabilitet. Derfor kan inosin og ADAR’er påvirke mRNA-stabilitet og -ekspression på mange måder gennem en kombination af både direkte og indirekte virkninger.