Resultater

Analyse af kliniske prøver.

I september 2006 blev influenzaviruset A/Swine/Missouri/4296424/2006 (Sw/4296424) isoleret fra flere 5-6 uger gamle svin med multifokal bronchopneumoni på et kommercielt svineopdræt med mange forskellige kilder. Lungelæsionerne omfattede moderat, subakut til kronisk, purulent bronchopneumoni og interstitiel lungebetændelse med bronchiolitis og peribronchitis. Lungevævet var negativt for PRRSV (porcine reproductive and respiratory syndrome virus), PCV2 (porcine circovirus type 2) og Mycoplasma hyopneumoniae, men var positivt for Streptococcus suis. På grund af de karakteristiske influenzalignende læsioner og kliniske tegn på pneumoni blev lungevævshomogenatet inokuleret på Madin-Darby Canine Kidney (MDCK)-celler. Der blev påvist cytopatiske virkninger på dag 3 efter inokulation (p.i.). Influenzavirusets nucleoprotein (NP)-gen blev påvist i de inficerede celler ved RT-PCR. Viruset reagerede ikke med referencesvine-anti-sera (A/Sw/IA/1973 H1N1, A/Sw/TX/1998 H3N2, A/Sw/NC/2001 H1N1) i hæmagglutinationsinhibitionsassays (HI), og ved multiplex-RT-PCR blev der ikke påvist nogen H1N1- eller H3N2-gener (14). Virusset blev indsendt til National Animal Disease Center (NADC) i februar 2007 med henblik på subtypebestemmelse og sekventering.

Efter at isolatet fra september var blevet subtypebestemt og sekventeret (beskrevet nedenfor), viste en søgning i journalerne, at et andet “ikke-typificerbart” influenzaisolat var blevet indsendt i april 2006. A/Swine/Missouri/2124514/2006 (Sw/2124514) var blevet isoleret fra et 12 uger gammelt svin med luftvejssygdom på en anden kommerciel svineavlsbedrift, hvor der blev opdrættet og opfostret svin. Lungelæsionerne var histopatologisk karakteristiske for svineinfluenza (alvorlig, subakut betændelse i alveoler og bronkier med bronchiolær epitelcellenekrose og metaplasi). Lungen var negativ for PRRSV, PCV2 og M. hyopneumonia, men var positiv for influenza A-virus ved RT-PCR (specifik for NP-genet) og S. suis. Viruset blev indsendt til NADC i marts 2007 med henblik på subtypebestemmelse og sekventering.

Subtypebestemmelse og fylogenetisk analyse.

For at identificere og karakterisere begge influenzavirus blev der foretaget nukleinsyresekventering og molekylær og fylogenetisk analyse. Begge vira blev direkte sekventeret fra lavpassageisolater ved hjælp af MDCK-celler, og sekvenserne blev bekræftet efter plakoprensning og resekventering. De blev identificeret som H2N3-vira ved hjælp af nukleotidsekvenser og en BLAST-søgning i Influenza Sequence Database (www.flu.lanl.gov). HA-gen-segmentet i Sw/4296424 svarede bedst til H2-virus isoleret fra gråænder i Nordamerika . Dets NA-segment var nært beslægtet med det fra et H4N3 aviær influenzavirus (AIV) isoleret fra blåvinget krikand (98,3 % identitet). Med undtagelse af PA-genet (polymerase acidic) var dets interne gener afledt af nutidige triple-reassorterende svineinfluenzavirus, der i øjeblikket findes i USA. Disse vira bærer interne gener fra human (PB1), aviær (PB2, PA) og svineinfluenzavirus (SI tabel 4). PA-segmentet var i 99,2 % identisk med segmentet i H6N5 AIV, der er isoleret fra gråænder (SI-tabel 4). Sw/2124514- og Sw/4296424-virussegmentet viste 99,3-99,9 % total nukleotidsekvensidentitet (SI Tabel 5). Begge isolater blev gentagne gange klonet med plakater, testet igen og bekræftet ved sekventering som tilhørende H2N3-subtypen. H2N3-subtypen blev serologisk bekræftet ved hæmagglutinationsinhibitions- og neuraminidaseinhibitionsassays. En fylogenetisk analyse baseret på HA- og NA-generne viste, at disse to vira tilhører den amerikanske fuglelinie, der adskiller sig fra de eurasiske fuglestammer og H2N2-virus isoleret fra mennesker efter influenzapandemien i 1957 (fig. 1).

Molekylær analyse af HA- og NA-overfladeproteinerne.

Influenza A-virus indeholder to overfladeproteiner: HA er det receptorbindende og membranfusionsglycoprotein, og NA er et receptorødelæggende enzym. Den virale HA er en kritisk faktor for influenzavirus’ værtsartsspecificitet (15). For at karakterisere de rester i HA, der kan være forbundet med tilpasning af et aviærvirus til pattedyrværten, sammenlignede vi aminosyresekvenserne af svine-HA’er med aminosyresekvenserne af de formodede referenceaviærvirus. En molekylær sammenligning af HA-molekylerne fra de to H2N3-svineisolater viste, at de adskiller sig fra det formodede H2N3-referencevirus isoleret fra gråænder ved seks fælles aminosyresubstitutioner (D36N, Q226L, T274I, V316I, L419I og L506V) (SI Tabel 6). Substitutionen Q226L blev fundet i begge H2N3-svineisolater, mens position 228 indeholdt G, hvilket er identisk med konsensussekvensen for fugle (tabel 1) (16). I modsætning hertil indeholder humane HA-molekyler af H2-subtype 226L og 228S, mens tidlige humane H2-isolater indeholder 226L og 228G (tabel 1), hvilket svarer til svineisolaterne. Positionerne 36N, 274I, 316I og 419I er unikke for de to H2N3-isolater fra svin (SI Tabel 6), mens de respektive positioner i de humane og fugleisolater, der er afbildet i Fig. 1 a, er 36D, 274T, 316V og 419L. For de influenzaisolater, der er vist i fig. 1 a, er position 506V bevaret blandt humane, to H2N3-svineisolater og fugleisolater, undtagen for A/mallard/Alberta/2004 (H2N3), som vist i SI-tabel 6. Der blev fundet to fælles aminosyreændringer i NA-aminosyresekvensen i begge svineisolater sammenlignet med reference-H4N3-virus isoleret fra blåvinget krikand: H47Y og H253Y (SI Tabel 7). Position 47Y i begge H2N3-svineisolater er den samme som den tilsvarende aminosyre i eurasiske fugleisolater, der er vist i fig. 1 b; omvendt er positionen i nordamerikanske fugleisolater 47H. Position 253Y er unik for H2N3-isolaterne fra svin, og position 253H er bevaret i de eurasiske og nordamerikanske fugleisolater, der er vist i fig. 1 b. Det er interessant, at Sw/4296424 (H2N3), der blev isoleret 5 måneder senere end Sw/2124514 (H2N3), havde to yderligere substitutioner (P162S og L321V) i HA-molekylet og tre yderligere substitutioner (V30I, I49T og A135T) i NA-molekylet sammenlignet med HA- og NA-molekylet i Sw/2124514 (SI-tabellerne 6 og 7). Position 30I (Sw/4296424) i NA-molekylet svarer til eurasiske isolater, mens position 30V (Sw/2124514) er bevaret i nordamerikanske fugleisolater.

Patogenicitet og overførbarhed af H2N3-svininfluenzavirus hos svin.

For at undersøge omfanget af svinetilpasning af H2N3-virus undersøgte vi dets patogenicitet i denne vært ved at inokulere 20 4 uger gamle svin med 2 × 106 50% vævskulturinficerende dosis (TCID50) af Sw/4296424-virus. Der blev kun valgt ét H2N3-virus på grund af den store identitet mellem de to isolater. Tolv kontrolgrise blev simuleret med ikke-infektiøs cellekultur-supernatant. Vi vurderede overførbarheden ved at sætte 10 aldersmatchede kontaktgrise sammen med de inokulerede grise fra dag 3 p.i. Alle grise, der blev anvendt til undersøgelsen, var seronegative på dag 0 for antistoffer mod H1N1-, H1N2-, H2N3- og H3N2-virus ved HI-undersøgelse. Fem inokulerede grise og tre kontrolgrise blev aflivet med henblik på nekropsi på dag 3, 5 og 7 p.i. De 10 kontaktgrise og 5 virusinokulerede grise blev serologisk testet ved HI-assay med H2N3 på henholdsvis dag 24 efter kontakt eller dag 27 p.i. Der blev ikke observeret nogen akutte respiratoriske tegn. Ved nekropsis blev der konstateret alvorlige makroskopiske lungelæsioner (plum-farvede, konsoliderede områder) hos de inokulerede svin, men ingen hos kontrolsvinene (tabel 2). Den histopatologiske score (0-3), der udtrykker omfanget af skader på lungearkitekturen, var >2 hos de inokulerede grise (tabel 2). Lunger fra inokulerede grise, der blev aflivet på dag 3, 5 eller 7 p.i., viste mild til moderat interstitiel pneumoni og akut til subakut nekrotiserende bronchiolitis med let lymfocytære manchetter i bronchioler og kar (fig. 2). Virus blev titreret i bronkoalveolær lavagevæske (BALF) og isoleret fra nasale svaberprøver. Virustiterne i lungen varierede fra 104,3 til 106,5 TCID50/ml på dag 3 og 5 p.i. (SI Tabel 8) og var negative på dag 7 p.i. I den H2N3-inokulerede gruppe blev virus isoleret fra næsesvaberprøver hos 25 % (5 ud af 20) af svinene på dag 3, 67 % (10 ud af 15) på dag 5 og 20 % (2 ud af 10) på dag 7 p.i.; i kontaktgruppen var 10 % (1 ud af 10) af prøverne positive på dag 5 og 7 efter kontakt. I modsætning hertil var 100 % (10 ud af 10) af kontaktsvinene seropositive efter 24 dage efter kontakt med de inokulerede svin (SI Tabel 9). Nogle kontrolgrise havde lejlighedsvis et lille fokus af mild interstitiel lungebetændelse (tabel 2), men de var negative for svineinfluenzavirusinfektion. Alle svin var negative for PRRSV og M. hyopneumoniae ved PCR. Vores resultater tyder på, at H2N3-virus er patogent hos svin og kan overføres mellem svin.