Vækst og ethanolproduktion af S. cerevisiae NCYC 2826 på hvedestråhydrolysat

Figur 1A viser væksten af S. cerevisiae National Collection of Yeast Cultures (NCYC) 2826 dyrket ved 30 °C i 36 timer i en kultur, der indeholder et hydrolysat med en glukosekoncentration på 123 mM fremstillet som beskrevet i afsnittet “Metoder”. S. cerevisiae-stammen blev valgt på grund af dens rapporterede høje ethanoltolerance og robusthed i industrielle fermenteringer. Figur 1A viser, at når S. cerevisiae NCYC 2826 blev dyrket på hvedestråhydrolysat alene, var der en langsom væksthastighed μ på 0,036 h-1 og en endelig optisk tæthed (OD) på 0,8. Tilsætning af gærnæringsbasis (YNB) til mediet medførte en stigning i μ til 0,135 h-1 og en endelig OD på 1,5, mens tilsætning af 2,3 mg ml-1 urea til hvedestråhydrolysatet gav en μ på 0,99 h-1 og en endelig OD på 1,3. Tidligere undersøgelser har vist, at urinstoftilskud kan øge ethanolproduktionen ved gærgæring, og at urinstof i sig selv er en væsentlig bestanddel i de mest minimale gærvækstmedier . Vores resultater understøtter disse tidligere resultater og bekræfter, at urinstof er nødvendigt for næsten optimal vækst af gær. Efter 36 timer blev ethanolkoncentrationen i kulturerne målt, og udbyttet af ethanol opnået fra 123 mM glukose var ca. 90 % af det samlede teoretiske udbytte for alle kulturer. Selv om der blev produceret ethanol med et sammenligneligt udbytte under disse tre kulturbetingelser, var væksten langsommere og den endelige optiske tæthed mindre på hvedestråhydrolysat, end når der blev tilsat enten urinstof eller YNB til kulturen. Dette tyder på, at selv om glukose var tilgængeligt til fermentering, indeholdt hydrolysatet ikke tilstrækkelige næringselementer til, at kulturen kunne dele sig med maksimal hastighed og opnå optimal tæthed.

For at undersøge årsagen til den nedsatte cellevækst på hvedestråhydrolysat blev S. cerevisiae NCYC 2826 dyrket på hydrolysat fremstillet med 5 %, 10 %, 15 % og 20 % startkoncentration af halm og suppleret med 2,3 mg ml-1 urea. Figur 1B viser, at efterhånden som den indledende halmkoncentration steg, steg vækstens forsinkelsesfase også til 20 timer ved en indledende halmkoncentration på 20 %. Den endelige OD-værdi steg også med stigende halmkoncentration som følge af de øgede koncentrationer af frigivet glukose. Den øgede forsinkelsesfase er karakteristisk for væksthæmning på grund af furanforbindelser, der ofte findes i halmhydrolysater . En analyse af hydrolysatets furanindhold viste, at HMF-indholdet var ubetydeligt (data ikke vist), men at koncentrationen af furfural steg med den oprindelige halmkoncentration og nåede op på 0,5 mg ml-1 ved et oprindeligt halmindhold på 20 % (figur 2). Disse data tyder på, at væksten af S. cerevisiae NCYC 2826 på hvedestråhydrolysat begrænses af koncentrationen af furfural, der er til stede i hydrolysatet.

Koncentration af glukose (firkanter) og furfural (trekanter) til stede i hvedestråhydrolysater fremstillet som beskrevet i afsnittet ‘ Metoder ‘ med en stigende koncentration af initial halm.

Analyse af SGRP-stammsætets vækst på furfural

For at identificere gærstammer, der kan være resistente over for forurenende furfural, blev SGRP-stammsættet beskrevet i metoderne dyrket i YNB, 100 mM glukose og tilstedeværelsen af 1,5 mg ml-1 furfural. Tabel 1 viser analysen af SGRP-stammsættets tolerance over for 1,5 mg ml-1 furfural ved hjælp af det pointsystem, der er beskrevet i afsnittet “Metoder”. Der var behov for et pointsystem i stedet for gennemsnitlige forsinkelsestider, da replikater af stammer, der ikke voksede, ikke havde en målbar forsinkelsesfase, men stadig skulle medtages i datasættet.

Vi havde tidligere observeret, at en forøgelse af inokulumet i furfuralholdige kulturer førte til et fald i forsinkelsesfasen, formentlig ved at maksimere mængden af levedygtige gærceller, der blev introduceret i mediet, hvilket førte til hurtigere etablering af eksponentiel vækstfase (data ikke vist). Til disse eksperimenter blev der derfor anvendt en 5 % inokulummængde af en overnatningskultur. Dataene i tabel 1 viser, at væksten på replikapladerne var yderst variabel og også stammeafhængig, hvilket viser, at en koncentration på 1,5 mg ml-1 furfural er tilstrækkelig til at skelne mellem furfuraltolerance hos stammer af S. cerevisiae og S. paradoxus. Da stammerne blev testet i YNB med 100 mM glukose og enten 2,0 eller 3,0 mg ml-1 furfural, blev der kun observeret meget lidt vækst under nogen af disse betingelser hos nogen af de analyserede stammer. Det blev derfor besluttet at udvælge stammerne på grundlag af dataene for 1,5 mg ml-1 og at underkaste dem en mere detaljeret furfural-screening. Analysen af dataene i tabel 1 viser, at S. cerevisiae-stammerne generelt voksede bedre end S. paradoxus-stammerne på 1,5 mg ml – 1 furfural. Næsten 20 % af de testede S. paradoxus-stammer fik ikke den bedste karakter i pointsystemet, mens det for S. cerevisiae var mindre end 10 %, hvilket også afspejles i den højere gennemsnitlige samlede score for S. cerevisiae på 2,5 ± 1,4 sammenlignet med 2,1 ± 1,4 for S. paradoxus. Inden for hver stamme var der imidlertid en betydelig variation, idet scoren varierede fra 1,7 til 3,7 for S. cerevisiae og fra 0,3 til 3,0 for S. paradoxus. Stammer, der scorede over 2,9 med en standardafvigelse på mindre end 1,5, blev anset for at udvise en betydelig furfuraltolerance. Derfor blev S. cerevisiae-stammerne NCYC 3284 (ex jord, USA), NCYC 3290 (ex bilivin, Vestafrika), NCYC 3312 (ex jord, Nederlandene) og NCYC 3451 (ex urt, Irland) sammen med S. paradoxus NCYC 3277 (ex egebark, Det Forenede Kongerige) undersøgt yderligere i en mere detaljeret furfural-screening.

Virkninger af stigende koncentrationer af furfural på vækst og ethanolproduktion

Figur 3 viser vækst i tilstedeværelse af varierende mængder furfural (0,1 til 4,0 mg ml-1) for S. cerevisiae-stammerne NCYC 3284, NCYC 3290, NCYC 3312 og NCYC 3451 og S. paradoxus-stammen NCYC 3277, der i tabel 1 fra SGRP-stammsættet er identificeret som havende øget resistens over for furfural. Supplerende fil 1: Figur S1 viser de tilsvarende vækstdata plottet på en logaritmisk skala. Kontrolstammen S. cerevisiae NCYC 2826 blev også medtaget til sammenligningsformål. For alle seks stammer gælder det, at når furfuralkoncentrationen øges, begynder vækstkurverne at vise stigninger i forsinkelsesfasen, som tidligere set i vækster, der indeholder furfural. Alle testede stammer var i stand til at vokse på YNB suppleret med 100 mM glucose og 0,1-1,5 mg ml-1 furfural. S. cerevisiae NCYC 2826, vores kontrolstamme, var kun i stand til at vokse på op til 1,5 mg ml-1, hvilket førte til en 30 % reduktion i den endelige OD sammenlignet med vækst på 0,1 mg ml-1 furfural. Tabel 2 viser, at ethanolproduktionen af NCYC 2826 under disse betingelser var betydeligt reduceret sammenlignet med det udbytte på ca. 90 %, der blev observeret ved dyrkning på YNB og glukose alene eller på hvedestråhydrolysat. S. cerevisiae NCYC 2826 blev isoleret fra druemost og har derfor sandsynligvis ikke udviklet evnen til at vokse og gære under eksponering for furfural.

I deres populationsgenomiske undersøgelse har Liti et al. identificerede de fem veldefinerede, geografisk isolerede S. cerevisiae-stammer (malaysisk, nordamerikansk, Saké, vestafrikansk og “Wine/European”) samt mange forskellige rekombinante (mosaik) stammer fra disse stammer. Det fremgår af resultaterne af denne undersøgelse, at furfuralresistens ikke er et fænotypisk kendetegn, der er specifikt for en bestemt S. cerevisiae-linje. Af de fire furfuralresistente SGRP S. cerevisiae-stammer, der er identificeret, tilhører NCYC 3284 (YPS128) den nordamerikanske slægt, NCYC 3290 (DBVPG 6044) den vestafrikanske slægt, NCYC 3312 (DBVPG 1373) den “vin-/europæiske” slægt, mens NCYC 3451 (et single spore-derivat af NCYC 361) er en rekombinant stamme.

S. cerevisiae NCYC 3451 udviste den største furfuralresistens (figur 3F, Additional file 1: Figur S1F) og var i stand til at vokse i tilstedeværelse af op til 3,0 mg ml-1 furfural. Desuden syntes ethanolproduktionen i denne stamme ikke at blive hæmmet af furfural, idet det højeste ethanoludbytte (95 ± 15 %; tabel 2) blev opnået ved en (furfural)koncentration på 3,0 mg ml-1. Som allerede nævnt er NCYC 3451 en rekombinant stamme og har vist sig at have et mosaiklignende genom, der stammer fra mindst tre forskellige slægter, nemlig Saké, vestafrikansk og “Wine/European” (Liti et al. ). Selv om det er registreret, at den er isoleret fra urt som ølgær, tyder denne stammes meget komplekse genomstruktur stærkt på, selv om det ikke er bevist, at den er af industriel oprindelse (f.eks. en bage- eller bryggeristamme). Blandt de fire resterende testede SGRP-stammer kunne S. cerevisiae-stammerne NCYC 3290 og NCYC 3312 begge vokse på 2,5 mg ml-1 furfural (henholdsvis figur 3D,C, Additional file 1: Figur S1D og S1C), mens S. cerevisiae NCYC 3284 (figur 3E, Additional file 1: Figur S1E) og S. paradoxus NCYC 3277 (figur 3B, Additional file 1: Figur S1B) kun kunne vokse på 2,0 mg ml-1 furfural. Samlet set blev ethanolproduktionen i de fem SGRP-stammer ikke væsentligt påvirket af tilstedeværelsen af furfural. For NCYC 3312 førte tilstedeværelsen af 0,5 mg ml-1 furfural faktisk til en bemærkelsesværdig stigning i ethanoludbyttet fra 41 ± 8 % forventet udbytte til 75 ± 5 % (tabel 2). Dette blev også observeret for den ølforbrydende stamme NCYC 3451, men i mindre grad (kun en stigning i udbyttet på 14 %; tabel 2). Det er faktisk for nylig blevet vist, at små mængder furfurylalkohol, et produkt af furfuraldehydrering i gær, faktisk kan føre til en stigning i ethanolproduktionen .