MUKUS HYPERSEKRETION OG KRONISK RESPIRATORISK SYGDOM

Hypersekretion af slim i luftvejene er en vigtig bidragyder til morbiditet og mortalitet hos mange patienter med alvorlige kroniske lungesygdomme, såsom kronisk lungeobstruktiv sygdom (COPD), astma og cystisk fibrose.35 Overdreven slim i luftvejene kan begrænse luftstrømmen; og dets tilstedeværelse er en særlig risikofaktor for de patienter med KOL, der er tilbøjelige til at få infektioner i brystet. KOL er en alvorlig kronisk inflammatorisk sygdom i luftvejene, der omfatter tre tilstande, nemlig kronisk bronkitis (langvarig slimhypersekretion i luftvejene), sygdom i de små luftveje og emfysem.36 Den er stigende på verdensplan i prævalens og økonomisk byrde.37,38 Ved KOL har patienter med kronisk slimhypersekretion en signifikant øget risiko for hospitalsindlæggelse og død sammenlignet med patienter uden en markant bronkitisk komponent.39,40 De nuværende behandlinger for KOL er palliative og standser ikke sygdomsprogressionen,41 og der findes ingen specifik behandling for slimhypersekretion.42 I mangel af effektiv behandling af noget aspekt af KOL’s patofysiologi er udvikling af behandlinger for slimhypersekretion berettiget. Evnen til at fjerne slim fra lungerne ved hjælp af luftvejsciliernes bevægelse afhænger af dets viskositet og elasticitet. Disse egenskaber bestemmes af den vægtmæssige andel af mucinglycoproteiner, som slimmet indeholder.43 MUC5AC og MUC5B er de vigtigste muciner i både normale og patologiske menneskelige luftvejssekretioner.44 Hos patienter med KOL er niveauerne af mucinerne MUC5AC og MUC5B forhøjet i luftvejsslimhinden, selv om der udskilles forholdsmæssigt mere MUC5B.45 Mucinerne udskilles i luftvejene af gobletceller i epitelet og seromukøse kirtler i submucosa.43 En mulighed for at hæmme slimsekretionen er at udnytte den hæmmende aktivitet af de clostridielle neurotoksin-endopeptidaser på vesikelfusion, der er målrettet mod de mucinsecernende celler i luftvejene ved hjælp af en passende målretningsligand.

For at undersøge, om en passende målrettet clostridiel endopeptidase ville kløve SNARE-proteiner i humane respiratoriske epitelceller og derved hæmme slimsekretionen, blev der genereret et fusionsprotein fra et rekombinant gen, der koder for LHN-domænet af BoNT/C og EGF, kaldet EGF-LHN/C, for at målrette EGF-receptorer på de mucinsekreterende celler34 . EGF blev valgt som prototype-ligand til oprettelse af et sådant fusionsprotein, fordi EGF-receptorer er til stede på humane respiratoriske epitelceller46,47 og er opreguleret i luftvejsepitelet hos patienter med astma og KOL48 samt rygere49 . Det rekombinante fusionsprotein EGF-LHN/C kløvede det relevante SNARE-protein syntaxin i en human mucoepidermoid metastatisk cellelinje, H292-celler, in vitro på en koncentrationsafhængig måde.34 Forbehandling af H292-celler med EGF-LHN/C hæmmer den stimulerede frigivelse af mucin som reaktion på en kombineret stimulus af EGF og tumornekrosefaktor-α (TNFα) på en koncentrationsafhængig måde med en IC50 på ca. 0,4 nM (fig. 28-1). Dette kan meget godt sammenlignes med den tidligere rapporterede hæmmende virkning af EGF-LHN/C på stimuleret mucinfrigivelse fra en anden respiratorisk epitelcellelinje, den humane type II alveolære cellelinje A549, som reaktion på samme stimulus.34 I begge celletyper var der ingen påviselig virkning af EGF-LHN/C på det basale niveau af mucinudskillelse. Hæmningen af mucinsekretion ved EGF-LHN/C skyldes den målrettede afgivelse af dets endopeptidaseaktivitet gennem EGF-receptoren og er ikke et resultat af cellecytotoksicitet eller receptorantagonisme eller nedregulering34 . EGF-LHN/C er også i stand til at hæmme stimuleret mucinfrigivelse fra A549-celler som reaktion på en stimulerende cocktail af cytokiner, en kombination af 1 ng/mL interferon (IFN)-γ, TNFα og interleukin (IL)-1β, kaldet cytomix (fig. 28-2). Virkningen af EGF-LHN/C på stimuleret mucinfrigivelse fra respiratoriske epitelceller er således uafhængig af den præcise art af den anvendte stimulus. Histologisk undersøgelse viser, at mucinet bliver tilbageholdt inde i de behandlede celler (fig. 28-3). Kontrolceller indeholder farvet intracellulært mucin, mens stimulerede celler viser markant reduceret farvning, hvilket indikerer mucinsekretion. Stimulerede celler, der er forbehandlet med EGF-LHN/C, viser tilbageholdt intracellulær farvning, hvilket indikerer en hæmning af sekretionen af EGF-LHN/C. For at vurdere cellernes reaktion på en sådan intracellulær tilbageholdelse af mucin blev virkningen af EGF-LHN/C-forbehandling på MUC5AC mRNA-niveauet målt som en indikator for mucinsyntese. EGF-LHN/C-forbehandling er forbundet med en koncentrationsafhængig hæmning af EGF-TNFα-induceret MUC5AC mRNA-ekspression, med en IC50-værdi på ∼0,1 nM (Fig. 28-4). Som med hæmningen af stimuleret mucinfrigivelse fra cellerne skyldes denne virkning af EGF-LHN/C den målrettede afgivelse af dets endopeptidaseaktivitet gennem EGF-receptoren, fordi hverken et LHN/C, der mangler en EGF-ligand til at målrette det til EGF-receptoren, eller en muteret form af fusionsproteinet, hvor endopeptidaseområdet er blevet inaktiveret ved tre restændringer i den katalytiske region (EGF-TE-LHN/C), hæmmer MUC5AC mRNA-ekspression. Denne virkning af EGF-LHN/C på MUC5AC mRNA-ekspression tyder på, at der muligvis findes en negativ feedback-mekanisme mellem mucinfrigivelse og mucinsyntese i respiratoriske epitelceller, og at genekspressionen nedreguleres som reaktion på hæmning af sekretion med en rekombinant clostridiel endopeptidase.

Rekombinante clostridielle endopeptidase-fusionsproteiner, der kan hæmme slimsekretion, som eksemplificeret ved EGF-LHN/C, har potentiale til udvikling som terapeutiske proteiner til behandling af KOL, kronisk bronkitis, cystisk fibrose og andre kroniske respiratoriske tilstande, der involverer overproduktion af slim i luftvejene. Proteinets langvarige aktivitet vil betyde, at produktet kun skal inhaleres sjældent, hvilket gør det velegnet til behandling af kroniske luftvejssygdomme af denne type.