Typer af hæmocytter hos fårekyllinger

Figur 1A viser et DIC-mikroskopibillede (differentiel interferenskontrast) af fårekyllingehæmocytter, der viser celler af forskellige størrelser og former. For nøjagtig identifikation af disse hæmocytter blev ca. 1.000 celler klassificeret efter deres størrelse og morfologi (data ikke vist) i seks typer (fig. 1B~G). Som vist i Fig. 1B blev den typiske granulocyt observeret i hæmolymphen. Granulocytterne var normalt runde eller ovale i form, og der blev observeret mange polymorfe granula i cytoplasmaet. Der blev observeret små pseudopodier eller filopodier på granulocytternes plasmamembran (fig. 1B, angivet med hvide pile). Den celle, der er vist i fig. 1C, blev anset for at være plasmatocytter på grund af deres typiske spindelform og de lange, hårlignende strukturer, der blev observeret i begge ender af plasmamembranen (angivet med hvide pile). Figur 1D viser en prohemocyt, som er de mindste runde celler, der er observeret i insekthæmolymphen. Kerner var store i forhold til cellestørrelsen og var placeret i midten af cellen (fig. 1D). Prohemocytternes cytoplasma og kerne var således ofte ikke til at skelne fra hinanden. Figur 1E viser en koagulocyt, der indeholder forskellige cytoplasmiske granula. Koagulocytternes plasmamembraner var glatte, uden strukturer, og deres kerner var store og let synlige. Oenocytoiderne var den største type hæmocytter, der blev observeret, og de var sjældne i hæmolymphen (fig. 1F). Oenocytoiderne havde normalt en rund stegeægsform med talrige cytoplasmiske granula. Figur 1G viser en sfærulocyt, som var rund og mellemstor i størrelse med mange små mørke eller skinnende granula i cytoplasmaet. Som det fremgår af figur 1D~G, var der ingen strukturer synlige på plasmamembranerne af prohemocytterne, koagulocytterne, oenocytoiderne eller sfærulocytterne, som var optisk meget glatte.

De seks typer hæmocytter observeret i blodet fra syrener. Samlet form og relativ størrelse af hæmocytter i hæmolymphen (A). De seks typer hæmocytter, der blev fundet i G. bimaculatus, blev klassificeret som granulocytter (B ; GR), plasmatocytter (C ; PL), prohemocytter (D ; PR), koagulocytter (E ; CO), oenocytoider (F ; OE) og sfærulocytter (G ; AD) på grundlag af størrelse og morfologi. De vifte- eller amøbelagtige strukturer på granulocytternes og plasmatocytternes plasmamembran er angivet med hvide pile (B og C). Skalaen = 25 µm (A) eller 10 µm (B~G).

Nodulation og indkapsling ved hæmocytter

I insekter udføres cellulære immunreaktioner såsom nodulation, indkapsling og fagocytose af immunhæmocytter såsom granulocytter og plasmatocytter. Efter eksponering for patogener ændrer disse hæmocytter deres form og udvikler store amøbe- eller vifte-lignende strukturer i deres plasmamembraner. For at observere disse hurtige morfologiske ændringer i realtid har vi udviklet en teknik, der gør det muligt at dyrke insekthæmocytter i 7 dage, samtidig med at den fysiologiske aktivitet bevares (beskrevet i Materialer og metoder). Selv om vi ikke kunne etablere stabile hæmocytlinjer, der kan passageres i flere år, var vi i stand til at observere hæmocytternes morfologi som reaktion på patogener in vitro. Supplerende film C viser kun hæmocytter efter 12 timers inkubation. De fleste dyrkede celler var aktivt bevægelige. Nogle celler udviste net omkring cellemembranen under dyrkningen og blev fundet fastgjort til dyrkningsglassene. Hæmocytterne aggregerede sjældent eller dannede store klynger.

Figur 2A viser hæmocytter dyrket med E. coli (se også supplerende film 1). Nogle hæmocytter blev observeret til at være mere aggregerede og bevægelige. Efterhånden som inkubationstiden steg, blev der produceret net (amøbelagtige hår eller ekstracellulære fælder) af specifikke hæmocytter, og forskellige hæmocytter blev samlet af disse net for at danne store klynger (fig. 2A-1~A-6; amøbelagtige hår eller ekstracellulære fælder angivet med sorte pile). Som vist i fig. 2A-1 blev tre grupper af hæmocytter (angivet med sorte cirkler) i sidste ende trukket sammen til én klynge af nettene (fig. 2A-5 og A-6).

Live-cellebilleder af fårekyllingehæmocytter inficeret med E. coli eller Sephadex-kugler. (A) Lysmikroskopiske billeder, der viser hæmocytter, der er dyrket med E. coli. Efterhånden som inkubationstiden øgedes, blev der produceret net (amøbelagtige hår eller ekstracellulære fælder; angivet med sorte pile) af specifikke hæmocytter. Alle seks typer hæmocytter blev samlet i store klynger af disse net (A-1~A-6; angivet med sorte bokse). Filmen er tilgængelig som film 1 (tid i minutter efter inokulation). (B) Lysmikroskopiske billeder, der viser hæmocytter, der er dyrket med Sephadex perler. Sephadexperler omkring hæmocytterne blev tilfældigt mærket SP1, SP2, SP3, SP4 og SP5. Med tiden blev Sephadex-kuglerne (SP1, SP2, SP3 og SP4) omgivet af hæmocytter og indkapslet af forskellige typer net (B-1~B-9; angivet med sorte pile). Filmen er tilgængelig som film 2 (tid i minutter efter inokulation). Skala = 25 µm (A og B). Film C viser hæmocytter, der er dyrket alene, uden Sephadex-perler. De fleste hæmocytter var aktivt bevægelige. Nogle få celler var fastgjort til dyrkningsglassene med plasmamembrannet. Der blev dog ikke observeret store klynger af hæmocytter.

Det var imidlertid ikke muligt at afgøre, om den samling af hæmocytterne, der er beskrevet ovenfor, blev udløst af E. coli. For at besvare dette spørgsmål blev hæmocytterne aktiveret med Sephadex perler (120 μm diameter), som let kan observeres med et DIC-mikroskop (Fig. 2B, Supplerende film 2). Som vist i fig. 2A blev Sephadex-kuglerne fanget af de net, der blev genereret af specifikke hæmocytter (fig. 2B; nettene er angivet med sorte pile i de gule felter). Sephadexperlerne omkring hæmocytterne blev tilfældigt mærket med SP1, SP2, SP3, SP4 og SP5. Som det fremgår af en sammenligning af fig. 2B-2 og B-3, blev SP1, SP2 og SP3 trukket sammen og ind i det område, der er angivet af den gule boks. Desuden blev SP1 til sidst fuldstændig omgivet af forskellige hæmocytter (fig. 2B-9). Perlen mærket SP4 blev også indlemmet i klyngen med SP1, SP2 og SP3 (fig. 2B-4~B-9; angivet med den gule boks). Med tiden blev alle Sephadex-kuglerne (SP1, SP2, SP3 og SP4) omgivet af mange hæmocytter. Derimod blev det observeret, at enkelte hæmocytter var i kontakt med SP5, men den blev ikke trukket ind i det område, der er angivet med den gule boks, selv om den befandt sig i en lignende position som SP1. Derfor syntes nodulation af hæmocytter at ske tilfældigt.

Granulocyt-aktivering ved carboxylat-modificerede polystyrenlatexperler

Næst undersøgte vi, hvilke hæmocytter der producerede nettene og deltog i de forskellige trin i immunresponset, herunder indkapsling og nodulation. Til dette formål blev der anvendt carboxylatmodificerede polystyrenlatexperler, som let kan observeres med et DIC-mikroskop, i stedet for patogener, og der blev indsamlet realtidsbilleder af hæmocytterne. Figur 3A viser hæmocytter stimuleret med carboxylatmodificerede polystyrenlatexperler i 12 timer (Supplerende film 3). De net, der blev produceret af hæmocytterne (angivet med sorte pile), bevægede sig aktivt rundt om latexkuglerne (angivet med røde pile) (Fig. 3A-1). Med tiden blev perlerne opslugt af nettene og kunne til sidst ses i hæmocytternes cytoplasma (fig. 3A-2~A-4). Det var imidlertid ikke alle carboxylatmodificerede polystyrenlatexperler, der mødte et net, der blev fagocyteret. Bevægelsen af de aktiverede hæmocytter syntes således ikke at svare præcist til perlernes bevægelse.

Live-cellebilleder af granulocytter stimuleret med carboxylat-modificerede polystyrenlatexperler. (A) Lysmikroskopiske billeder, der viser hæmocytter, der er dyrket med carboxylat-modificerede polystyrenlatexperler i 12 timer. A-1~A-4, dyrkede hæmocytter efter 12~18 minutter. Man kan se de net, der dannes af hæmocytterne (sorte pile), omkring latexkuglerne (angivet med røde pile). Latexperlerne blev opslugt af nettene og blev til sidst indfanget i hæmocytternes cytoplasma (A-4). Filmen er tilgængelig som film 3 (tid i minutter efter stimulering). Skala = 40 µm. (B) Forstørrede billeder. (B-1) Efter 4 timer blev mange carboxylatmodificerede polystyrenlatexkugler fanget af hæmocytter (latexkugler, røde pile; og specifikke hæmocytter, hvide cirkler). (B-2~B-6) Kulturerede granulocytter ved 0, 2, 4, 12 og 48 timer efter stimulering. (B-2) Granulocytter i hvile, som er runde eller ovale i form. (B-3) 2 timer efter stimulering begyndte granulocytterne at vise morfologiske ændringer, og der kan ses vifte- eller amøbelagtige plasmamembranstrukturer (hvide pile). (B-4 og -5) Et stort antal latexperler havde ophobet sig i granulocytternes cytoplasma 4 og 12 timer efter infektionen. (B-6) 48 timer efter infektionen havde mange latexkugler akkumuleret sig i granulocytcytoplasmaet, men der blev ikke længere observeret net, og mange granulocytter syntes at være inaktive. Skalaen = 15 µm (B-1) eller 10 µm (B-2~B-6).

Detaljerede observationer blev foretaget ved hjælp af et konfokalt mikroskop med høj forstørrelse (fig. 3B). 4 timer efter infektionen kunne de carboxylatmodificerede polystyrenlatexperler observeres inden for visse hæmocytter (Fig. 3B-1; perlerne er angivet med røde pile, og specifikke hæmocytter er angivet med hvide cirkler). Vi observerede derefter, hvilke specifikke celler der opslugte latexperlerne mere detaljeret (fig. 3B-2~B-6). Figur 3B-2 viser hvilende granulocytter, som normalt var runde eller ovale i form, med mange polymorfe mørke granula i cytoplasmaet. 2 timer efter stimulering med carboxylatmodificerede polystyrenlatexkugler begyndte granulocytterne at vise morfologiske ændringer, herunder vifte- eller amøbelagtige fremspring af plasmamembranen (fig. 3B-3; angivet med hvide pile). Carboxylat-modificerede polystyrenlatexperler blev observeret i granulocytcytoplasmaet 4 timer efter stimulering, og et stort antal latexperler havde akkumuleret sig i cytoplasmaet hos mange granulocytter 12 timer efter stimulering (Fig. 3B-4 og B-5; perler angivet med røde pile, og net angivet med hvide pile). Desuden blev det observeret, at nettene blev større og bredere over tid (fig. 3B-4 og B-5). 48 timer efter stimulering havde mange latexperler akkumuleret sig i granulocytternes cytoplasma, men nettene kunne ikke længere ses, og mange granulocytter syntes at være inaktive (fig. 3B-6; perler angivet med røde pile).

Som vist i fig. 2 syntes granulocytterne ikke kun at knytte sig til andre granulocytter, men også til forskellige typer hæmocytter ved hjælp af disse net. Vi observerede ikke fagocytose i nogen anden celletype bortset fra et lille antal plasmatocytter (data ikke vist). Desuden observerede vi ikke nogen immunologisk aktivitet eller morfologiske ændringer i andre celletyper end granulocytter og et lille antal plasmatocytter.

Granulocytlysosomer blev aktiveret ved injektion af E. coli-partikler

For at undersøge, om de vakuoler, der blev observeret i granulocytterne, var patogenrelaterede fagosomer, blev syrenerne injiceret med E. coli-partikler, der hovedsageligt anvendes som markører for fagocytose og fluorescerer grønt, når de når frem til forsurede organeller som intracellulære lysosomer. Samtidig blev de samlede hæmocytter farvet med LysoTracker Red, som mærker lysosomer. Som vist i fig. 4A-1 blev der observeret et grønt fluorescerende signal (fagocyterede E. coli-partikler) i granulocytcytoplasmaet umiddelbart efter injektion af partiklerne. Samtidig blev der også observeret et rødt fluorescerende signal, som indikerer aktiveret lysosomdannelse (fig. 4A-2). 4 timer efter injektion kunne man se meget polymorfe vacuoler i mange granulocytter (fig. 4A-4 og A-5). Sammenlagte billeder af det grønne fluorescerende signal (fagocyterede E. coli-partikler) og det røde fluorescerende signal (aktiverede lysosomer) er vist (fig. 4A-6). 12 timer efter injektion begyndte det grønne fluorescenssignal at blive svagere, mens det røde fluorescenssignal forblev (fig. 4A-7~A-9). 24 timer efter injektion var begge fluorescenssignaler dæmpet (fig. 4A-10~A-12). Det røde fluorescerende signal i granulocytter blev imidlertid igen observeret 48 timer efter injektionen (fig. 4A-13~A-15). Figur 4Aa~Ao viser indsætningerne i panelerne A-1~A-15 (angivet med hvide bokse) ved en højere forstørrelse. Griller, der kun blev injiceret med PBS-buffer, var negative for rød og grøn fluorescens på alle tidspunkter efter injektion (Fig. 4B).

LysoTracker Red-mærkning af granulocytlysosomer hos griller, der er injiceret med grøn fluorescerende E. coli-partikler. (A) Udvikling af granulocytlysosomer 0 timer, 4 timer, 12 timer, 24 timer og 48 timer efter injektion af E. coli-partikler. (A-1, A-4, A-7, A-10 og A-13) E. coli-partiklerne, der anvendes som markører for fagocytose, fluorescerer grønt, når de når frem til forsurede organeller som intracellulære lysosomer. (A-2, A-5, A-8, A-8, A-11 og A-14) Konfokale fluorescensmikroskopiske billeder af granulocytter, der er farvet med LysoTracker Red (en lysosomal markør). (A-1 og A-2) De grønne og røde fluorescerende signaler kunne observeres i granulocytcytoplasmaet fra 1 time efter injektion. (A-4 og A-5) Mange granulocytter viste grøn og rød fluorescens i de meget polymorfe vacuoler i granulocytter 4 timer efter injektion. (A-7 og -8) 12 timer efter injektion var det grønne fluorescenssignal aftaget, men det røde fluorescenssignal var tilbage. (A-10 og A-11) 24 timer efter injektion var både det grønne og det røde fluorescerende signal næsten forsvundet. (A-13 og A-14) 48 timer efter injektion var det grønne fluorescenssignal helt forsvundet, men det røde fluorescenssignal blev observeret igen. Sammenlagte billeder af de grønne og røde fluorescenssignaler er vist (A-3, A-6, A-9, A-12 og A-15). (a~o) Indsætningerne i panelerne A-1 ~A-15 (angivet med hvide kasser) ved højere forstørrelse. (B) Det røde fluorescenssignal i granulocytter fra syrener, der blev injiceret med PBS (negativ kontrol). (C) Flowcytometrisk analyse 1 h ~ 48 h efter injektion. (C-1 og C-2) Det grønne fluorescerende signal var 2,08 % ved 1 h efter injektion og steg til 24,6 % ved 4 h efter injektion. (C-3~C-5) Det grønne fluorescenssignal faldt gradvist til 10,87 % efter 12 timer, 3,98 % efter 24 timer og 1,74 % efter 48 timer. (C-1-1-1~C-4-1) Det røde fluorescenssignal steg til 69,54 % efter 12 timer efter injektion og faldt til 5,78 % efter 24 timer efter injektion. (C-5-1) Det røde fluorescerende signal steg igen til 30,25 % efter 48 timer efter injektion. (C-1-2~C-5-2) Det røde fluorescerende signal i granulocytter fra syrener, der kun blev injiceret med PBS-buffer. (D) Flowcytometrianalyserne blev gentaget tre gange.

For at kvantificere de grøn- og rødfluorescerende signaler i PBS- eller E. coli-challengagerede syrsler blev hæmocytter analyseret ved flowcytometri 0~48 timer efter injektion (Fig. 4C). Ved 0 h efter injektion var 2,08 % af hæmocytterne positive for grøn fluorescens, og dette steg til 24,36 % ved 4 h efter injektion (Fig. 4C-1 og C-2). Det grønne fluorescenssignal faldt gradvist til 10,87 % af hæmocytterne efter 12 timer, 3,98 % efter 24 timer og 1,74 % efter 48 timer (fig. 4C-3~C-5). Disse resultater tyder på, at E. coli-partikler blev aktivt opslugt og fordøjet af granulocytter og blev fuldstændig renset efter 48 timer efter injektion. 12 timer efter injektion var 69,54 % positive for rød fluorescens, og signalet faldt til 5,78 % af hæmocytterne 24 timer efter injektion (fig. 4C-1-1~C-4-1). I overensstemmelse med vores mikroskopiske observationer steg det røde fluorescenssignal til 30,25 % af hæmocytterne 48 timer efter injektion. I modsætning hertil var kribensis, der blev injiceret med PBS, negative for grøn og rød fluorescens på alle tidspunkter (Fig. 4C-1-2~C-5-2). Flowcytometrianalysen blev gentaget tre gange (Fig. 4D).

Reaktivering af granulocytlysosomer ved 48 timer efter infektion

Reaktiveringen af granulocytlysosomer ved 48 timer efter infektion blev yderligere undersøgt ved mikroskopisk observation (Fig. 5A og B). Som vist i fig. 4A blev det grønne fluorescerende signal (fagocyterede E. coli-partikler) og det røde fluorescerende signal (aktiverede lysosomer) set 4 timer efter injektion (fig. 5A-1~A-3). De fluorescerende signaler var dæmpet 24 timer efter infektionen (fig. 5A-4~A-6). 24 timer efter infektionen observerede vi, at man kunne se celler i granulocytternes cytoplasma (Fig. 5A-4~A-6; angivet med hvide pile). Dette fænomen var mere tydeligt 48 timer efter infektionen (fig. 5A-7~A-9; angivet med hvide pile). Desuden var lysosomerne omkring disse opslugte celler 48 timer efter infektionen aktiveret (fig. 5A-8). Som vist i fig. 4A-14, 4C-5-1 synes disse mikroskopiske observationer at forklare stigningen i det røde fluorescerende signal 48 timer efter infektionen. For at bekræfte dette blev granulocytternes kerner farvet med 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) 48 timer efter infektionen. Som vist i fig. 5B-1 blev der ofte observeret granulocytter med to kerner. Lejlighedsvis blev der også observeret granulocytter med mere end to kerner eller deformerede kerner (fig. 5B-2 og B-3; angivet med hvide pile).

Reaktivering af granulocytlysosomer 48 timer efter injektion. (A) Fluorescensmikroskopiske billeder af granulocytter 4 h, 24 h og 48 h efter injektion. (A-1 og A-2) Granulocytter viste grønne og røde fluorescerende signaler i de stærkt polymorfe vacuoler ved 4 h efter injektion. (A-4 og A-5) 12 timer efter injektion var det grønne fluorescenssignal blevet svagere, men det røde fluorescenssignal var stadig til stede. Desuden blev der observeret nogle celler i granulocytternes cytoplasma (hvide pile). (A-7 og A-8) Dette fænomen blev hyppigere observeret 48 timer efter injektionen. Desuden blev lysosomerne omkring disse opslugte celler aktiveret (A-8). Sammenlagte billeder af de grønne og røde fluorescenssignaler er vist (A-3, A-6 og A-9). (B) Granulocytter farvet med DAPI 48 timer efter injektion. (B-1) Der blev observeret to kerner i granulocytcytoplasmaet. (B-2 og B-3) Lejlighedsvis blev der observeret to eller flere kerner eller deformerede kerner i granulocytcytoplasmaet (angivet med hvide pile). Skalaen = 10 µm (A) eller 20 µm (B).

Nekrose-relateret granulocytcelledød 48 timer efter infektion

Som vist i fig. 3B-6 og 5A-8 ændrede ophobningen af fagosomer i granulocytter deres form og inducerede celledød. 48 timer efter infektionen blev hæmocytterne farvet med fluoresceinisothiocyanat (FITC)-konjugeret annexin V og propidiumjodid (PI) for at bekræfte apoptotisk eller nekrotisk celledød (fig. 6A). Det grønne fluorescerende signal (annexin V) steg kun svagt mellem 12 timer og 48 timer (Fig. A-10, A-7 og A-10), men det røde fluorescerende signal (PI) viste en stærk farvning 12 timer efter infektionen (Fig. 6A-5). Efter 24 og 48 timer efter infektionen var det røde fluorescerende signal fortsat (fig. 6A-8 og A-11). Sammenføjede billeder af det røde fluorescenssignal (PI) og DIC-billederne er vist (fig. 6A-3, A-6, A-9 og A-12). Figur 6Aa~Ad viser de indsatser i panelerne A-3, A-6, A-9 og A-12, der er angivet med boksene, i højere forstørrelse. Disse resultater tyder på, at ophobning af fagosomer i granulocytter ikke inducerede typisk apoptotisk celledød, men nekroserelateret celledød. For at kvantificere PI-farvningen blev hæmocytter farvet og undersøgt ved flowcytometri 0 timer, 12 timer, 24 timer og 48 timer efter infektionen. Ved 12 h efter infektionen blev 71,29 % af granulocytterne farvet med PI sammenlignet med 13,52 % ved 0 h (fig. 6B-1 og B-2). 24 timer efter infektionen var PI-farvningen faldet en smule til 45,97 %, men steg igen til 76,24 % efter 48 timer (fig. 6B-3 og B-4). Flowcytometrianalysen blev gentaget tre gange (fig. 6C).