Flash protein liquid chromatography (FPLC) og high performance liquid chromatography (HPLC): to flydende kromatografiske metoder i direkte sammenligning. I denne artikel diskuteres forskellene mellem de to teknikker med særlig vægt på kravene til deres respektive analytter.
Navnene hurtig proteinvæskekromatografi (FPLC) og højtydende væskekromatografi (HPLC) giver et hint om forskellene mellem disse kromatografiske metoder. Mens HPLC arbejder med højt tryk til analyse af små kemiske forbindelser, renser FPLC store biomolekyler som proteiner eller DNA. Kromatografi af biomolekyler er meget krævende og følsom, fordi de ikke kan tåle høje temperaturer, højt tryk eller de opløsningsmidler, der normalt anvendes i HPLC. Af disse grunde kræver adskillelse af biomolekyler en alternativ tilgang til HPLC.
Der anvendes almindeligvis flere udtryk for hurtig flydende proteinkromatografi, f.eks. biokromatografi, bioseparation eller biopurificering. Denne særlige form for kromatografi anvendes til oprensning af store biomolekyler på flere kilodalton (kDa) som f.eks. proteiner, nukleotider eller peptider (figur 1). FPLC-brugerens mål er at opnå så meget rent og naturligt produkt som muligt. Formålet med klassisk HPLC er derimod at identificere og kvalificere analytter, som regel små forbindelser, der varierer i størrelse fra et par atomer op til ca. 3000 Da.
Den udfordring, der ligger i at få et rent protein fra et celleekstrakt
Typisk oprenses biomolekyler fra bakterielle eller eukaryote celler, som er fyldt med proteiner, DNA, RNA og cellemembraner. Derfor kan det være en stor udfordring at rense det ønskede protein ud af et celleekstrakt. Biokemikere anvender flere tricks: Et er at anvende rekombinante proteiner, som overudtrykkes af cellerne. Overekspression af det pågældende protein gør det muligt at rense det i større mængder. Det andet trick er at tilføje et tag til det pågældende protein, som specifikt genkendes af harpiksen (kolonnematerialet). Proteiner uden et tag vil ikke binde sig til kolonnen og elueres straks, mens det ønskede protein beriges og let kan separeres.
Biomolekyler oprenses fra cellelysater, hvilket betyder meget større prøvevolumener end i analytisk HPLC. Der anvendes derfor større prøvesløjfer eller endog pumper med højere flowhastigheder til at injicere prøven. Desuden er FPLC- og HPLC-søjlematerialerne helt forskellige. Til HPLC anvendes silica perler med meget små partikelstørrelser og med stor modstandsdygtighed over for høje tryk, mens FPLC kræver agarose eller polymermateriale med større partikelstørrelser til de fleste metoder. De harpikser, der anvendes til FPLC, er ikke så trykstabile som silica perler og er meget følsomme over for luftbobler. Desuden er det ikke kun kolonnematerialet, men også kolonnehardwaren, der er forskellig. I klassisk HPLC anvendes trykbestandige kolonner af rustfrit stål. Som allerede nævnt er trykstabilitet ikke vigtig for FPLC, og derfor er det muligt at arbejde med gennemsigtige og biokompatible glassøjler. Dette er en stor fordel, da brugeren kan kontrollere kolonnen for luftbobler eller overvåge materialets tilstand under en oprensningskørsel.
Diverse Biomolecules, Diverse Purification Methods
Differenceerne i kolonnematerialet afspejler sig også i metoderne. I analytisk HPLC er omvendt fasekromatografi med hydrofobiske stationære faser og polære mobile faser den foretrukne metode, mens der i FPLC anvendes en større variation af metoder (figur 2). En FPLC-metode er størrelseseksklusionskromatografi (SEC), hvor molekyler adskilles på grundlag af deres størrelse. Mindre molekyler kan diffundere ind i perlernes porer, mens større molekyler passerer gennem kolonnen næsten uden at blive tilbageholdt. De mindre molekyler elueres senere fra kolonnen, hvorved der dannes en gradient af disse molekyler i forhold til deres størrelse. En anden separationsmetode er ionbytningskromatografi. Biomolekyler adskilles og renses i henhold til deres specifikke ladning, som afhænger af bufferens pH-værdi. Jo mere ladet proteinet er, jo bedre vil det binde sig til den modsat ladede harpiks. For at eluere proteinet fra kolonnen øges koncentrationen af saltioner i løbet af kørslen. Saltionerne konkurrerer med proteinet om at binde sig til harpiksen. En anden vigtig FPLC-metode er affinitetskromatografi, hvor det pågældende molekyle kan binde sig specifikt til kolonnen, mens de andre molekyler ikke kan binde sig og elueres uden binding. Her anvendes kolonner med særlige medier, der genkender det ønskede biomolekyle. En særlig form for affinitetskromatografi er immobiliseret metalionaffinitet (IMAC). Det ønskede protein skal ændres genetisk ved at tilføje et tag til proteinet, som normalt består af seks histidiner. IMAC-harpiksen genkender specifikt dette “Hisâtag”. Elueringen sker ved at øge koncentrationen af imidazol, der konkurrerer med de His-taggede proteiner. Desuden kan proteiner også adskilles efter deres specifikke hydrofobicitet ved hjælp af metoden til separation ved hydrofobisk interaktion. Harpiksen er sammensat på en sådan måde, at de mest hydrofobiske proteiner binder sig stærkest til søjlen og elueres ved at mindske saltgradienten.
For at rense et ønsket protein anvendes normalt en kombination af metoder. I det første trin, det såkaldte “capture”-trin, oprenses proteinet fra råekstraktet. Typisk anvendes affinitetskromatografi til dette første trin af oprensningen. I det andet trin, det såkaldte “mellemliggende” trin, fjernes yderligere forurening ved ionbytningskromatografi eller hydrofob interaktion. Formålet med det sidste “poleringstrin” – normalt et trin med størrelseseksklusionskromatografi – er at fjerne alle resterende urenheder for at opnå et produkt af høj renhed. Denne proteinrensningsstrategi afhænger helt af det specifikke biomolekyle. I nogle tilfælde kan det være tilstrækkeligt med en rensning i to trin. Jo flere metoder der kombineres, jo mere af det pågældende protein går tabt under rensningen, men der kan opnås en højere renhed.
Efter oprensningen kan den opnåede prøve analyseres for renhed, koncentration og enzymfunktion eller -aktivitet ved hjælp af HPLC, natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE), enzymaktivitetsassays eller massespektrometri.
FPLC-krav
Proteiner er sammensat af aminosyrer, der er linet op som en kæde. Denne kæde er foldet i en tredimensionel struktur, som er nøglen til hvert proteins funktion og aktivitet. Derfor er det meget vigtigt at bevare denne proteinstruktur under oprensningsprocessen. Eksterne faktorer som høj temperatur, højt tryk, ekstrem pH-værdi eller opløsningsmidler kan forstyrre proteinstrukturen og skal derfor undgås i FPLC. Arbejdstemperaturen for proteiner er normalt 4 °C. Derfor er en FPLC-maskine ofte placeret i et koldt kammer eller et koldt rum, hvor den ikke blot er udsat for lav temperatur, men også for kondenserende fugtighed. Komponenterne i et FPLC-system skal være specielt konstrueret til disse forhold. Desuden står FPLC-komponenterne over for en yderligere udfordring, nemlig saltpufferopløsninger, der anvendes som eluenter. Der vælges normalt isosmotiske pH-værdier og saltkoncentrationer, der svarer til cellemiljøet. Kromatografisystemer er generelt fremstillet af rustfrit stål. På den ene side kan saltet i bufferne føre til korrosion, og på den anden side kan metalionerne fra det rustfri stål interferere med proteinet og forstyrre dets struktur. Derfor er det vigtigt at undgå rustfrit stål og anvende biokompatibelt materiale som polyetheretheretherketon (PEEK), keramik eller titanium, når der udføres FPLC. Ligesom HPLC-systemer styres FPLC-systemer også af software. Der er betydelige forskelle mellem FPLC- og HPLC-software. Sidstnævnte bruges primært til at analysere prøverne og indeholder en masse analyseværktøjer. I FPLC er der imidlertid ikke behov for mange analytiske værktøjer, og det er almindeligt at generere metoder baseret på volumen eller endog kolonnevolumen (figur 3). For de fleste FPLC-applikationer foretrækkes kolonnevolumenbaserede metoder, hvilket gør det nemt at opskalere. FPLC-software er for det meste meget intuitiv og brugervenlig og omfatter direkte kontrol, som gør det muligt at justere parametrene under en kørsel. Derved kan brugeren reagere meget spontant på forskellige situationer.
Det er derfor klart, at der er store forskelle mellem disse to kromatografiske områder (tabel 1). Metoder, hardware og software er meget forskellige, alt efter om molekylet skal analyseres eller oprenses. For FPLC-applikationer øger prøvernes følsomme karakter og ambitionen om at holde dem så native som muligt udfordringen yderligere. Samlet set er begge teknikker yderst interessante områder, som alle, der arbejder inden for området, bør være opmærksomme på.
Stephanie Runde er uddannet fra det tekniske universitet i München, Tyskland, med en diplomuddannelse i biokemi. Hun har opnået sin ph.d. ved Freie Universität Berlin, Tyskland, og arbejder i øjeblikket hos Knauer Wissenschaftliche Geräte GmbH som produktchef for FPLC.