FRAP kan også bruges til at overvåge proteiner uden for membranen. Efter at det pågældende protein er gjort fluorescerende, normalt ved ekspression som et GFP-fusionsprotein, anvendes et konfokalt mikroskop til at fotoblegme og overvåge et område af cytoplasmaet, mitotisk spindel, kernen eller en anden cellestruktur. Den gennemsnitlige fluorescens i området kan herefter optegnes i forhold til den tid, der er gået siden fotoblegningen, og den resulterende kurve kan give kinetiske koefficienter, f.eks. for proteinets bindingsreaktioner og/eller proteinets diffusionskoefficient i det medium, hvor det overvåges. Ofte er den eneste dynamik, der tages i betragtning, diffusion og bindings-/afbindingsinteraktioner, men i princippet kan proteiner også bevæge sig via strømning, dvs, undergår en rettet bevægelse, og dette blev meget tidligt erkendt af Axelrod et al. Dette kan skyldes strømning af cytoplasma eller kerneplasma eller transport langs filamenter i cellen, f.eks. mikrotubuli, ved hjælp af molekylære motorer.

Analysen er mest enkel, når fluorescensgenoprettelsen er begrænset af enten diffusionshastigheden ind i det blegede område eller af den hastighed, hvormed blegede proteiner afbindes fra deres bindingssteder i det blegede område og erstattes af fluorescerende protein. Lad os se på disse to grænser for det almindelige tilfælde af blegning af et GFP-fusionsprotein i en levende celle.

Diffusionsbegrænset fluorescensgenvindingRediger

For en cirkulær blegningsplads med radius w {\displaystyle w}

og diffusionsdomineret genvinding beskrives fluorescensen ved en ligning, der er afledt af Soumpasis (som involverer modificerede Bessel-funktioner I 0 {\displaystyle I_{0}}

og I 1 {\displaystyle I_{1}}}

) f ( t ) = e – 2 τ D / t ( I 0 ( 2 τ D / t ) + I 1 ( 2 τ D / t ) ) {\displaystyle f(t)=e^{-2\tau _{D}/t}\left(I_{0}(2\tau _{D}/t)+I_{1}(2\tau _{D}/t)\right)}

med τ D {\displaystyle \tau _{D}}

den karakteristiske tidsskala for diffusion, og t {\displaystyle t}

er tiden. f ( t ) {\displaystyle f(t)}

er den normaliserede fluorescens (går til 1, når t {\displaystyle t}

går mod uendeligt). Diffusionstidsskalaen for en bleget plet med radius w {\displaystyle w}

er τ D = w 2 / ( 4 D ) {\displaystyle \tau _{D}=w^{2}/(4D)}

, hvor D er diffusionskoefficienten.

Bemærk, at dette er for en øjeblikkelig blegning med en trinfunktionsprofil, dvs. at brøken f b {\displaystyle f_{b}}

af protein, der antages at blive bleget øjeblikkeligt på tidspunktet t = 0 {\displaystyle t=0}

er f b ( r ) = b , r < w {\displaystyle f_{b}(r)=b,~~r<w}

, og f b ( r ) = 0 , r > w {\displaystyle f_{b}(r)=0,~~r>w}

, for r {\displaystyle r}

er afstanden fra centrum af det blegede område. Det antages også, at genvindingen kan modelleres ved diffusion i to dimensioner, som også er både ensartet og isotropisk. Med andre ord, at diffusion sker i et ensartet medium, så den effektive diffusionskonstant D er den samme overalt, og at diffusionen er isotropisk, dvs. sker med samme hastighed langs alle akser i planet.

I praksis vil ingen af disse antagelser i en celle være strengt sande.

1. Blegning vil ikke være øjeblikkelig. Især hvis der kræves en kraftig blegning af et stort område, kan blegningen tage en betydelig del af diffusionstidsskalaen τ D {\displaystyle \tau _{D}}
   

   . Så vil en betydelig del af det blegede protein diffundere ud af det blegede område faktisk under blegningen. Hvis der ikke tages hensyn til dette, vil der blive indført en betydelig fejl i D.

2. Den blegede profil vil ikke være en radial trinfunktion. Hvis den blegede plet reelt er en enkelt pixel, vil blegningen som en funktion af positionen typisk være diffraktionsbegrænset og bestemt af optikken i det anvendte konfokale laserscanningsmikroskop. Dette er ikke en radial trinfunktion og varierer også langs den akse, der er vinkelret på planen.
3. Cellerne er naturligvis tredimensionelle og ikke todimensionelle, hvilket også gælder for det blegede volumen. Hvis man negligerer diffusion ud af planet (vi antager, at dette er xy-planet), vil det kun være en rimelig tilnærmelse, hvis fluorescensen genoprettes overvejende via diffusion i dette plan. Dette vil f.eks. være tilfældet, hvis der bleges et cylindrisk volumen med cylinderens akse langs z-aksen, og hvis dette cylindriske volumen går gennem hele cellens højde. Så forårsager diffusion langs z-aksen ikke fluorescensgenoprettelse, da alt protein bleges ensartet langs z-aksen, og det er derfor ufarligt at negligere den, som Soumpasis’ ligning gør det. Hvis diffusion langs z-aksen imidlertid bidrager til fluorescensgenoprettelse, skal der tages højde for den.
4. Der er ingen grund til at forvente, at cellecytoplasmaet eller kerneplasmaet er fuldstændig rumligt ensartet eller isotropisk.

Så er Soumpasisligningen blot en nyttig tilnærmelse, der kan anvendes, når de ovenfor anførte antagelser er gode tilnærmelser til den virkelige situation, og når genvinding af fluorescens faktisk er begrænset af tidsskalaen for diffusion τ D {\displaystyle \tau _{D}}

. Bemærk, at blot fordi Soumpasis kan tilpasses data på passende vis, er det ikke nødvendigvis ensbetydende med, at antagelserne er sande, og at diffusion dominerer genopretning.

Reaktionsbegrænset genvindingRediger

Ligningen, der beskriver fluorescensen som en funktion af tiden, er særlig enkel i en anden grænse. Hvis et stort antal proteiner binder til steder i et lille volumen, således at fluorescenssignalet der er domineret af signalet fra bundne proteiner, og hvis denne binding alle er i en enkelt tilstand med en off-hastighed koff, så er fluorescensen som funktion af tiden givet ved

f ( t ) = 1 – e – k off t {\displaystyle f(t)=1-e^{-k_{-k{\text{off}}t}}

Bemærk, at genvindingen kun afhænger af hastighedskonstanten for afbinding, koff,. Den afhænger ikke af on-raten for binding. Selv om den afhænger af en række antagelser

1. Den on-hastighed skal være tilstrækkelig stor, for at den lokale koncentration af bundet protein i høj grad overstiger den lokale koncentration af frit protein, og dermed tillader os at negligere bidraget til f fra det frie protein.
2. Reaktionen er en simpel bimolekylær reaktion, hvor proteinet binder til lokaliserede steder, der ikke bevæger sig væsentligt under genopretningen
3. Udveksling er meget langsommere end diffusion (eller hvilken transportmekanisme der end er ansvarlig for mobiliteten), da kun den diffunderende fraktion genopretter sig hurtigt og derefter fungerer som kilde til fluorescerende protein, der binder og erstatter det bundne blegede protein og dermed øger fluorescensen. Med r radius af den blegede plet betyder dette, at ligningen kun er gyldig, hvis den bundne levetid 1 / k off >> r 2 / D {\displaystyle 1/k_{{\text{off}}>>r^{2}/D}
   

   .

Hvis alle disse antagelser er opfyldt, vil en tilpasning af en eksponentiel til genoprettelseskurven give off-hastighedskonstanten, koff. Andre dynamikker kan imidlertid give genoprettelseskurver, der ligner eksponentielle kurver, så tilpasning af en eksponentiel betyder ikke nødvendigvis, at genoprettelsen er domineret af en simpel bimolekylær reaktion. En måde at skelne mellem genopretning med en hastighed, der er bestemt af afbinding, og genopretning, der er begrænset af diffusion, er at bemærke, at genopretningshastigheden for ubindingsbegrænset genopretning er uafhængig af størrelsen af det blegede område r, mens den skalerer som r – 2 {\displaystyle r^{-2}}

, for diffusions-begrænset genvinding. Hvis et lille og et stort område bleges, vil genoprettelseshastigheden således være den samme for de to størrelser af det blegede område, hvis genoprettelsen er begrænset af afbinding, mens den vil være meget langsommere for det større blegede område, hvis genoprettelsen er begrænset af diffusion.

Diffusion og reaktionRediger

Generelt vil genoprettelsen af fluorescens ikke være domineret af hverken simpel isotropisk diffusion eller af en enkelt simpel afbindingshastighed. Der vil være både diffusion og binding, og faktisk er diffusionskonstanten måske ikke ensartet i rummet, og der kan være mere end én type bindingssteder, og disse steder kan også have en uensartet fordeling i rummet. Strømningsprocesser kan også være vigtige. Denne mere komplekse opførsel indebærer, at der er behov for en model med flere parametre til at beskrive dataene; modeller med kun enten en enkelt diffusionskonstant D eller en enkelt off-hastighedskonstant, koff, er utilstrækkelige.

Der findes modeller med både diffusion og reaktion. Desværre kan en enkelt FRAP-kurve ikke give tilstrækkelig dokumentation til pålideligt og entydigt at passe til (muligvis støjende) eksperimentelle data. Sadegh Zadeh et al. har vist, at FRAP-kurver kan tilpasses med forskellige par af værdier af diffusionskonstanten og on-rate-konstanten, eller med andre ord, at tilpasninger til FRAP ikke er entydige. Dette er i tilpasninger med tre parametre (on-rate-konstant, off-rate-konstant og diffusionskonstant). Fits, der ikke er unikke, er generelt ikke brugbare.

For modeller med en række parametre kan et enkelt FRAP-forsøg således være utilstrækkeligt til at estimere alle modelparametre. Så er der behov for flere data, f.eks. ved at blege områder af forskellig størrelse, bestemme nogle modelparametre uafhængigt af hinanden osv.