IFN-γ ELISpot assay optimering efter PBMC-stimulering med T-aktiverede® IE-1 og pp65 CMV-antigener

Frisk isolerede PBMC blev anvendt til ELISpot-assayet. For at undgå tab af T-cellefunktionalitet, f.eks. på grund af aktiverede granulocytter , blev hepariniserede blodprøver behandlet uden yderligere tilsætningsstoffer inden for 8 timer. Et samlet antal på 2 × 105 PBMC pr. brønd blev valgt til udvikling af ELISpot-assayprotokollen, da dette celletal er under konfluens og normalt kan opnås fra prøver på mindre end 15 ml fuldblod. CMV’s umiddelbare tidlige protein IE-1 og det sene tegumentprotein pp65 er velkarakteriserede immunodominante T-celleantigener . IE-1 i fuld længde og et 181 aminosyre C-terminalt fragment af pp65 blev fremstillet og formuleret i tilstedeværelse af urinstof (T-activation®) for at øge deres stimulerende evne til at stimulere forskellige typer CMV-reaktive effektorceller i den celleformidlede immunitet . Den optimale T-activated®-antigenkoncentration blev først fastlagt ved at udføre dosis-respons-eksperimenter. Frisk isolerede PBMC fra en sund CMV-seropositiv donor blev stimuleret med 31,6 fg/ml til 31,6 μg/ml T-activated® pp65 eller med 0,01 til 31,6 μg/ml T-activated® IE-1, og antallet af IFN-γ-sekterende celler blev bestemt ved hjælp af IFN-γ ELISpot. T-aktiveret® pp65 viste en meget stærkere evne til at stimulere IFN-γ-sekterende effektorceller end T-aktiveret® IE-1, idet der blev nået et plateau af respons mellem 0,316 og 3,16 ng/ml pp65 mod ca. 31,6 μg/ml for IE-1 (fig. 1). Derfor blev T-aktiveret® antigenkoncentrationer på 3 μg/ml pp65 og 15 μg/ml IE-1 udvalgt til yderligere PBMC-stimulationer og ELISpot-assays.

Assayets følsomhed og specificitet blev bestemt ved at stimulere PBMC isoleret fra hver 10 CMV-seropositive og CMV-seronegative raske donorer med de definerede pp65- og IE-1 T-aktiveret® antigenkoncentrationer. Antallet af reaktive effektorceller blev kvantificeret ved hjælp af IFN-γ ELISpot. Signifikant stimulering blev defineret ved hjælp af en Mann-Whitney U-test som en statistisk signifikant forskel mellem SFC-værdierne for ikke-stimulerede og CMV-antigen-stimulerede forhold (hver i fire eksemplarer). T-aktiveret® pp65 og IE-1 inducerede en signifikant aktivering af responsive effektorceller i henholdsvis 10 ud af 10 og 9 ud af 10 PBMC-præparater fra individuelle CMV-seropositive donorer (fig. 2). I dette kollektiv viste T-aktiveret® pp65 en samlet større kapacitet til at aktivere responsive celler med en median på 399 SFC/200.000 PBMC (interval 12-864 SFC/200.000 PBMC) sammenlignet med T-aktiveret® IE-1 med en median på 26 SFC/200.000 PBMC (interval 1,3-96 SFC/200.000 PBMC). Ikke desto mindre blev der påvist et betydeligt respons på op til 96 SFC/200.000 PBMC som respons på T-aktiveret® IE-1 i individuelle prøver fra CMV-seropositive donorer (fig. 2). Alle 10 PBMC-prøver (100 %) fra forskellige CMV-seronegative donorer viste negative testresultater efter stimulering med pp65 (median 0,3 SFC/200.000 PBMC; interval 0-2,8), mens 9 ud af 10 (90 %) PBMC-prøver fra CMV-seronegative personer var negative efter stimulering med IE-1 (median 2,9 SFC/200.000 PBMC; interval 0,3-6,8). Antallet af pletter i CMV-seronegative IE-1-stimulerede PBMC var højere end i CMV-seronegative pp65-stimulerede PBMC, men oversteg ikke 7 SFC/200.000 PBMC (fig. 2).

IFN-γ er blevet vist at blive udskilt kontinuerligt under antigenstimulering. Således er signalintensiteten i IFN-γ ELISpot afhængig af stimuleringens varighed . Varigheden af antigenstimuleringen i IFN-γ ELISpot, der er rapporteret i litteraturen, varierer normalt fra 16 til 24 timer . For at undersøge inkubationstidens indflydelse på testresultaterne blev IFN-γ ELISpot udført på PBMC fra 3 uafhængige CMV-seropositive raske donorer efter stimulering med T-aktiverede® pp65- og IE-1-antigener i 17, 19 og 21 timer. Der blev ikke påvist statistisk signifikante forskelle i SFC-tal mellem de 3 betingelser (fig. 3), hvilket viser, at signalet er stabilt i dette tidsinterval. Der blev således valgt en inkubationstid på 19 h til det optimerede ELISpot-assay.

En lang række protokolvariabler kan påvirke ELISpot-testresultaterne. F.eks. indeholder det medium, der anvendes til primær cellekultur, ofte serum, som indeholder forskellige batchafhængige ikke karakteriserede bioaktive molekyler i forskellige koncentrationer . For at definere standardiserede cellekulturbetingelser blev det undersøgt, hvilken indvirkning forskellige serumholdige medier (RPMI 1640 suppleret med 5 % enten FCS, human AB, syntetisk NTA eller syntetisk NTS) og serumfrie medier (AIM-V®, UltraCulture) har på testresultaterne. Serumfrie medier gav de bedste effektorcelleresponser, der kunne sammenlignes med RPMI 1640 suppleret med 5% FCS (Fig. 4a). Desuden udviste AIM-V® de laveste baggrundssignaler under ustimulerede forhold (Fig. 4b), hvorved signal/støjforholdet blev maksimeret. Derfor blev ELISpot-protokollen yderligere etableret ved hjælp af AIM-V® serumfrit medium.

ELISpotassays kan udføres med forskellige membranmaterialer, herunder nitrocellulose (NC), blandet celluloseester (MCE) og polyvinylidenfluorid (PVDF). Vi sammenlignede IFN-γ ELISpot-resultater fra PBMC-prøver fra seks raske personer (fire replikater hver, to præparater pr. donor) ved hjælp af de mest almindeligt anvendte MCE-plader, PVDF-plader og PVDF-strips fra Millipore (Merck Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland). PVDF-membraner kræver et aktiveringstrin med ethanol før bindingen af antistoffet til opsamling. Desuden var det nødvendigt med mere stringente vasketrin før udvikling af pletter med PVDF-baserede plader sammenlignet med MCE-plader for at undgå uønsket baggrundsfarvning af membranerne. Ikke desto mindre var opløsningen af de detekterede pletter med hensyn til skarphed og homogenitet forbedret på PVDF-membraner (ikke vist), hvilket resulterede i højere antal pletter sammenlignet med MCE-membraner (op til 10 gange mere i tilfælde af IE-1-stimuleringer med en median SFC på henholdsvis 155 vs. 13/200 000 PBMC; fig. 5). Da PVDF-strimler med 8 brønde var mere performante, og da deres anvendelse kan muliggøre reducerede omkostninger, især når enkeltpatientprøver testes i klinisk rutine, blev PVDF-formatet med 8 brønde valgt til den optimerede assayudvikling.

Optimal belægning af mikrotiterplader med indfangningsantistof er afgørende for en robust assayydelse. Tætheden af IFN-γ-fangeantistof bundet til PVDF-membranen bør ikke være begrænsende og bør navnlig gøre det muligt at påvise et højt antal pletter på pålidelig vis. PVDF-strimler blev belagt med stigende koncentrationer (2,5 til 7,5 μg/ml) af anti-IFN-γ-antistof. PBMC fra fem CMV-seropositive donorer blev udsået i de belagte brønde og enten ikke stimuleret eller stimuleret med T-aktiveret® IE-1 eller pp65. I intervallet fra 2,5 til 7,5 μg/ml havde stigende antistofkoncentrationer ingen effekt på baggrundsfarvningen i ustimulerede PBMC (median SFC på 0 til 0,5/200.000 PBMC uanset IFN-γ-fangeantistofkoncentrationen; fig. 6a-b). Tilsvarende var IE-1-specifikke lave til moderate SFC-niveauer (medianer på 19 til 26 SFC/200.000 PBMC) sammenlignelige i alle coating-antistofbetingelser (fig. 6a). Det samme var tilfældet for pp65-specifikke reaktioner op til ~300 SFC/200.000 PBMC (donorer d032, d120 og d241; Fig. 6c). I modsætning hertil steg påvisningen af pp65-reaktive celler i individuelle donorer med højere pletantal (f.eks. d172, d202; Fig. 6c) på en dosisafhængig måde med koncentrationen af IFN-γ-fangeantistof, der blev anvendt til coating, især mellem 2,5 og 5 μg/ml antistof. Ved antistofkoncentrationer på 5 μg/ml og derover forblev antallet af pletter stabilt (fig. 6b-c). På baggrund af disse resultater blev en koncentration på 5 μg/ml IFN-γ-fangeantistof valgt til coating i den optimerede ELISpot-protokol.

ELISpot-assays bygger på påvisning af indfanget cytokin ved hjælp af cytokin-specifikke antistoffer, som enten kan være direkte koblet til et reporterenzym (et-trins assayudvikling), som f.eks. alkalisk fosfatase (AP), eller en kombination af et biotinyleret sekundært antistof og et streptavidin-konjugeret reporterenzym (to-trins assayudvikling). En et-trins assayudvikling sparer håndteringstid og forhindrer operatørfejl. AP-konjugeret mAb (7-B6-1) (MicroCoat Biotechnologie GmbH, Bernried, Tyskland) blev anvendt som detektionskonjugat til den standardiserede ELISpot-protokol. Forskellige inkubationsparametre (f.eks. 0,5 – 3 timer ved 37 °C, 2 timer ved stuetemperatur) blev afprøvet. Antallet af pletter var sammenligneligt under alle forhold. Pletternes morfologi og dermed den korrekte detektion var dog bedst ved inkubation med AP-konjugat i 2 timer ved RT sammenlignet med andre betingelser (ikke vist). En forøgelse af koncentrationen af detektionskonjugatet fra 0,025 til 0,4 U/ml resulterede i let forhøjede SFC-medianværdier for pp65, og det maksimale antal pletter oversteg det antal pletter, der blev genereret ved to-trins-assayudvikling (ikke vist). Derfor blev der valgt en et-trins assayudvikling i 2 timer ved RT med 0,4 U/ml detektionskonjugat.

Endeligt blev standardisering af SFC-farvningsreaktionen taget op for at fuldføre assayoptimering. Varigheden af inkubationen med AP-substratet påvirker pletstørrelsen og/eller baggrundsniveauet og er derfor afgørende for en pålidelig pletoptælling. Et kromogent alkalisk fosfatasesubstrat NBT/BCIP (Thermo Fischer Scientific, Waltham, USA) blev anvendt som farvningsopløsning, og inkubationstider fra 2 til 13 minutter i mørke blev evalueret. SFC-tællingerne var sammenlignelige under alle forhold. Kortere inkubationstider resulterede dog i mindre pletdiameter, mens længere inkubationstider gav øgede baggrundsniveauer (data ikke vist). Derfor blev en farvningsvarighed på seks minutter i mørke defineret for den optimerede ELISpot-protokol.

Linearitet og præcision af det optimerede CMV ELISpot-assay

Den optimerede ELISpot-protokol blev anvendt til at bestemme det arbejdsområde for PBMC, der sikrer assaylinearitet. PBMC fra en sund CMV-seropositiv donor blev udsået ved en tæthed på mellem 2 × 104 og 2,5 × 105 PBMC pr. brønd. For celleantal på mellem 6 × 104 og 2 × 105 PBMC pr. brønd var ELISpot-tællingerne direkte proportionale med antallet af PBMC’er, der var udsået, efter stimulering med enten IE-1 (lineær regressionsanalyse; R2 = 0,97) eller pp65 (R2 = 0,99) (fig. 7a). På grund af det normalt lavere pladetal som følge af IE-1-stimulering blev der valgt at anvende 2 × 105 PBMC pr. brønd til det standardiserede ELISpot-assay for at sikre tilstrækkelige SFC-værdier.

For yderligere at verificere lineariteten mellem antallet af CMV-reaktive effektorceller og optalte SFC blev et stigende antal PBMC fra en CMV-seropositiv sund donor udsået, og det samlede antal PBMC blev justeret til 2 x 105 pr. brønd ved hjælp af PBMC fra en CMV-seronegativ donor. To donorpar (d034 + d219, d204 + d067), der ikke viste allo-reaktivitet i en 19-timers samkultur, blev udvalgt til disse forsøg. På grund af lave SFC-tal (under 20 SFC/200.000 PBMC) viste IE-1-stimuleringsresultaterne øget variabilitet sammenlignet med pp65 og tillod ikke en pålidelig linearitetsberegning (R2-værdier under 0,96; data ikke vist). ELISpot-assayresultater efter pp65-stimulering viste en god lineær korrelation for begge donorpar med R2-værdier på 0,99 (d034 + d219) og 0,98 (d204 + d067) i den lineære regressionsanalyse (fig. 7b).

Præcision og repeterbarhed af det optimerede assay blev evalueret ved at beregne intra-assay-, inter-assay-, inter-operatør- og inter-site-variabiliteten. I hvert tilfælde blev PBMC fra tre CMV-seropositive raske donorer testet i quadruplikat, og variabiliteten blev vurderet ved at beregne variationskoefficienten (CV), der er defineret som forholdet mellem standardafvigelsen og gennemsnittet. CV for ELISpot-værdier < 10 SFC/200 000 PBMC blev ikke beregnet (se beregning af positivitetsgrænseværdi nedenfor). CV intra-assay nåede op på 14 % for IE-1-stimulering og 6 % for pp65-stimulering (Additional File 1: Tabel S1). CV inter-assay oversteg ikke 17 % for IE-1 og 22 % for pp65 (Additional File 1: Tabel S2). CV mellem operatørerne var under 13 % og 18 % for henholdsvis IE-1 og pp65 (Additional File 1: Tabel S3). Endelig blev variationen mellem lokaliteterne, som er afgørende for validering af assayet til diagnostiske formål, evalueret. Fuldblodprøver blev samtidig indsamlet fra tre CMV-seropositive raske donorer og sendt (under konstante forhold ved RT) til fire forskellige laboratorier i Tyskland. PBMC blev frisk isoleret, og ELISpot-assays blev udført i henhold til den optimerede protokol af i alt 7 operatører. CV inter-site nåede et maksimum på 39 % for IE-1 og på 28 % for pp65 (Additional File 1: Table S4).

Evaluering af mindst fire uafhængige målinger er blevet anbefalet for at opnå statistisk signifikante ELISpot-resultater . For at behandle indflydelsen af intra-replikatvariationer på assayresultatet sammenlignede vi ELISpot-resultater af kvintuplikat- og quadruplikatmålinger af hver kontrol- og antigenstimulering. Der blev ikke fundet nogen signifikant variation i testresultaterne (data ikke vist). Derfor giver quadruplikatmålinger af ustimulerede og T-aktiverede® IE-1- og pp65-stimulerede forhold mulighed for assay-pålidelighed samt praktisk anvendelighed i kombination med brugen af 8-well strips. Staphylococcal enterotoxin B (SEB) er et kraftigt superantigen, og phytohemagglutinin (PHA) et kraftigt mitogen, der begge inducerer massiv IFN-γ-sekretion af T-celler . SEB og PHA er således egnede positive kontroller for cellens levedygtighed, succesfuld stimulering af cytokinsekretion og generel T-cellefunktionalitet. Dette er særlig vigtigt for fortolkningen af resultaterne, når der forventes en lav T-cellefrekvens, f.eks. hos modtagere af allogen stamcelletransplantation. I det optimerede ELISpot-assay udføres stimulationer af testprøver med enten SEB eller PHA i to eksemplarer.

Dertil kommer, at der blev etableret en effektorcelle-uafhængig operatørkontrol for at validere korrekt assaypræstation. Denne operatørkontrol er baseret på påvisning af rekombinant IFN-γ ved direkte inkubation med det immobiliserede anti-human-IFN-γ mAb (1-D1K)-indfangningsantistof. Denne kontrol, der også udføres i to eksemplarer, bør give en homogen mørk farvning af PVDF-membranen.

Teknisk validering af assayet: definition af en positivitetsgrænse

For at lette fortolkningen af resultatet af IFN-γ ELISpot-assayet og for at maksimere specificiteten (dvs. undgå falske positive resultater inden for ustimulerede forhold og inden for stimulerede forhold hos CMV-seronegative personer) blev der defineret en teknisk grænseværdi. IFN-γ ELISpot-assays blev udført i henhold til den optimerede protokol på PBMC fra 45 raske donorer, hvoraf 32 var CMV IgG-seropositive (tabel 1).

Median og interval af SFC-værdier fra ustimulerede PBMC fra CMV-seronegative og CMV-seropositive personer var sammenlignelige . Antallet af pletter i IE-1- og pp65-stimulerede PBMC fra CMV-seronegative personer var lavt . Hos CMV-seropositive personer nåede SFC-niveauerne i IE-1- og pp65-stimulerede PBMC op på 1114 og 954 pletter/200.000 PBMC (median på henholdsvis 22 og 265; fig. 8). Til bestemmelse af en teknisk grænseværdi blev der taget hensyn til spot counts i den ustimulerede kontrol samt i T-aktiveret® pp65- og IE-1-stimuleret tilstand hos CMV-seronegative og CMV-seropositive personer. Positivitetstærsklen blev bestemt ved hjælp af z-statistik (α-niveau = 0,05) på log10-transformerede geometriske middelværdier. Værdier = 0 blev erstattet af værdier nær detektionsgrænsen, som blev antaget at være 0,5. Standardafvigelsen (SD) for ELISpot-målinger for den ustimulerede kontrol, IE-1-stimulering og pp65-stimulering var henholdsvis 0,234, 0,192 og 0,136. Under hensyntagen til en SD på 0,2 og under antagelse af, at der måles 4 gentagelser for hver negativ kontrol- og testprøve, blev der beregnet et kriterium for, at forholdet mellem de geometriske gennemsnit af stimulerede og ustimulerede værdier er mindst 2,5. På den anden side blev der genereret præcisionsprofiler fra både IE-1- og pp65-specifikke testresultater, hvor en variationskoefficient (CV) på højst 40 % blev anvendt som en grænse for accept af validiteten af assayet for at bestemme den respektive kvantificeringsgrænse (LoQ). Præcisionsprofiler for IE-1- og pp65-specifikke ELISpot-resultater fra de 45 raske donorer gav LoQ-værdier på henholdsvis 8,6 og 7,1 (Additional File 2). Det skal bemærkes, at en lignende analyse udført på en kohorte af 124 hæmodialysepatienter gav sammenlignelige SD-værdier inden for ustimulerede og antigenstimulerede forhold (interval 0,199-0,240) og gav LoQ-værdier på 7,8 (IE-1) og 8,3 (pp65) . På baggrund af disse analyser blev der valgt en grænseværdi på 10 SFC/200.000 PBMC til at definere positive testresultater.

Samlet set, Ved anvendelse af T-aktiverede® pp65- og IE-1-antigener og det optimerede IFN-γ ELISpot-assay betragtes testresultaterne som positive, hvis det geometriske gennemsnit af de pletter, der fremkommer ved pp65- eller IE1-stimulering, er ≥ 10 SFC/200.000 PBMC, og hvis forholdet mellem det geometriske gennemsnit af stimulerede og ikke-stimulerede forhold er ≥ 2.5. I henhold til disse definitioner viste kollektivet af 45 sunde donorer (32 CMV IgG-seropositive, 13 CMV IgG-seronegative) en sensitivitet (defineret som den positive overensstemmelse med CMV IgG-serologi, der anvendes som primær referencemåleprocedure) på 97 % og en specificitet (negativ overensstemmelse med CMV IgG-serologi) på 85 % (fig. 8).

Funktionel assayvalidering: T-aktiverede antigener stimulerer et bredt spektrum af klinisk relevante CMV-reaktive effektorceller

Urea-formulerede rekombinante (T-aktiverede®) proteiner behandles af både de eksogene (MHC-klasse II) og endogene (MHC-klasse I) antigenbehandlings- og præsentationsveje . Stimulering af PBMC med T-aktiverede®-proteiner gengiver således i højere grad en naturlig infektion, hvilket potentielt kan resultere i aktivering af et bredt spektrum af klinisk relevante CMV-reaktive celler (f.eks. Th-, CTL-, NK- og NKT-celler), hvilket kan bidrage til den høje følsomhed af IFN-γ-ELISpot-assayet. For yderligere at karakterisere de celler, som T-aktiverede® IE-1- og pp65-antigener er rettet mod, og for at undersøge den mulige interindividuelle variabilitet i effektorcelleresponset, blev der udført intracellulær IFN-γ-farvning og flowcytometrianalyser parallelt med IFN-γ ELISpot-assays. Frisk isolerede PBMC fra seks CMV-seropositive raske donorer blev stimuleret med T-aktiverede® IE-1- og pp65-proteiner i 19 timer, og de IFN-γ-producerende celler blev optalt i henhold til det optimerede ELISpot-assay. De samme PBMC-præparater (4 replikater hver) blev stimuleret i 6 timer med samme batch af T-aktiverede® IE-1- og pp65-proteiner i tilstedeværelse af co-stimulerende anti-CD28- og anti-CD49d-antistoffer. Overflademarkører (CD3, CD4, CD8, CD56) og intracellulær IFN-γ-farvning blev analyseret ved flowcytometri, som beskrevet i afsnittet Metoder. IFN-γ+-subpopulationer af CD3+CD4+ (Th), CD3+CD8+ (CTL), CD3+CD56+ (NKT-lignende) og CD3-CD56+ (NK) lymfocytter blev optalt efter den gating-strategi, der er illustreret i Additional File 3. Alle seks donorer adskilte sig fra hinanden i deres evne til at fremkalde et IE-1- og/eller pp65-afhængigt respons i IFN-γ ELISpot-assayet. Intensiteten af responset var også heterogen blandt de seks donorer med værdier, der varierede fra 7 til 1 054 SFC (IE-1-stimulering) og fra 28 til 780 SFC (pp65-stimulering) pr. 200 000 PBMC (Fig. 9a). Tilsvarende var de enkelte donorer forskellige i frekvensen og forholdet mellem de forskellige cellesubpopulationer, der blev undersøgt ved flowcytometri (Fig. 9b). Interessant nok viste sunde CMV-seropositive personer med lavere spottal (d120, d300, d343; Fig. 9a) også lavere frekvenser af IFN-γ+ lymfocytter ved flowcytometri (Fig. 9b), hvilket understreger ELISpot-assayets evne til at skelne mellem lavt og højt reagerende personer. Aktivering af hver af de undersøgte lymfocyt-subpopulationer blev påvist hos nogle, men ikke alle donorer. Der blev f.eks. påvist svag til stærk CD4+ T-celleaktivering hos 4 ud af 6 donorer (d120, d172, d300, d343) som reaktion på enten IE-1, pp65 eller begge dele. Tilsvarende viste 5 ud af 6 donorer (d172, d290, d300, d343, d361) CD8+ T-celleaktivering under en eller begge stimulationsbetingelser. CD3-CD56+ (NK-celler) var tydelige hos én donor (d120) som reaktion på begge antigener. CD3+CD56+ (NKT-lignende) celler blev svagt aktiveret hos 4 ud af 6 personer (d120, d172 d300, d361) som reaktion på både IE-1 og pp65 (fig. 9b). Bemærkelsesværdigt nok korrelerede en stærk pp65-specifik CD4+ aktivering i d172 med et stærkt pp65-specifikt respons i ELISpot, og en stærk pp65-specifik (d290) og IE-1-specifik (d361) CD8+ aktivering var forbundet med et højt spotantal i den tilsvarende ELISpot (Fig. 9a-b), hvilket tyder på, at disse CMV-reaktive effektorceller bidrager væsentligt til de påviste ELISpot-signaler. Samlet set viser disse data, at T-aktiverede® IE-1- og pp65-proteiner er i stand til at stimulere en bred vifte af CMV-specifikke effektorceller. Disse eksperimenter afslørede også den store heterogenitet i responserne blandt sunde CMV-seropositive personer. Især den observation, at nogle personer reagerer på enten IE-1 eller pp65, understreger vigtigheden af at vurdere responset på begge antigener. Overvågning af både IE-1- og pp65-specifikke responser i det optimerede IFN-γ ELISpot-assay kan forbedre testens samlede følsomhed.