Bakterieisolering og RdFucI-identifikation

En koloni, der voksede i et medium, der indeholdt l-fucoidan fra Laminaria Japonica (Carbosynth, Compton, Berkshire, UK) som eneste kulstofkilde, blev isoleret fra en abalone-tarm, der var høstet i Sydkorea (Additional file 1: Fig. S1). En sammenligning af sekvensidentiteten baseret på 16S ribosomal RNA med NCBI-databasen viste, at isolatet var fylogenetisk tæt på medlemmerne af Raoultella-slægten (Yderligere fil 1: Fig. S1). Den isolerede stamme blev således identificeret som Raoultella sp. KDH14. Efter at have udført fuld genom-sekventering blev RdFucI identificeret fra Raoultella sp. KDH14 på grundlag af gensekvensidentitet.

RdFucI består af 595 aminosyrer med en molekylmasse på 65,5 kDa og et isoelektrisk punkt på 5,5. Resultaterne af basislokal alignment search tool (BLAST) viste den høje sekvensidentitet af RdFucI (> 90%) med andre l-FucI’er fra forskellige bakterier, der tilhører familierne Raoultella, Klebsiella og Citrobacter.

Den identificerede RdFucI blev overproduceret i E. coli BL21(DE3) med det N-terminale hexa-histidin-tag og oprenset ved his-tag affinitetskromatografi. Ved analyse ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) viste det enkelte bånd sig omkring ved 65 kDa, hvilket stemmer overens med den beregnede molekylmasse af den monomere underenhed.

RdFucI-katalyseret reaktion favoriserer l-fucose-dannelse

For at undersøge isomeraseaktiviteten af RdFucI blev enzymreaktionen udført med l-fucose eller l-fuculose som substrat (fig. 2). Enzymaktiviteterne for fremadrettede (l-fucose til l-fuculose) og omvendte (l-fuculose til l-fucose) reaktioner blev bestemt. Produktion af l-fuculose fra l-fucose blev bekræftet ved tyndtlagskromatografi (TLC) og gaskromatografi/massespektrometrianalyse (GC/MS) (Additional file 2: Fig. S2). I interkonverteringen mellem l-fucose og l-fuculose blev der ikke observeret noget sideprodukt, hvilket betyder, at ét substrat giver ét produkt (Additional file 2: Fig. S2). Vi anser det således for rimeligt at anvende den beregnede mængde l-fuculosekoncentration ved eksperimentel måling af mængden af l-fucose.

Enzymatisk omdannelse af a l-fucose til l-fuculose (fremadrettet reaktion) og b l-fuculose til l-fucose (omvendt reaktion) ved RdFucI. Enzymatisk reaktion blev udført af 3 µg RdFucI med enten a l-fucose eller b l-fuculose på 10 mM som startsubstrat ved 30 °C i 10 min i 20 mM natriumphosphat (pH 7,0) i nærværelse af 1 mM Mn2+. l-Fucosekoncentrationen blev målt eksperimentelt, og l-fuculosekoncentrationen blev beregnet ved at trække den eksperimentelt bestemte l-fucosekoncentration fra den samlede sukkerkoncentration (10 mM). Eksperimentelle data repræsenterer middelværdier ± standardafvigelser for tre gentagelser

Den omvendte reaktion var 6,6 gange hurtigere end den fremadrettede reaktion, og den specifikke aktivitet for l-fuculose (63,9 U/mg) var højere end den for l-fucose (9,6 U/mg). I begge reaktioner var ligevægtsforholdet mellem l-fucose og l-fuculose, som blev bestemt eksperimentelt, ca. 9:1, hvilket giver en ligevægtskonstant (Keq) på 0,11. Værdien af Keq blev også teoretisk bestemt til 0,23, baseret på den termodynamiske relation mellem standard Gibbs’ frie energiforandring ved reaktionen og Keq ved ligevægt, \(\mathop \Delta \Limits_{r} G^{ \circ } = – RT\ln K_{\text{eq}}}\), hvor R og T repræsenterer henholdsvis gaskonstant (8,314 J/mol K) og temperatur (K). \(\mathop \Delta \limits_{r} G^{ \circ }\) repræsenterer standard Gibbs’ frie energiforandring for reaktionen af l-fucose til l-fuculose (0,859993 kcal/mol), som er opført i databasen BioCyc (https://biocyc.org). Der var en vis uoverensstemmelse mellem de eksperimentelle og teoretiske værdier for Keq. En Keq < 1 angiver, at den omvendte reaktion er favoriseret. RdFucI-katalyseret isomerisering favoriserede den omvendte reaktion og producerede l-fucose fra l-fuculose med ca. 90 % udbytte ved 30 °C og pH 7.

Effekt af temperatur og pH på aktiviteten af RdFucI og ligevægt

Enzymatiske reaktioner blev udført ved forskellige temperaturer fra 10 til 80 °C og pH’er fra 4 til 11 med l-fuculose som substrat (fig. 3). Isomeriseringen af l-fuculose til l-fucose ved RdFucI var stærkt afhængig af temperaturen, og maksimale eller næsten maksimale aktiviteter (> 80 % af maksimum) blev udvist ved temperaturer fra 30 til 50 °C (Fig. 3a). For at undersøge virkningen af temperatur på ligevægten for l-fucose- til l-fuculoseisomerisering blev ligevægtsforholdet undersøgt ved 30, 40 og 50 °C, hvor der blev vist maksimale eller næsten-maksimale aktiviteter (> 80 % af det maksimale). Som følge heraf var der ingen signifikant forskel i ligevægtsforholdet mellem de tre temperaturer (l-fucose/l-fuculose = 9:1; p > 0,05). Med andre ord blev l-fucose syntetiseret fra l-fuculose med et udbytte på ca. 90 % ved alle testede temperaturer (Additional file 3: Fig. S3a).

Effekt af a temperatur og b pH på den relative aktivitet af RdFucI mod l-fuculose. Enzymatiske reaktioner blev udført a ved forskellige temperaturer fra 10 til 80 °C og b ved forskellige pH-værdier fra 4 til 11. De anvendte buffere var 50 mM natriumacetat (pH 4, 5 og 6), 50 mM natriumphosphat (pH 6, 7 og 8), 50 mM Tris-HCl (pH 7, 8 og 9) og 50 mM glycin-NaOH (9, 10 og 11). Eksperimentelle data repræsenterer middelværdier ± standardafvigelser for tre gentagelser

Den virkning af pH blev undersøgt. Der blev observeret høje aktiviteter af RdFucI (> 70% af maksimum) ved alkaliske og næsten neutrale pH-værdier (pH 9, 10 og 11 og pH 6, 7 og 8). Under pH 6 faldt enzymaktiviteten kraftigt, og der blev observeret ringe aktivitet ved pH 4. På trods af de høje specifikke aktiviteter under alkaliske forhold var l-fucoseudbyttet ved ligevægt (60 minutters inkubation) meget lavere ved pH 10 (54 %) end ved pH 7 (88 %) (Additional file 3: Fig. S3b) (Additional file 3: Fig. S3b). De relative aktiviteter ved pH 7, 8 og 9 var meget lavere i Tris-HCl-buffer end aktiviteterne i natriumacetat- eller glycin-NaOH-buffer, hvilket antyder, at Tris stærkt hæmmede den enzymatiske aktivitet af RdFucI. De foregående enzymatiske eksperimenter i denne undersøgelse er blevet udført i reaktionsblandinger indeholdende Tris på 1 mM, som stammede fra bufferskiftet efter enzymoprensning. For at undersøge, om Tris i reaktionsblandingen kunne hæmme RdFucI, blev isomeriseringsaktiviteter fra de reaktioner, der fandt sted i fravær og tilstedeværelse af 1 mM Tris, sammenlignet (Additional file 4: Fig. S4). Der var ingen signifikant forskel i de enzymatiske aktiviteter fra de to reaktioner, hvilket indikerer, at 1 mM Tris ikke inhiberede RdFucI-aktiviteten.

Effekt af metalioner på aktiviteten af RdFucI

Sukkerisomeraser, herunder l-fucoseisomeraser, kræver tosidige kationer, såsom Mn2+ og Co2+, som cofaktorer for deres isomeriseringsaktiviteter . For at undersøge virkningen af divalente kationer på den katalytiske aktivitet af RdFucI på l-fuculose blev enzymaktiviteten analyseret i fravær og tilstedeværelse af enten 1 mM af forskellige metalioner eller ethylendiaminetetraeddikesyre (EDTA) (Tabel 1). Det native RdFucI-enzym, der ikke blev udsat for metalioner eller EDTA, udviste lav aktivitet, og metalchelatering med EDTA reducerede enzymaktiviteten. Blandt de testede metalioner resulterede Mn2+, Mg2+, Co2+, Cd2+ og Zn2+ i en udtalt stigning i enzymaktiviteten. Især tilføjelsen af Mn2+ øgede RdFucI’s aktivitet maksimalt med ca. 7,4 gange. I modsætning hertil hindrede Ca2+, Cu2+ og Fe3+ snarere aktiviteten af RdFucI.

Substratspecificitet og kinetiske parametre for RdFucI

Sukker- og sukkerphosphatisomeraser udviser generelt en bred specificitet over for forskellige substrater . For at vurdere, om den ketose-favoriserende aktivitet af RdFucI, der er vist med l-fuculose, også var tydelig med andre substrater, blev substratspecificiteten af RdFucI undersøgt mod forskellige aldosesukkerarter (l-fucose, d-arabinose, d-altrose, d-galactose, d-mannose og d-glucose) og deres tilsvarende ketosesukkerarter (l-fuculose, d-ribulose, d-psicose, d-tagatose og d-fructose) (fig. 4). Blandt alle disse substrater, herunder aldose- og ketose-sukkerarter, blev de højeste aktiviteter observeret med l-fuculose (115,3 U/mg) og d-ribulose (127,3 U/mg), som begge er ketose-sukkerarter. RdFucI’s aktiviteter for l-fuculose og d-ribulose var meget højere end aktiviteterne for de andre substrater. Blandt aldosesukkerstofferne var aktiviteten for l-fucose den højeste (21,0 U/mg), mens de andre substrater gav specifikke aktiviteter på mellem 4,7 og 7,9 U/mg. Andre ketose-sukkerarter end l-fuculose og d-ribulose udviste specifikke aktiviteter fra 0,0 til 10,8 U/mg. Således var l-fuculose og d-ribulose de foretrukne substrater for RdFucI, og ketose-favoriserende aktivitet af RdFucI blev kun vist med l-fuculose og d-ribulose.

Substratspecificitet af RdFucI. Enzymreaktioner blev udført mod 10 mM af forskellige aldose- og ketosesubstrater ved 40 °C og pH 10. For aldosesubstrater blev der anvendt l-fucose, d-arabinose, d-altrose, d-galactose, d-mannose og d-glucose. Til ketosesubstrater blev der anvendt l-fuculose, d-ribulose, d-psicose, d-tagatose og d-fructose. Eksperimentelle data repræsenterer middelværdier ± standardafvigelser for tre gentagelser

Kinetiske parametre blev bestemt ved hjælp af l-fuculose og d-ribulose som substrater (Additional file 5: Tabel S1). Værdierne for Km (Michaelis-konstant) og kcat (omsætningstal for substrat) for l-fuculose var henholdsvis 1,9- og 1,2-fold lavere end værdierne for d-ribulose. Den katalytiske effektivitet af RdFucI, repræsenteret som kcat/Km, for l-fuculose var 1,5 gange højere end for d-ribulose, hvilket indikerer, at l-fuculose foretrækkes som substrat af RdFucI.

Den samlede krystalstruktur af RdFucI

For bedre at forstå den molekylære funktion bestemte vi krystalstrukturen af RdFucI (Additional file 6: Table S2). Elektronetæthedskortet for RdFucI var veldefineret fra resterne Ser5-Arg591 for seks underenheder i den asymmetriske enhed. Monomeren RdFucI består af 19 α-helixer og 23 β-strenge, der omfatter N1-, N2- og C-domæner (fig. 5a). N1-domænet (Ser5-Met172) antager en α/β-foldning og er involveret i substratgenkendelse af den hexameriske dannelse af RdFucI. N2- (Lys173-Leu352) og C-domænerne (Thr353-Arg591) indeholder de metalbindingsrester, der er involveret i den katalytiske aktivitet (Fig. 5a). I den asymmetriske enhed danner RdFucI-underenhederne den hexameriske formation arrangeret som en dimer af trimere med D3h-pseudosymmetri (fig. 5b). Dette er i overensstemmelse med resultatet fra analytisk størrelseseksklusionskromatografi, hvor RdFucI viste sig at eksistere som en homohexamer i opløsning (Additional file 7: Fig. S5).

Gennemsnitlig struktur af RdFucI. a Tegneserieformet repræsentation af RdFucI-monomeren. RdFucI-monomeren består af N1- (gul), N2- (pink) og C-(grøn) domæner. b Overfladerepræsentation af RdFucI-hexameren. Underenhed A, B, C, D, E og F er farvet med henholdsvis gul, pink, cyan, lilla, grøn og orange. Et metalbindingssted på et substratbindingslommested er angivet med en rød prik

I den hexameriske formation er underenhed A (samlet overfladeareal: 23011.7 Å2) interagerer med fire forskellige underenheder B (rester i grænsefladen: 47/udbrændt overfladeareal: 1909,6 Å2), C (58/1837,6 Å2), D (42/1482,9 Å2) og E (34/1086,2 Å2). Underenhed A interagerer ikke med den resterende underenhed F (fig. 5b). Underenhed A af RdFucI har et samlet begravet overfladeareal på 2569,1 Å2, hvilket svarer til 27,45 % af det samlede overfladeareal. Denne begravede grænseflade er stabiliseret af interaktion, der involverer 59 hydrogenbindinger og 26 saltbroer fra andre underenheder (Yderligere fil 8: Tabel S3, Yderligere fil 9: Tabel S4, Yderligere fil 10: Tabel S5, Yderligere fil 11: Tabel S6).

Substratbindingssted og aktivt sted for RdFucI

Substratbindingslommen er dannet af N2- og C-domænerne i underenhed A og N1-domænet i underenhed B (Fig. 6a-c) og har i alt seks substratbindingssteder i den homohexameriske RdFucI. Indgangen til substratbindingslommen, hvor substratet nærmer sig, er ca. 11 × 12,5 Å (fig. 6a). Substratbindingslommen, hvor metalbindingsstedet dannes, har en negativt ladet overflade på ca. 4 × 5 Å (fig. 6b). Afstanden mellem metalbindingsstedet og overfladen af substratbindingslommen er ca. 16,7 Å (fig. 6d), hvilket antyder, at det aktive center er placeret dybt inde i en lomme. Dette indikerer, at både den åbne kæde og ringformen af substratet er tilgængelige for det aktive stedets centrum, og at omvendt ville et bulk-saccharid ikke være tilgængeligt for det aktive sted, der findes i substratbindingslommens indre.

Substratbindingslomme og aktivt sted for RdFucI. a Substratbindingslommen er dannet ved samling af underenhederne A og C. b Den elektrostatiske overflade af substratbindingslommen. c B-faktorpræsentation af substratbindingsfladen. d Snitfladebillede af substratbindingslommen. e 2Fo-F-elektrontæthedskortet (gråt net, kontureret ved 1,0 σ) over RdFucI’s metalbindingssteder i en opløsning, der indeholder 10 mM Mn2+. f Geometrisk analyse af RdFucI

RdFucI kræver divalente metalioner for sin katalytiske aktivitet til isomeriseringsreaktion ved hjælp af ene-diol-mekanismen . RdFucI’s metalbindingssted bør koordineres med Mn2+ af bevarede Glu337-, Asp359- og His528-rester (Additional file 12: Fig. S6). Der er imidlertid ikke noget Fo-Fc-elektrontæthedskort (talt ved > 5σ), der mistænkes for at være bundet til Mn2+ som et essentielt metal for substratbinding (Yderligere fil 13: Fig. S7a). B-faktoranalysen afslørede, at temperaturfaktoren for Mn2+ (70,53 Å2) er højere end den gennemsnitlige temperaturfaktor for proteinet (36.22 Å2), hvilket indikerer, at Mn2+ er til stede på RdFucI med en lav belægning. Dette resultat er i overensstemmelse med resultatet af den biokemiske analyse, hvor det native enzym udviste et lavt aktivitetsniveau. På den anden side øgede tilføjelsen af Mn2+ den katalytiske aktivitet af RdFucI betydeligt (tabel 1). Vi spekulerede således, at tilføjelsen af Mn2+ til RdFucI-krystallen ville øge bindingsbelægningen af Mn2+. Efter at have lagt RdFucI-krystaller i blød i en opløsning med 10 mM Mn2+ blev der observeret en pålidelig Fo-Fc-elektrontæthed (> 6σ) på metalbindingsstedet, hvor placeringen af Mn2+ blev afklaret i alle underenheder (Fig. 6e og Additional file 13: Fig. S7b). Temperatur-B-faktoren for Mn2+ (76,56 Å2) var imidlertid højere end for hele proteinet (60,69 Å2), hvilket antyder, at Mn2+-ionen stadig ikke er fuldt besat i metalbindingsstedet. Mn2+ blev koordineret af OE1 (gennemsnitlig afstand: 2,62 Å) og OE2 (2,65 Å) atomer af Glu337, OD1 (2,72 Å) og OD2 (2,72 Å) atomer af Asp361, NE2 (2,52 Å) atom af His528, og vandmolekylet (2,79 Å) (Fig. 6e). De gennemsnitlige bindingsvinkler for Glu337(OE1)-Mn2+-Asp361(OD2), Glu337(OE1)-Mn2+-His528(NE2) og Asp361(OD1)-Mn2+-His528(NE2) var henholdsvis 127,32°, 86,25° og 73,96°. Bindingsvinklen mellem liganderne og Mn2+ viste en forvrænget oktaedrisk koordinering.

Strukturel sammenligning med andre l-FucI’er

DALI-serveren blev brugt til at søge efter strukturelle homologer. Denne søgning afslørede, at RdFucI ligner l-FucI’er fra E. coli (EcFucI, PDB-kode 1FUI, Z-score: 60,6, rmsd: 0,3 for 587 Cαs atomer), Aeribacillus pallidus (ApFucI, 3A9R, Z-score: 56.6, rmsd: 0,7 for 580 Cαs atomer), og Streptococcus pneumonia (SpFucI, 4C20, Z-score: 55,9, rmsd: 0,7 for 585 Cαs atomer). Overlejring af substratbindingslommen viste, at de metalbindende rester Glu337, Asp361 og His528 (nummereret i RdFucI) er positionelt identiske med de andre proteiner, mens substratgenkendelsesrester (Arg16, W88, Gln300, Tyr437, Trp496 og Asn524) har en lille konformationel forskel i deres sidekæder (Fig. 7a). Især α7-α8-loop’en af hver enkelt l-FucI, som ligger på overfladen af substratbindingslommen, har en forskellig konformation. Sekvensudligning af l-FucI’er viste en stor lighed, men sekvensen for α7-α8-loop af hver enkelt l-FucI var meget variabel (fig. 7b). Da α7-α8-loop’en er involveret i dannelsen af substratbindingslommens arkitektur, danner hver enkelt l-FucI en unik substratbindingslomme (fig. 7c). l-FucI’er har almindeligvis en negativt ladet overflade omkring metalbindingsstedet, men overfladen af substratbindingslommen udviser forskellige ladningstilstande (fig. 7c). Som følge heraf vil α7-α8-loopens strukturelle forskelle medføre forskelle i l-FucIs substratspecificitet.