DDRGK1 er nødvendig for ER homoeostase
For at forstå DDRGK1’s cellulære funktion undersøgte vi virkningerne af DDRGK1 knockdown ved hjælp af en blanding af to siRNA’er som tidligere beskrevet21. Vi fandt, at knockdown af DDRGK1 inducerede apoptotisk celledød i både MCF7- og HepG2-celler, karakteriseret ved Annexin V/PI-farvning (fig. 1a), caspase-3-aktivering og PARP-spaltning (fig. 1b). Det skal bemærkes, at vi kan påvise caspase-3-spaltning i HepG2-celler induceret af knockdown af DDRGK1, men ikke i MCF7-celler, fordi MCF7-celler er caspase-3-mangelfulde22. Kvantitativ realtids-PCR-analyse (Q-PCR) viste, at knockdown af DDRGK1 øgede ekspressionen af de pro-apoptotiske gener BAX, BAK, NOXA, DR5 og Bid, mens ekspressionen af det anti-apoptotiske gen Bcl-2 blev nedsat (fig. 1c,d). Det er vigtigt, at vi fandt, at knockdown af DDRGK1 i MCF7- og HepG2-celler inducerede ER-stressreaktioner med øget ER-stress-specifik genekspression af BiP, HSPA8 og CHOP (Fig. 1e,f).
For yderligere at bekræfte, at DDRGK1 er involveret i ER-stressresponset, bestemte vi effekten af DDRGK1 på celleoverlevelsen efter behandling med ER-stressinducerne thapsigargin (Tg) og tunicamycin (Tm). Knocking down DDRGK1 øgede ER stress-induceret apoptose ved Tg-behandling i både HepG2- og MCF7-celler, som vurderet ved Annexin V/PI-farvning og spaltning af caspase-3 og PARP (Fig. 2a-c og Supplerende Fig. 1A-C). I modsætning hertil reducerede overekspression af DDRGK1 den ER-stressinducerede celledød i HepG2-celler (Fig. 2d-f). Desuden blev MCF7-cellernes levedygtighed vurderet ved MTT-assay, og resultaterne viste, at knockdown af DDRGK1 gjorde cellerne mere følsomme over for Tg- eller Tm-behandling med reduceret celleviabilitet (Supplerende fig. 1D), mens overekspression af DDRGK1 fremmede celleoverlevelsen efter Tg- eller Tm-behandling (Supplerende fig. 1E). Samlet set tyder vores resultater på, at DDRGK1 spiller en afgørende rolle i reguleringen af ER-homoeostase.
DDRGK1 modulerer UPR
For at forstå, hvordan DDRGK1 regulerer ER-homoeostase, analyserede vi først ændringer i proteinniveauerne af tre UPR-sensorer og deres nedstrømsmål i DDRGK1-depleterede celler. Resultaterne viste, at knockdown af DDRGK1 i MCF7- og HepG2-celler signifikant reducerede niveauerne af total IRE1α, men svagt reducerede fosforyleret IRE1α (p-IRE1α), hvilket kan skyldes de reducerede niveauer af total IRE1α (Fig. 3a). Niveauerne af ATF6 og kløvet ATF6 blev ikke påvirket (fig. 3a). Interessant nok påvirkede knockdown af DDRGK1 ikke niveauerne af total PERK, men niveauerne af fosforyleret PERK (p-PERK) og BiP blev signifikant forøget (Fig. 3a). Vi undersøgte derefter virkningerne af DDRGK1-depletion på IRE1α-substratet XBP1. Resultaterne viste, at XBP1s, en splejset form af XBP1, var signifikant nedsat i DDRGK1-knockdown MCF7-celler på en tidsafhængig måde (Fig. 3b), hvilket var korreleret med ændringer i IRE1α-proteinniveauerne (Supplerende Fig. 2A). Desuden øgede depletion af DDRGK1 niveauerne af eIF2α-fosforylering (p-eIF2α) og CHOP-ekspression i både MCF7- og HepG2-celler (Supplerende fig. 2B). Disse resultater tyder på, at depletion af DDRGK1 undertrykker UPR-IRE1α-signalering og aktiverer UPR-PERK-apoptosevejen, som følgelig udløser apoptose, som observeret i figur 1 og 2. Niveauet af IRE1α blev imidlertid øget i DDRGK1-overudtrykkende celler på en dosisafhængig måde (fig. 3c), mens niveauerne af p-PERK, PERK, ATF6, p-IRE1α, BiP og den splejsede form af XBP1 ikke blev ændret signifikant (fig. 3c; supplerende fig. 2C og D). For at undersøge det funktionelle forhold mellem DDRGK1 og UPR vurderede vi de dynamiske ændringer af IRE1α og PERK i DDRGK1-knockdown MCF7-celler og i kontrolceller efter Tg-behandling på forskellige tidspunkter. Behandling med Tg øgede niveauerne af IRE1α og p-IRE1α, p-PERK og BiP i kontrolceller, som forventet. De samlede IRE1α-niveauer var imidlertid signifikant nedsat (0-24 timer), mens p-IRE1α-niveauerne var beskedent nedsat (4-24 timer) i DDRGK1-depleterede celler sammenlignet med kontrolceller (fig. 3d). Samtidig var niveauet af XBP1s nedsat i DDRGK1-depleterede celler sammenlignet med kontrolceller (4-12 h) (Fig. 3e). Niveauerne af total PERK blev ikke ændret, men p-PERK blev signifikant forøget i DDRGK1-depleterede celler (0-12 h) (Fig. 3d). Lignende resultater blev opnået i HepG2-celler (Supplerende fig. 2E og F). Samlet set tyder vores resultater på, at depletion af DDRGK1 forårsager nedbrydning af IRE1α og PERK-aktivering.
DDRGK1 regulerer UPR ved at målrette IRE1α
UPR udløses af ER-stress-sensorer ved ER-stress for at regulere ER-homoeostase8. Det er blevet rapporteret, at hepatocytspecifik deletion af IRE1α i mus resulterede i aktivering af UPR-PERK-vejen23. For at undersøge, om den induktion af p-PERK, der blev observeret i DDRGK1-depleterede celler, var medieret af nedsatte niveauer af IRE1α, undersøgte vi niveauerne af p-PERK, PERK og dets downstream-mål i IRE1α-depleterede celler. Resultaterne viste, at knockdown af IRE1α signifikant øgede proteinniveauerne af p-PERK og p-eIF2α i både MCF7- og HepG2-celler (Fig. 4a), svarende til dem, der blev observeret i DDRGK1-depleterede celler (Fig. 3a; Supplerende Fig. 2B). Disse resultater tyder på, at DDRGK1 regulerer UPR ved at målrette IRE1α. Vi undersøgte derefter, hvordan DDRGK1 regulerer IRE1α. Vores resultater viste, at IRE1α-proteinniveauerne, men ikke mRNA-niveauerne (Supplerende fig. 3A), blev dramatisk nedsat i DDRGK1-knockdown-celler (fig. 3a). Behandling af cellerne med proteasomhæmmeren MG132 blokerede den DDRGK1-medierede reduktion af IRE1α-protein (Fig. 4b; Supplerende Fig. 3B). Desuden observerede vi, at depletion af DDRGK1 reducerede halveringstiden for IRE1α dramatisk i et cycloheximid-chase-assay (Fig. 4c). I overensstemmelse med disse observationer fandt vi, at ektopisk ekspression af IRE1α forbedrede celleoverlevelsen i både DDRGK1-depleterede MCF7- og HepG2-celler sammenlignet med kontrolceller, karakteriseret ved Annexin V/PI-farvning og caspase-3-aktivering (Fig. 4d,e; Supplerende Fig. 3C og D). Samlet set tyder disse resultater på, at DDRGK1 regulerer stabiliteten af IRE1α og dermed regulerer UPR.
DDRGK1 interagerer med IRE1α
For at forstå, hvordan DDRGK1 regulerer IRE1α-stabiliteten, testede vi, om DDRGK1 interagerer med IRE1α via et reciprok immunopræcipitations-assay (IP) i HEK293T-celler. Resultaterne viste, at exogent udtrykt Flag-IRE1α interagerede specifikt med endogene DDRGK1 og BiP (Fig. 5a). Tilsvarende interagerede exogent udtrykt Flag-DDRGK1 specifikt med endogent IRE1α og det kendte DDRGK1-associerede protein C53 (ref. 14). Vi kunne imidlertid ikke påvise BiP i Flag-DDRGK1-immunopræcipitaterne (Fig. 5b), hvilket tyder på, at DDRGK1 muligvis ikke interagerer direkte med BiP. IRE1α, som er et endogent ER-associeret nedbrydningssubstrat (ERAD), nedbrydes gennem associeringen mellem IRE1α og Sel1L-Hrd1 ERAD-komplekset på en BiP-afhængig måde24. Derfor undersøgte vi, om BiP er involveret i interaktionen mellem DDRGK1 og IRE1α. Resultaterne viste, at interaktionen mellem DDRGK1 og IRE1α ikke blev påvirket af knockdown af BiP (Supplerende fig. 4). For yderligere at bekræfte DDRGK1’s interaktion med IRE1α udførte vi immunofluorescensfarvningsforsøg for yderligere at bekræfte interaktionen mellem DDRGK1 og IRE1α. Resultaterne viste, at disse to proteiner samlokaliserede i ER (Fig. 5c). For at kortlægge den region, der er involveret i IRE1α’s interaktion med DDRGK1, co-transfekterede vi Flag-IRE1α wild-type og trunkationsmutanter sammen med DDRGK1 i HEK293T-celler, og IP-resultaterne viste, at det cytoplasmatiske kinase-domæne af IRE1α var nødvendigt for dets interaktion med DDRGK1 (Fig. 5d). For at forstå de dynamiske ændringer i interaktionen mellem DDRGK1 og IRE1α under ER-stressbetingelser blev HEK293T-celler transficeret med Flag-DDRGK1 og behandlet med Tg i forskellige tidspunkter. Som forventet observerede vi, at total IRE1α, p-IRE1α og BiP blev signifikant forøget under ER-stress. Interessant nok fandt vi, at DDRGK1 specifikt interagerede med ikke-fosforyleret IRE1α, men ikke med p-IRE1α, i immunoprecipitaterne (Fig. 5e). Disse resultater tyder på, at DDRGK1 interagerer med og opretholder stabiliteten af ikke-fosforyleret IRE1α.
Ufm1 er påkrævet for interaktionen mellem DDRGK1 og IRE1α
En nylig undersøgelse viste, at DDRGK1 er et ufmyleringssubstrat og er påkrævet for ASC1 ufmylering15,20. For at undersøge, om ufmylering er involveret i reguleringen af IRE1α-stabilitet af DDRGK1, undersøgte vi, om Ufm1-depletion påvirker IRE1α-proteinekspression. I lighed med depletion af DDRGK1 observerede vi, at knockdown af Ufm1-ekspression reducerede niveauerne af IRE1α-protein dramatisk (Fig. 6a), hvilket indikerer, at DDRGK1 regulerer IRE1α gennem ufmylering. Tilsvarende fandt vi, at overekspression af DDRGK1 ikke formåede at stabilisere IRE1α-proteinet i Ufm1-knockdown MCF7-celler sammenlignet med kontrolceller (Fig. 6b). Desuden blev IRE1α-proteinniveauerne dramatisk nedsat i Ufm1-knockdown MCF7-celler i både fravær og tilstedeværelse af Tg (Fig. 6c), hvilket tyder på, at ufmylering er nødvendig for DDRGK1’s regulering af IRE1α-proteinstabilitet. Vi spekulerede derefter på, om IRE1α er genstand for ufmyleringsmodifikation. For at besvare dette spørgsmål påviste vi ufmylering af IRE1α i celler, der udtrykker DDRGK1 og Ufm1 samt UBA5 (E1), UFC1 (E2) og UFL1 (E3), som tidligere beskrevet20. Vi kunne imidlertid ikke påvise nogen ufmylering af IRE1α-proteinet, selv om ufmylering af DDRGK1-proteinet let kunne påvises, som tidligere beskrevet (data ikke vist)15,20,25, hvilket tyder på, at IRE1α måske ikke er et mål for ufmylering. Interessant nok fandt vi, at forbindelsen mellem DDRGK1 og IRE1α var signifikant nedsat i Ufm1-knockdown HEK293T-celler sammenlignet med kontrolceller (Fig. 6d). I overensstemmelse med denne observation fandt vi, at interaktionen mellem DDRGK1 K267R (en DDRGK1-mutant, der er mangelfuld i ufmylering, hvor lysinrest 267 blev substitueret med en arginininrest)15 med IRE1α var dramatisk nedsat sammenlignet med DDRGK1 af vildtypen (Fig. 6e), hvilket indikerer, at ufmylering af DDRGK1 er påkrævet for associeringen mellem DDRGK1 og IRE1α. Desuden lykkedes det ikke DDRGK1 K267R at stabilisere IRE1α-proteinet sammenlignet med DDRGK1 af vildtypen (Fig. 6f). Samlet set tyder disse resultater på, at ufmylering af DDRGK1 ved K267 er påkrævet for dets interaktion med IRE1α og reguleringen af IRE1α-proteinets stabilitet.
DDRGK1 er påkrævet for HSC-rekonstitueringsevne hos mus
En nylig undersøgelse foreslog, at hæmatopoietiske stamceller (HSC’er) er ekstremt følsomme over for ER-stress26. Dette fik os til at spekulere i, at DDRGK1 kan være kritisk i HSC-funktionen. Vi bestemte først ekspressionsniveauet af DDRGK1 på tværs af flere hæmatopoietiske lineager fra 2 måneder gamle vildtype-mus. Q-PCR afslørede et signifikant højere niveau af DDRGK1-ekspression i HSC’er, herunder langtids-HSC’er (LT-HSC’er), korttids-HSC’er (ST-HSC’er) og multipotente progenitors (MPP’er) (Fig. 7a). Desuden blev DDRGK1’s proteinniveau udtrykt i høj grad i HSC-berigede Lineage-c-Kit+ knoglemarvsceller (BM) sammenlignet med Lineage+c-Kit- BM-celler (Fig. 7b). Disse observationer tyder på en vigtig rolle for DDRGK1 i stamceller. For at undersøge DDRGK1’s rolle i HSC-funktionen blev der udført konkurrerende transplantationsforsøg med HSC’er efter lentiviral knockdown af DDRGK1 (Fig. 7c). Lineage-Sca1+c-Kit+ (LSK)-celler fra CD45.1-donormus blev transduceret med kontrol- eller DDRGK1-knockdown-lentivirus og transplanteret til lethalt bestrålede CD45.2-modtagermus. Flowcytometrisk analyse viste, at procentdelen af donorafledte perifere blod (PB) celler var signifikant reduceret i DDRGK1-knockdown-gruppen sammenlignet med kontrolgruppen, hvilket indikerer, at knockdown af DDRGK1 signifikant forringede HSC’ernes konkurrencedygtige rekonstitueringsevne (Fig. 7d). Mens de modtagermus, der blev transplanteret med DDRGK1-knockdown HSC’er i et ikke-konkurrerende transplantationsforsøg, stadig var i live 3 måneder efter transplantationen, tyder dette på, at knockdown af DDRGK1 blot kompromitterede HSC’ernes konkurrerende rekonstitutionskapacitet. For at udelukke off-target-effekter designede vi et andet shRNA, der var rettet mod DDRGK1, og observerede lignende resultater (Supplerende figur 5A). Tre måneder efter transplantationen blev modtagermusene euthaniseret til BM-analyse og in vitro-kolonidannelsesassays. Flowcytometrisk analyse viste, at knockdown af DDRGK1 dramatisk forringede vedligeholdelsen af transducerede HSC’er uden at påvirke deres lineagepotentiale (dvs. myeloid-, B-celle- og T-celle-lineage), som angivet ved en nedsat frekvens af donorafledte hæmatopoietiske stamceller og progenitorceller samt differentierede hæmatopoietiske celler i BM og PB (Fig. 7e). Et lignende resultat blev observeret i et uafhængigt eksperiment med et andet shRNA, der var rettet mod DDRGK1 (Supplerende fig. 5B). Desuden isolerede vi donorafledte CD34-Flt3-LSK-celler (LT-HSC’er) fra modtagermusene og udførte en enkeltcelle-kolonidannelsesassay. Resultaterne viste, at knockdown af DDRGK1 forringede HSC’ernes evne til at danne mellemliggende og store kolonier (Fig. 7f). Samlet set tyder disse data på, at DDRGK1 er påkrævet for opretholdelse af HSC-funktionen.
For at undersøge, om nedsat HSC-funktion skyldtes nedsat homing-effektivitet, mærkede vi kontrol- eller sh-DDRGK1 lentiviralt transducerede LSK-celler oprenset fra 2 måneder gamle mus med fluorescerende farvestof (violet) og injicerede dem i lethalt bestrålede recipienter. Procentdelen af mærkede LSK-celler, der var til stede i recipientens BM 18 timer efter transplantationen, blev analyseret ved flowcytometri. Resultaterne viste, at DDRGK-knockdown-LSK-cellernes homing-evne var sammenlignelig med kontrolcellernes (supplerende figur 6A og B). For at bestemme, om knockdown af DDRGK1 havde en effekt på LSK-cellernes cellecyklusstatus, farvede vi donorafledte kontrol- og DDRGK1-knockdown LSK-celler med proliferationsmarkøren Ki67 og DAPI og fandt ingen signifikant forskel i cellecyklusprofilerne mellem DDRGK1-knockdown HSC’er og kontrol-HSC’er (Supplerende Fig. 7A). Vi undersøgte derefter virkningen af DDRGK1-knockdown på HSC’ernes apoptose ved hjælp af Annexin V-farvning og fandt en signifikant højere frekvens af apoptose i donorafledte DDRGK1-knockdown LSK-celler sammenlignet med kontrol-LSK-celler; dette fænomen blev observeret med begge shRNA’er, der var rettet mod DDRGK1 (Fig. 8a; Supplerende Fig. 7B). Dernæst undersøgte vi niveauerne af reaktive oxygenarter (ROS) i de transducerede HSC’er. Resultaterne viste, at ROS-niveauet var sammenligneligt mellem kontrol- og DDRGK1-knockdown-grupperne (Supplerende fig. 7C). På grundlag af ovenstående observationer konkluderede vi, at knockdown af DDRGK1 i HSC’er inducerede apoptotisk celledød og dermed forringede HSC-funktionen.
For at undersøge, om den forringede HSC-funktion skyldtes aktivering af ER-stressresponset i DDRGK1-knockdown HSC’er, analyserede vi ekspressionsniveauerne af BiP og CHOP ved Q-PCR i kontrol og DDRGK-knockdown engraftede HSC’er, resultaterne viste, at mRNA-niveauerne af BiP og CHOP var signifikant forhøjet i DDRGK1-knockdown HSC’er (Fig. 8b). Desuden undersøgte vi proteinniveauerne af ER-stress-sensorer i kontrol- og DDRGK-knockdown Lineage-c-Kit+ BM-cellerne. I overensstemmelse med observationen i kræftcellelinjer viste knockdown af DDRGK1 nedsatte proteinniveauer af IRE1α og p-IRE1α og et øget niveau af p-PERK, mens ATF6-niveauerne ikke var forskellige i kontrol- og DDRGK1-knockdown-grupperne (fig. 8c). Tilsvarende blev niveauet af XBP1s nedsat i donorafledte DDRGK1-knockdown LSK-celler (Fig. 8d). Samlet set viser disse resultater, at knockdown af DDRGK1 svækkede IRE1α-signalering, men aktiverede PERK-signalvejen og understøtter yderligere, at DDRGK1 er kritisk for korrekt vedligeholdelse af ER-homoeostase og dermed afgørende for overlevelse og vedligeholdelse af HSC’er.