Plasmidkonstruktion

Hver chimær anti-HA scFv, der blev testet i denne undersøgelse, blev konstrueret ved at transplantere seks CDR-sløjfer fra et anti-HA-antistof 12CA5 på hver udvalgt scFv scaffold. \(\chi _{15{\mathrm{{F}}}}11}^{{{\mathrm{{HA}}}}\) plasmidet blev konstrueret i to trin: (1) en CDR-loop-transplanteret scFv-gblock og en H4K20me1 mintbody 15F11-vektor38 lineariseret med EcoRI-restriktionssteder blev ligeret via Gibson-montering (House prepared master mix); (2) linkeren, der forbinder scFv og EGFP, samt EGFP blev erstattet af en gblock, der koder for en fleksibel (G4S) × 5 linker og mEGFP, ved Gibson-montering gennem NotI-restriktionssteder. For de fire andre chimære scFv-plasmider blev hver CDR-loop-transplantaet scFv-gblock ligeret ind i \(\chi _{15{{{\mathrm{{F}}}}11}^{{{{\mathrm{{{HA}}}}\) vektoren, der blev lineariseret ved EcoRI-restriktionssteder via Gibson-montering.

Målplasmidet 1 × HA-mCh-H2B blev konstrueret ved at erstatte sfGFP i et Addgene-plasmid sfGFP-H2B (Plasmid # 56367) med en 1 × HA-epitopmærket mCherry-gblock, hvori der blev indsat et NotI-restriktionssted mellem 1 × HA-epitopet og mCherry med henblik på følgende kloning. 4 × HA-mCh-H2B blev konstrueret ved at erstatte 1 × HA-tagget i 1 × HA-mCh-H2B-konstruktionen med en 4 × HA-epitop-gblock gennem AgeI- og NotI-restriktionssteder. 10 × HA-mCh-H2B (smHA-mCh-H2B) blev konstrueret ved at erstatte 1 × HA-tagget i 1 × HA-mCh-H2B-konstruktionen med smHA-amplificeret fra et Addgene-plasmid smHA-KDM5B-MS2 (plasmid nr. 81085) ved hjælp af primere NZ-098 og 099 (alle primersekvenser er vist i den supplerende tabel 1). smHA-H2B blev konstrueret ved at erstatte 1 × HA-mCh i 1 × HA-mCh-H2B-konstruktionen med smHA amplificeret fra plasmidet smHA-KDM5B-MS2 ved hjælp af primere NZ-098 og 100.

Et andet målplasmid 4 × HA-mCh-β-actin blev konstrueret ved at erstatte H2B i 4 × HA-mCh-H2B med en β-actin-amplikon via BglII- og BamHI-restriktionsstederne. β-actin-amplikonet blev amplificeret fra et Addgene-plasmid smFlag-ActinB-MS2 (Plasmid # 81083) ved hjælp af primerne NZ-073 og NZ-074.

Det 4 × HA-mRuby-Kv2.1-plasmid blev genereret ved først at amplificere 4 × HA-tagget fra 4 × HA-mCh-H2B ved hjælp af primerne NZ-105 og 106. Derefter blev 4 × HA-amplikonet introduceret i et offentliggjort plasmid pCMV-mRuby2-Kv2.161 (en gave fra Dr. Michael Tamkun), som var blevet lineariseret ved en restriktionsdigest med AgeI ved hjælp af Gibson-assembling. Plasmidet smHA-Kv2.1 blev frembragt ved PCR-amplifikation af den rotte-Kv2.1-kodningssekvens fra pBK-Kv2.140 og efterfølgende ligering til AsiSI- og PmeI-restriktionssteder på plasmidet smHA-KDM5B-MS2 ved hjælp af primere Kv2.1-1 og 2.

H2B-mCh-1 × HA blev konstrueret i to trin: (1) erstatte 1 × HA-tagget i 1 × HA-mCh-H2B med H2B gennem AgeI- og NotI-steder, hvor H2B blev amplificeret fra 1 × HA-mCh-H2B ved hjælp af primerne NZ-092 og 093; (2) erstatte H2B ved C-terminus af mCherry med et 1 × HA-tag gennem BglII- og BamHI-steder, hvor 1 × HA-tagget blev syntetiseret ved overlappende PCR med primerne NZ-094 og 095. Mito-mCh-1 × HA blev konstrueret ved at erstatte H2B i H2B-mCh-1 × HA med Mito gblock23 gennem AgeI- og NotI-steder. Mito-mCh-smHA blev konstrueret ved at erstatte 1 × HA-tagget i Mito-mCh-1 × HA med smHA, der er amplificeret fra smHA-KDM5B-MS2 ved hjælp af primerne NZ-096 og 097. mCh-H2B blev fremstillet ved at erstatte sfGFP i plasmidet sfGFP-H2B med en mCherry-gblock ved hjælp af Gibson-assemblage.

Plasmiderne FB-mCh, FB-Halo, FB-SNAP blev fremstillet ved at erstatte mEGFP i \(\chi _{15{{\mathrm{{F}}}}11}^{{{\mathrm{{HA}}}}\) med henholdsvis mCherry-, HaloTag- og SNAP-tag-gblokke.

pET23b-FB-GFP, plasmidet til rekombinant frankenbody-ekspression og rensning, blev Gibson-assembleret med en FB-GFP-amplikon og et offentliggjort plasmid pET23b-Sso7d62,63 lineariseret med NdeI- og NotI-restriktionssteder. FB-GFP-amplikonet blev amplificeret fra \(\chi _{15{{\mathrm{{{F}}}}11}^{{\mathrm{{{HA}}}}\) ved PCR med primerne NZ-075 og 077.

Til oversættelsesassayet blev reporterkonstruktet smHA-KDM5B-MS2 og SunTag-kif18b opnået fra Addgene (Plasmid # 81085 og # 74928), og SunTag scFv-plasmidet (Plasmid # 60907) blev modificeret ved at fjerne HA-epitopen, der er kodet i linkeren. HA-epitopen blev fjernet ved stedbestemt mutagenese med QuikChange Lightning (Agilent Technologies) i henhold til producentens anvisninger ved hjælp af primere HAout-1 og 2.

G-blokkene blev syntetiseret af Integrated DNA Technologies, og de rekombinante plasmider blev sekvensverificeret af Quintara Biosciences. Primernes sekvenser er vist i den supplerende tabel 1. Alle plasmider, der blev anvendt til billedtranslation, blev fremstillet ved hjælp af NucleoBond Xtra Midi EF-kit (Macherey-Nagel) med en slutkoncentration på ca. 1 mg mL-1.

U2OS-cellekultur

U2OS-celler (ATCC HTB-96) blev dyrket i et inkubator ved 37 °C, befugtet, med 5 % CO2 i DMEM-medium (Thermo Scientific) suppleret med 10 % (v/v) føtal bovin serum (Altas Biologicals), 1 mM l-glutamin (Gibco) og 1 % (v/v) penicillin-streptomycin (Gibco eller Invitrogen).

Transfektion og perleindlæsning

Til sporing af proteinlokalisering blev cellerne udplottet i et 35 mm MatTek-kammer (MatTek) 2 dage før billeddannelse og blev transient transficeret med LipofectamineTM LTX-reagens med PLUS-reagens (Invitrogen) i henhold til producentens anvisning 18-24 timer før billeddannelse.

Til billeddannelse af translation med mRNA mærket med MCP-Halo protein blev cellerne udplottet i et 35 mm MatTek-kammer (MatTek) dagen før billeddannelse. På dagen for billeddannelsen blev mediet i MatTek-kammeret før påfyldning af perler ændret til Opti-MEM (Thermo Scientific) med 10 % føtal bovin serum. En blanding af plasmider (smHA-KDM5B-MS2/FB) og oprenset MCP-HaloTag-protein17 blev fyldt med perler som tidligere beskrevet6,17,26. Kort fortalt blev 4 µL af en blanding af plasmider (1 µg hver) og MCP-HaloTag (130 ng) i PBS efter fjernelse af Opti-medium fra MatTek-kammeret pipetteret oven på cellerne, og ~106 µm glasperler (Sigma Aldrich) blev jævnt fordelt oven på cellerne. Kammeret blev derefter banket hårdt syv gange, og Opti-medium blev tilsat tilbage til cellerne. 3 timer efter påfyldning af perler blev cellerne farvet i 1 mL 0,2 nM JF646-HaloTag-ligand48 fortyndet i phenol-rødt-fri komplet DMEM. Efter en 20 minutters inkubation blev cellerne vasket tre gange i phenol-rødt-fri komplet DMEM for at fjerne glasperler og uligandede farvestoffer. Cellerne var derefter klar til billeddannelse.

Til billeddannelsesoversættelse uden mRNA-mærkning blev cellerne, der var plottet på MatTek-kammeret, transient transficeret med de nødvendige plasmider, smHA-KDM5B-MS2/FB med eller uden SunTag-kif18b/Sun (med HA-epitopen fjernet), ved hjælp af LipofectamineTM LTX-reagenset med PLUS-reagenset (Invitrogen) i henhold til producentens instruktion på dagen for billeddannelsen. 3 timer efter transfektion blev mediet skiftet til phenol-rød-fri komplet DMEM. Cellerne var derefter klar til billeddannelse.

Purificering af FB-GFP

E. coli BL21 (DE3) pLysS-celler transformeret med pET23b-FB-GFP blev dyrket ved 37 °C til en tæthed på OD600 0,6 i 2xYT-medium indeholdende Ampicillin (100 mg L-1) og Chloramphenicol (25 mg L-1) under rystning. Isopropyl-β-d-thiogalactosid (IPTG) blev tilsat for at inducere proteinekspression ved en slutkoncentration på 0,4 mM, og temperaturen blev sænket til 18 °C. Cellerne blev høstet efter 16 timer ved centrifugering og resuspenderet i PBS-buffer suppleret med 300 mM NaCl, proteaseinhibitorer (ThermoFisher), 0,2 mM AEBSF (20 mL L-1 kultur) og lyseret ved sonicering. Lysatet blev klaret ved centrifugering. Supernatanten blev indlæst på to forbundne HisTrap HP-kolonner på 5 mL (GE Healthcare), vasket og elueret med en lineær gradient af 0-500 mM imidazol. Fraktionerne, der indeholdt POI, blev samlet, koncentreret ved hjælp af Amicon Ultra-15 30 kDa MWCO centrifugalfilterenhed (EMD Millipore) og indlæst på en HiLoad Superdex 200 PG-kolonne med størrelseseksklusion (GE Healthcare) i HEPES-baseret buffer (25 mM HEPES pH 7,9, 12,5 mM MgCl2, 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 0,01 % NP40, 10 % glycerol og 1 mM DTT). Fraktionerne indeholdende FB-GFP-protein blev opsamlet, koncentreret og opbevaret ved -80 °C efter lynfrysning med flydende nitrogen.

Immunfarvning

U2OS-celler blev transient transficeret med 4 × HA-mCh-H2B eller 4 × HA-mCh-β-actin med LipofectamineTM LTX-reagenset med PLUS-reagenset (Invitrogen). 26 h efter transfektion blev cellerne fikseret med 4 % paraformaldehyd (Electron Microscopy Sciences) i 10 min ved stuetemperatur, permeabiliseret i 1 % Triton 100 i PBS, pH 7,4 i 20 min, blokeret i Blocking One-P (Nacalai Tesque) i 20 min og farvet ved 4 °C natten over med oprenset FB-GFP-protein (0,5 µg mL-1 i 10 % blokeringspuder). Næste morgen blev cellerne vasket med PBS, og POI blev afbildet med et Olympus IX81 konfokalt mikroskop med drejeskive (CSU22-hoved) under anvendelse af et ×100 olieimmersionsobjektiv (NA 1,40) under følgende betingelser: 488 nm (0,77 mW; målt ved objektivets bageste fokusplan; heri svarer alle lasereffektmålinger til objektivets bageste fokusplan) og 561 nm (0,42 mW) sekventiel billeddannelse for 50 tidspunkter uden forsinkelse, 2 × 2 spinhastighed, 100 ms eksponeringstid. Billederne blev optaget med et Photometrics Cascade II CCD-kamera ved hjælp af SlideBook-softwaren (Intelligent Imaging Innovations). Immunfarvningsbillederne blev genereret ved at beregne et gennemsnit af 50-tidspunktsbilleder for hver kanal ved hjælp af Fiji64.

Western blots

U2OS-celler blev transient transficeret med 4 × HA-mCh-H2B eller 4 × HA-mCh-β-actin med LipofectamineTM LTX-reagenset med PLUS-reagenset. 10 timer efter transfektion blev cellerne høstet og lyseret i 120 µL RIPA-buffer med cOmplete Protease Inhibitor (Roche). 6,5 µL af hvert cellelysat blev indlæst på en NuPAGETM 4-12 % Bis-Tris-proteingel (Invitrogen) og kørt i 60 min. ved 100 V og 25 min. ved 200 V. Proteinerne blev overført til en PVDF-membran (Invitrogen), blokeret i blokeringspuder (5 % mælkepulver i 0,05 % TBS-Tween 20) i 1 time og farvet natten over med enten renset FB-GFP-protein (0,5 µg mL-1 i blokeringspuder) eller anti-HA-parentalt antistof 12CA5 (Sigma-Aldrich Cat #1158383816001; 2000-fold fortynding med slutkoncentration 0,5 µg mL-1 i blokeringspuder). For det primære antistof 12CA5 blev der foretaget en yderligere inkubation i 1 time med anti-mus-antistof/Alexa488 (Thermo Fisher Cat #A11001; 5000-fold fortynding i blokeringsbuffer). POI blev detekteret ud fra GFP-fluorescensen for FB-GFP eller Alexa 488 for anti-HA-antistof ved hjælp af en Typhoon FLA 9500 (GE Healthcare Life Sciences) med følgende betingelser: excitationsbølgelængde 473 nm, LPB-filter (≥510 nm), 300 V fotomultiplikatorrør og 10 µm pixelstørrelse. De ubeskårne og ubehandlede westernblots leveres i supplerende figur 3.

Fluorescensgenopretning efter fotoblegning

For at undersøge bindingsaffiniteten af FB til HA-epitoper i levende celler blev FRAP-eksperimenter udført på celler, der var transient transficeret med 4 × HA-mCh-H2B (1,25 µg) og FB-GFP (1,25 µg) 24 timer før FRAP. Billederne blev optaget ved hjælp af et Olympus IX81 konfokalt mikroskop med drejeskive (CSU22-hoved) koblet til en Phasor-fotomanipulationsenhed (Intelligent Imaging Innovations) med et ×100 olieimmersionsobjektiv (NA 1,40). Før fotoblegning blev der optaget 20 eller 10 billeder med 1 eller 5 s tidsinterval. Billederne blev optaget ved hjælp af en 488 nm laser (0,77 mW) laser med 100 ms eksponeringstid efterfulgt af en 561 nm (0,42 mW) laser med 15 ms eksponeringstid. Spinningsskiven var indstillet til en spinningshastighed på 1 × 1. Efter optagelsen af pre-FRAP-billeder blev p488 nm-laseren (fra Phasor-enheden til fotoblegning) på 17 mW med 100 ms eksponeringstid eller 4 mW med 500 ms eksponering anvendt til at fotoblegme et cirkulært område i kernen. Efter fotoblegning blev der optaget 30 billeder uden forsinkelse eller med 500 ms forsinkelse, og derefter blev der optaget 100 billeder med 1 s forsinkelse og 100 billeder med 5 s forsinkelse med de samme billedbehandlingsindstillinger som før-FRAP-billederne. Den fluorescerende intensitet gennem tiden for det fotoblegede punkt blev eksporteret ved hjælp af Slidebook-softwaren. Den fluorescerende intensitet af kernen og baggrunden blev opnået ved hjælp af Fiji64 efter korrektion for cellebevægelse ved hjælp af StackReg Fiji plugin65. FRAP-kurven og thalf blev opnået ved hjælp af easyFRAP-web66 i overensstemmelse med vejledningen på webstedet. Figur 4b, d blev genereret af Mathematica (Wolfram Research).

MCP-oprensning

MCP-HaloTag blev oprenset ved hjælp af immobiliseret metalaffinitetskromatografi17. Kort fortalt blev His-tagged MCP-HaloTag oprenset gennem en Ni-NTA-agarose (Qiagen) pakket kolonne i henhold til producentens anvisninger med mindre ændringer. E. coli, der udtrykker det interesserede protein, blev lyseret i en PBS-buffer med et komplet sæt proteaseinhibitorer (Roche) og 10 mM imidazol. Harpiksen blev vasket med PBS-baseret buffer indeholdende 20 og 50 mM imidazol. Proteinet blev derefter elueret i en PBS-buffer med 300 mM imidazol. Den eluerede His-mærkede MCP blev dialyseret i en HEPES-baseret buffer (10 % glycerol, 25 mM HEPES pH 7,9, 12,5 mM MgCl2, 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 0,01 % NP-40 detergent og 1 mM DTT), snapfrosset i flydende nitrogen og derefter opbevaret ved -80 °C.

Celleforberedelse til sporing af nascent chain

Reporterplasmidet smHA-KDM5B-MS2 (Addgene plasmid #81085) og FB-konstruktionen blev enten transient transficeret uden MCP-HaloTag-protein eller perlebelagt med MCP-HaloTag-protein i U2OS-celler, der blev udplottet på 35 mm MatTek-kamre 4-6 timer før billeddannelse. 3 timer senere, hvis MCP-HaloTag-proteinet var fyldt med perler, blev cellerne farvet med JF646-HaloTag-liganden og derefter vasket med phenol-rødt-fri komplet DMEM-medium. Hvis der ikke var behov for MCP-HaloTag-protein, blev cellernes medium ændret til phenol-rødt-fri komplet DMEM-medium 3 timer efter transfektion. Cellerne var derefter klar til billeddannelse.

For multiplexed imaging blev to reporterplasmider, smHA-KDM5B-MS2 og SunTag-kif18b, samt to prober, FB-mCh og Sun-GFP (med HA-epitopen fjernet), transient transficeret i U2OS-celler, der blev udplottet på et MatTek-kammer 4-6 timer før billeddannelse. 3 timer senere blev cellernes medium ændret til phenol-rødt-fri komplet DMEM-medium. Cellerne var derefter klar til billeddannelse.

Billeddannelsesbetingelse for translations- og kolokaliseringsassays

For at afbilde enkelte mRNA’er og deres translationsstatus med FB blev der anvendt et specialbygget widefield fluorescensmikroskop baseret på et skråt belysningsskema (HILO)17,67. Kort sagt blev excitationsstrålerne, 488, 561, 637 nm faststoflasere (Vortran), koblet og fokuseret uden for akse på det bageste fokusplan af objektivobjektivet (APON 60XOTIRF, Olympus). Alle rapporterede lasereffekter blev målt ved objektivets bagfokalplan. Emissionssignalerne blev opdelt af et ultrafladt dichroisk spejl af billedbehandlingskvalitet (T660lpxr, Chroma). De længere emissionssignaler (fjernrødt) blev efter opsplitning ledt gennem et båndpasfilter (FF01-731/137-25, Semrock). De kortere emissionssignaler (rødt og grønt) efter opsplitning blev ledt gennem enten et båndpasfilter for rødt (FF01-593/46-25, Semrock) eller et båndpasfilter for grønt (FF01-510/42-25, Semrock), der var installeret i et filterhjul (HS-625 HSFW TTL, Finger Lakes Instrumentation). De længere (fjernrøde) og de kortere (røde og grønne) emissionssignaler blev registreret af to separate EM-CCD-kameraer (iXon Ultra 888, Andor) ved at fokusere med et 300 mm achromatisk doubletobjektiv (AC254-300-A-ML, Thorlabs). Kombinationen af et ×60 objektiv fra Olympus, et 300 mm rørobjektiv og iXon Ultra 888 giver ×100-billeder med 130 nm pixel-1. En stage top inkubator til temperatur (37 °C), luftfugtighed og 5 % CO2 (Okolab) er udstyret på en piezoelektrisk stage (PZU-2150, Applied Scientific Instrumentation) til billeddannelse af levende celler. Laserne, kameraerne, den piezoelektriske stage og filterhjulet blev synkroniseret af en open source-mikrocontroller, Arduino Mega boardet (Arduino). Billedoptagelse blev udført ved hjælp af open source Micro-Manager-software (1.4.22)68.

Billedstørrelsen blev indstillet til centrum 512 × 512 pixels2 (66,6 × 66,6 µm2), og kameraets integrationstid blev indstillet til 53,64 ms. Kameraernes udlæsningstid fra kombinationen af vores billeddannelsesstørrelse, udlæsningstilstand (30 MHz) og vertikal forskydningshastighed (1,13 µs) var 23,36 ms, hvilket resulterede i vores billeddannelseshastighed på 13 Hz (70 ms pr. billede). Røde og grønne signaler blev afbildet skiftevis. Emissionsfilterets position blev ændret i løbet af kameraets udlæsningstid. For at minimere gennemslaget blev det fjernrøde signal afbildet samtidig med det grønne signal. For at indfange hele cellens tykkelse blev 13 z-stakke med en trinstørrelse på 500 nm (i alt 6 µm) afbildet ved hjælp af den piezoelektriske stage. Dette resulterede i vores samlede cellulære afbildningshastighed på 1 Hz for afbildning af enten røde eller grønne signaler og 0,5 Hz for afbildning af både røde og grønne signaler uanset fjernrød afbildning.

For Fig. 1c, d, 2a, e blev et enkelt plan af cellerne afbildet kontinuerligt med 6,5 Hz i 100 tidspunkter og gennemsnitligt afbildet i hele tiden (lasere: 488 nm, 130 µW; 561 nm, 4 µW (fig. 1c), 90 µW (fig. 1d), 19 µW (fig. 2a), 155 µW (fig. 2e); 637 nm, 220 µW). I fig. 2b (venstre) blev cellen afbildet kontinuerligt ved 0,5 Hz, 488 nm (100 µW) og 561 nm (10 µW) lasere med 13 z-stacks for hvert tidspunkt og med et gennemsnit for hele tiden. De erhvervede gennemsnitlige 13 z-stacks blev afviklet ved hjælp af Fiji. I fig. 6b, c, e og f blev cellerne afbildet hver 10. sekund med 13 z-stacks pr. tidspunkt (lasere: 488 nm, 13 µW (fig. 6b), 18 µW (fig. 6c); 561 nm, 172 µW (fig. 6f); 637 nm, 150 µW (fig. 6b, c), 35 µW (fig. 6e)). I fig. 7b blev cellen afbildet kontinuerligt ved 0,5 Hz med 13 z-stakke for hvert tidspunkt (lasere: 488 nm, 130 µW; 561 nm, 172 µW). I fig. 8b blev cellerne afbildet hver 14. sekund med 13 z-stacks for hvert tidspunkt (laser: 488 nm, 70 µW). I fig. 8c blev cellerne fotograferet hver 40. sekund med 13 z-stacks for hvert tidspunkt (laser: 488 nm, 130 µW). Til bestemmelse af hastigheden af motoriserede translationspletter (Fig. 8e) blev neuronerne afbildet kontinuerligt med 1 Hz med 13 z-stakke pr. tidspunkt.

Til Fig. 2b (til højre) og 2c blev samlokaliseringen afbildet med det før beskrevne Olympus IX81 konfokale mikroskop med drejeskive (CSU22-hoved) med et ×100 olieimmersionsobjektiv (NA 1,40) under følgende betingelser: 488 nm (0,77 mW) og 561 nm (0,42 mW) sekventiel billeddannelse for fem tidspunkter uden forsinkelse med flere z-skiver for at dække hele cellekroppen for hvert tidspunkt, 1 × 1 spinhastighed, eksponeringstid justeret efter cellens lysstyrke. Billederne blev optaget med et Photometrics Cascade II CCD-kamera ved hjælp af SlideBook-softwaren (Intelligent Imaging Innovations). De viste billeder i figurer blev genereret ved at beregne et gennemsnit af fem tidspunkter, hvorefter en max-projektion af alle z-skiver blev udført af Fiji64.

Partikelsporing af translationssteder

Detektion og sporing af enkeltstående translationssteder blev udført på billeder med maksimalintensitetsprojektion med brugerdefineret Mathematica (Wolfram Research)-kode17. Kort fortalt blev billederne behandlet med et båndpasfilter for at fremhæve partikler og derefter binariseret for at detektere deres intensitetscentroider som positioner ved hjælp af den indbyggede Mathematica-rutine ComponentMeasurements. De detekterede partikler blev sporet og forbundet gennem tiden ved hjælp af en søgning efter nærmeste nabo. De præcise koordinater (superopløste placeringer) af mRNA’er og translationssteder blev bestemt ved at tilpasse (ved hjælp af den indbyggede Mathematica-rutine NonlinearModelFit) de oprindelige billeder til 2D Gaussianer af følgende form: