I løbet af det seneste årti har kemogenetiske og optogenetiske teknikker revolutioneret integrativ neurovidenskab ved at give nye værktøjer til reversibelt at manipulere aktiviteten af specifikke populationer eller neurotransmittersystemer med større selektivitet (Sternson og Roth, 2014; Roth, 2016; Wiegert et al., 2017). Sammenlignet med optogenetik, som tillader hurtig og fasisk neuronal modulering med høj tidsmæssig opløsning, tillader kemogenetik mere udvidet modulering af systemer, hvilket er særligt nyttigt til undersøgelser med fokus på toniske fænomener (f.eks. undersøgelse af dopamins involvering i motiverende processer; Whissell et al., 2016). Blandt kemogenetiske værktøjer er designereceptorer, der udelukkende aktiveres af designermedicin (DREADD’er), meget udbredt og omtales som et biologisk “lås-og-nøgle”-system til selektiv manipulation af celleaktivitet gennem G-protein-signalveje. De blev først udviklet meget elegant af Roth’s gruppe (Armbruster et al., 2007), er denne G-protein-koblede receptor (GPCR) en muscarinreceptor: låsen, som blev muteret til kun at reagere på clozapin-N-oxid (CNO), nøglen, en afledt metabolit af det atypiske antipsykotikum clozapin, ellers med potentielt ingen farmakologisk aktivitet.

Siden 2016 har nogle publikationer imidlertid rejst bekymrende spørgsmål vedrørende brugen af CNO. For det første kan relativt høje doser CNO (10 mg/kg), der administreres systemisk, have farmakologisk off-target-aktivitet, hvilket fremgår af induktion af adfærdsmæssige virkninger hos rotter og mus, der ikke er medieret af DREADDs (MacLaren et al., 2016; Gomez et al., 2017; Baerentzen et al., 2019). Derudover viste Gomez et al. (2017), at CNO ikke let krydser blod-hjernebarrieren, kan udvise lav DREADD-bindingsaffinitet og blev tilbage-metaboliseret til clozapin, hvilket blev den virkelige effektor af DREADD’erne. På baggrund af disse bemærkelsesværdige observationer foreslog de direkte brug af lave doser clozapin (0,1 mg/kg) til at aktivere DREADD’er i stedet for CNO. Anvendelse af lave doser clozapin i stedet for store doser CNO, der gradvist omdannes til clozapin, fører imidlertid til to store begrænsninger. For det første er det ikke indlysende, at clozapin, ved akut injektion eller langvarig diffusion, virker på DREADDs på samme måde (Mahler og Aston-Jones, 2018). For det andet, da clozapin er et atypisk antipsykotisk middel, har det mange endogene mål såsom serotoninerge, muscariniske eller dopaminerge receptorer med relativt stærke affiniteter (Meltzer, 1989; Schotte et al., 1993; Brunello et al., 1995; Ashby og Wang, 1996; Armbruster et al., 2007) og er tilbøjelige til at inducere off-target-effekter, selv med lave doser. Faktisk har den 0,1 mg/kg dosis clozapin, der anbefales til DREADD-forsøg, vist sig at øge angstrelateret adfærd betydeligt hos mus (Manzaneque et al., 2002) såvel som hos rotter (en effekt, som vi også observerede; R. Goutaudier og S. Carnicella, upublicerede observationer), hvor clozapin også påvirker lokomotionen gennem potentiel sedation og forringer den kognitive fleksibilitet (Ilg et al, 2018).

Og selv om forekomsten af disse virkninger kan afhænge af den anvendte art, stamme eller køn og kan være meget diskret (da ikke alle adfærdsdimensioner påvirkes); de har potentiale til at forstyrre dyrenes præstation i en række adfærdsopgaver betydeligt. Høj stress og angst kan være forstyrrende faktorer i f.eks. hukommelses- eller smerteundersøgelser (Sousa et al., 2006; Sorge et al., 2014). Desuden kan adfærd relateret til misbrug af stoffer eller psykiatriske lidelser såsom skizofreni, angst eller kognitiv fleksibilitet ændre hele fænotypen (Floresco et al., 2009; Koob og Schulkin, 2018). Baseret på disse observationer er der behov for vigtige forholdsregler med clozapin for at undgå biased adfærdsundersøgelser.

Vil et nyt molekyle specifikt designet til DREADDs være mere selektivt? Forbindelse 21 (C21) er en syntetisk DREADD-ligand, udviklet i 2015 (Chen et al., 2015) og delvist karakteriseret in vitro såvel som in vivo i 2018 (Thompson et al., 2018). Igen blev det ved lave doser (<3 mg/kg) beskrevet som værende blottet for adfærdsmæssige off-target-effekter og i stand til at ændre adfærden hos DREADD-eksprimerende dyr. Denne undersøgelse blev styrket af Jendryka et al. (2019), som gennemførte farmakokinetiske og farmakodynamiske eksperimenter med mus og C21 (3 mg/kg). De viste, at 30 minutter efter C21-administration var koncentrationen af molekylet i CSF >10 gange højere end den estimerede EC50 for DREADD-aktivering (CSF = 40 nm og EC50DREADDs = 3 nm), og uden back-metabolisering til clozapin. Resultaterne af en nylig BioRxiv preprint-undersøgelse i rotter, mus og makaker (Bonaventura et al., 2018) tyder imidlertid på, at selv om C21 udviser en lav hjernepenetrering, kan en dosis på 1 mg/kg allerede ændre hjernefunktionen i vildtype-mus. Desuden blev der observeret en svag affinitet og besættelse for DREADD’er in vitro i skiver af rottehjerne samt in vivo i mus og makaker i en positronemissionstomografiundersøgelse. Baseret på den samme eksperimentelle undersøgelse som for C21 foreslog de som et alternativ to andre ligander, JHU37152 og JHU37160, som besidder en højere in vivo potens for DREADDs og potentielt færre off-target-effekter (Bonaventura et al., 2018). Selv om denne nye generation af DREADD-ligander synes lovende, er de på grund af deres nyhed stadig dårligt karakteriseret og forbliver strukturelt homologe med clozapin og CNO. Udførlig karakterisering i cellulær til adfærdsmæssig undersøgelse vil derfor være afgørende for at udelukke de potentielle faldgruber, der blev fundet for CNO.

En alternativ løsning til forbedring af selektiviteten af kemogenetiske tilgange ville være at bruge en anden lås og nøglekombination. Som sådan er κ-opioidreceptor-DREADD (KORD) en muteret inhiberende GPCR, der er afledt af den humane κ-opioidreceptor (Vardy et al., 2015). Sammenlignet med klassiske DREADD’er, der binder clozapin, CNO, C21 eller JHU-forbindelser, er KORD engageret af salvinorin B, en lægemiddellignende metabolit af den KOR-selektive agonist salvinorin A. Selv om denne kemogenetiske tilgang elegant blev brugt i kombination med en aktiverende DREADD for at skabe et “ON og OFF”-system inden for den samme neuronale population (Vardy et al, 2015, Aldrin-Kirk et al., 2016), forbliver det marginalt anvendt, fordi det kun reducerer den neuronale aktivitet over en kort periode (Aldrin-Kirk og Björklund, 2019). Desuden udviser salvinorin B en vis affinitet for endogene KOR ved høje koncentrationer og har endnu ikke nydt godt af en dybtgående karakterisering, som det i øjeblikket udføres for DREADD-relaterede forbindelser (Roth, 2016). Udskiftning af GPCR’en med en muteret ionkanal, en anden alternativ designet receptor kaldet ligand-gated ionkanaler (LGIC’er) er en mulighed, der er udviklet af Stenson-laboratoriet (Magnus et al., 2011). Sammenlignet med DREADD’er kombinerer LGIC’er det ligandbindende domæne af en muteret nikotinreceptor med ionporedomænet af en anden udvalgt receptor for at skabe en chimær ionkanal. I lighed med DREADD’er aktiveres denne hybridkanal af en lille agonist, der er afledt af quinuclidinylbenzamid, en α7 nikotinisk acetylcholinreceptoragonist, og muliggør ionudveksling på tværs af neuronmembranen. Blandt andre begrænsninger, der er specifikke for denne tilgang (Aldrin-Kirk og Björklund, 2019), deler den også med DREADD’er brugen af en farmakologisk ligand, der potentielt kan interagere med endogene receptorer, afhængigt af de eksperimentelle betingelser. Endelig stammer alle disse låse fra endogene receptorer og undgår som sådan ikke at slippe af med de begrænsninger, der iboende er knyttet til farmakologi.

Bortset fra disse nylige udviklinger og de spørgsmål, der stadig er tilbage, bør et afgørende spørgsmål stilles: Vil en fuldstændig selektiv og inaktiv nøgle nogensinde blive fundet? Sandsynligvis ikke. Det er vigtigt at huske på, at DREADD’er er kemogenetiske værktøjer, der kombinerer genetik og farmakologi. Selv om genetiske metoder giver en effektiv kontrol af ekspressionen af låsene (dvs. DREADD’er) i specifikke cellepopulationer eller subpopulationer med konditionelle metoder, stammer de fra endogene GPCR’er og er som sådan underlagt de samme begrænsninger som den klassiske farmakologi for nøglen. Det er derfor usandsynligt, at der vil blive fundet molekyler, der vil udvise høj bindingsaffinitet for DREADD’er uden affinitet for nogle af de mange receptorer, der allerede findes i hjernen og er nært beslægtede med DREADD’er. For eksempel har clozapin en meget høj affinitet for DREADD’er, men også for den serotoninerge receptor 5-HT2 (Ki = 10-8 for begge; Armbruster et al., 2007; Gomez et al., 2017), og en høj affinitet for en bred vifte af andre GPCR’er (Ki = 10-7 til 10-6; Armbruster et al., 2007). Selv syntetiske ligander, der er specielt designet til denne kemogenetiske teknik, udviser betydelige affiniteter for endogene receptorer. For eksempel har JHU37152 og JHU37160, selv om de har en lavere affinitet for 5-HT-receptorer end clozapin, en samlet set lignende målprofil som dette lægemiddel, med en endnu højere affinitet for muscarinreceptorer (Bonaventura et al., 2018), hvilket tyder på potentielt stærkere off-target-effekter. C21 udviser også en højere affinitet for den histaminergiske H1-receptor end for DREADD’er (Ki > 10-8 og Ki = 10-7,2, henholdsvis; Thompson et al., 2018) og et større bindingspotentiale til opioidreceptorer end clozapin (Bonaventura et al., 2018). For at minimere faldgruberne ved denne kraftfulde tilgang skal der, uanset nøglevalget, træffes kritiske forholdsregler (Fig. 1).

Først skal de eksperimentelle betingelser testes før ethvert adfærdseksperiment for at finde den bedste ligand og den optimale dosis eller de optimale doser, afhængigt af den eksperimentelle tilgang. DREADD’er må ikke betragtes som et nøglefærdigt værktøj; cellulære, neurokemiske eller elektrofysiologiske eksperimenter bør udføres før den adfærdsmæssige undersøgelse (Mahler et al., 2014; Beloate et al., 2016; Boekhoudt et al., 2016) for at bekræfte ligandens effektivitet ved den valgte dosis i det pågældende system. Desuden skal der også medtages DREADD-manglende kontroldyr for at verificere fraværet af aspekifikke neurobiologiske virkninger af liganden eller receptoren i sig selv, der kan aktiveres af en neurotransmitter eller have en konstitutiv aktivitet (Saloman et al., 2016).

For det andet bør to forskellige DREADD-ligander, når det er muligt, testes for at bekræfte, at de observerede adfærdseffekter er specifikt DREADD-medieret. De specifikke farmakologiske handlinger på DREADD’er ville være ens, men off-target-effekter kan være forskellige.

For det tredje, og det mest kritiske punkt, skal der anvendes konventionelle farmakologiske kontroller. Den samme filosofi som i farmakologi bør anvendes, og ligesom for neurobiologiske eksperimenter skal der integreres grupper af transgene dyr uden at udtrykke DREADD’er (f.eks. DREADD’er tomme virale vektorer) for at verificere de selektive virkninger af liganden og den valgte dosis (Smith et al., 2016, Campbell og Marchant, 2018; Mahler og Aston-Jones, 2018; for et eksempel på eksperimentelle undersøgelser, der følger dette design, se også Xia et al., 2017; Cope et al., 2019). Dette udsagn kan synes trivielt, men jagten på en absolut selektiv ligand og tiltrækningen af denne tilgang har allerede ført til nogle overmodige adfærdsundersøgelser, der undertiden udføres i fuldstændig fravær af denne kontrol.

Sammenfattende giver DREADD’er en præcis måde at manipulere neurale kredsløb og adfærd på og giver et godt alternativ til optogenetik til tonisk at manipulere en specifik cellulær subpopulation og åbner dermed spændende nye forskningsveje. Men ligesom termiske egenskaber af lys i optogenetik kan føre til uspecifikke effekter (se også Owen et al., 2019), er der behov for større forsigtighed med kemogenetik, og standardkontroller skal være obligatoriske. DREADD-begrænsninger skal anerkendes, og der skal tages tid til at undgå eller kontrollere mulige off-target-effekter og til at verificere, at denne tilgang ikke fremkalder bias i sig selv. Ved at udnytte genetikkens styrker og samtidig være opmærksom på farmakologiens svagheder vil man maksimere potentialet i denne tilgang.