TEXT
Yersinia pestis je etiologickým původcem moru a má potenciál pro použití jako biologická zbraň (1, 13, 17-20, 23). Z tohoto důvodu je důležité, aby nově vznikající rezistence k léčivům, ať už přirozená nebo uměle vytvořená, byla zjistitelná pomocí standardizovaných metod, které lze snadno zavést ve více laboratořích. Institut pro klinické a laboratorní standardy (CLSI) popisuje referenční bujónovou mikrodiluční metodu (BMD) pro testování antimikrobiální citlivosti Y. pestis a poskytuje pokyny pro interpretaci MIC pro osm antimikrobiálních látek (6). BMD používá kationtově upravený Muellerův-Hintonův bujón (CAMHB) a vyžaduje inkubaci při 35 °C po dobu 24 h s možností inkubace po dobu 48 h, pokud je růst po 24 h nedostatečný pro interpretaci konečného bodu. Referenční BMD je bohužel v mnoha laboratořích obtížně zařaditelná, protože je poměrně nákladná a pracná a vyžaduje skladování panelů ve zmrazeném nebo dehydratovaném formátu. Existuje několik alternativních metod testování citlivosti, včetně diskové difuzní metody a metody Etest. Před použitím těchto metod pro daný druh je však třeba je vyhodnotit a porovnat s BMD, aby se zjistila korelace mezi výsledky získanými porovnáním metod.
Izoláty Y. pestis jsou rychlošíplavé a mohou růst na umělých médiích pomaleji než jiné běžné druhy Enterobacteriaceae, a proto bylo obtížné standardizovat metody testování citlivosti pro Y. pestis. V literatuře je popsáno několik metod. Diskové difuzní testování se obvykle provádí na Muellerově-Hintonově agaru (MHA), obvykle za použití 48hodinové inkubace při 35 °C, ale metodické popisy někdy postrádají podrobnosti (10, 16, 24). Metodu Etest použili Wong et al. (25) s použitím MHA s 5 % ovčí krve, inkubací při 35 °C a inokulem odpovídajícím č. 1. 1 McFarlanda namísto 0,5 McFarlandova standardu používaného ve většině diskových nebo Etestových difuzních studií. Agarózní ředění s použitím MHA inkubovaného při 27 °C až 30 °C po dobu 48 hodin je nejběžnější metodou uváděnou v literatuře (7, 8, 11, 12, 22). Byly také použity metody makrodiluce bujónu a mikrodiluce s různými inkubačními teplotami (2, 21).
Disková difúze a metody Etest mají několik vlastností, které z nich činí atraktivní alternativní metody pro testování citlivosti, včetně snadného skladování a dlouhé skladovatelnosti disků a proužků. Rovněž se jedná o metody založené na agaru a koncové body mohou být snadněji čitelné než u BMD. Etest má navíc tu výhodu, že poskytuje výsledek MIC. V této zprávě uvádíme výsledky multicentrické studie porovnávající metody Etest a diskové difúze s referenční metodou CLSI BMD pro testování citlivosti Y. pestis.
(Tato zpráva byla částečně prezentována na 107. valném shromáždění Americké mikrobiologické společnosti, Toronto, Kanada, 21. až 25. května 2007.)
Dvaceti šesti různým kmenům Y. pestis ze sbírek Centers for Disease Control and Prevention (CDC) a U.S. Army Medical Research Institute of Infectious Diseases (USAMRIID) byly provedeny testy metodami Etest a BMD na čtyřech testovacích místech a navíc diskovou difuzí na dvou z těchto míst. Šest kmenů bylo biovaru Antiqua, sedm biovaru Medievalis a 12 biovaru Orientalis; jeden atypický izolát nebylo možné přiřadit k žádnému biovaru. Antimikrobiální látky byly testovány pomocí BMD i Etestu (bioMérieux, Durham, NC) a jejich odpovídající rozsahy byly pro BMD a Etest následující: pro chloramfenikol 0,03 až 64 μg/ml a 0,016 až 256 μg/ml; pro ciprofloxacin 0,03 až 64 μg/ml a 0,002 až 32 μg/ml; pro doxycyklin 0,03 až 64 μg/ml a 0,002 až 32 μg/ml.016 až 256 μg/ml; pro gentamicin 0,03 až 64 μg/ml a 0,016 až 256 μg/ml; pro levofloxacin 0,06 až 64 μg/ml a 0,002 až 32 μg/ml; pro streptomycin 0,03 až 64 μg/ml a 0.016 až 256 μg/ml; pro tetracyklin 0,03 až 64 μg/ml a 0,016 až 256 μg/ml; a pro trimethoprim-sulfametoxazol 0,015/32 až 16/304 μg/ml a 0,002/0,038 až 32/608 μg/ml. Vzhledem k tomu, že rozsahy pro testování některých léčiv pomocí BMD nezahrnovaly nižší koncentrace dosažitelné pomocí Etestu, byla základní shoda (± 1 log2 ředění) mezi metodami u některých porovnání výsledků považována za vybočující ze škály (např. MIC levofloxacinu podle BMD ≤0,06 μg/ml a MIC podle Etestu 0,03 μg/ml). V CDC byly připraveny 96jamkové zásobníky MIC s použitím 100 μl CAMHB (BBL, Sparks, MD) na jamku; zásobníky byly uchovávány zmrazené při -70 °C a zasílány do zúčastněných laboratoří. Testování bylo provedeno standardními metodami CLSI pro BMD a diskovou difúzi (4-6). Inokuly byly připraveny z 18- až 24hodinových aerobních kultur vypěstovaných na deskách z 5% ovčího krevního agaru (BBL) metodou přímé suspenze kolonií v Muellerově-Hintonově bujónu (MHB) (Remel, Lenexa, KS) tak, aby odpovídaly standardu zákalu 0,5 McFarlanda (4); stejné inokuly byly použity k inokulaci desek MHA o průměru 150 mm pro testy Etest a diskovou difúzi. Ihned po inokulaci byly na každém testovacím místě provedeny nejméně dva náhodné počty kolonií s pozitivní kontrolní jamkou pro růst BMD, aby bylo možné posoudit velikost inokula. Na jednu destičku byly použity nejvýše čtyři proužky Etest. Pro diskovou difúzi byly aplikovány komerční disky (BBL) pomocí samotupovacího multidiskového dávkovače (BBL). BMD panely a MHA destičky pro Etest i diskovou difúzi byly inkubovány při 35 °C a odečítány po 24 a 48 hodinách. Etesty byly odečteny podle pokynů v příbalových informacích Etestu takto: chloramfenikol, doxycyklin, tetracyklin a trimethoprim-sulfametoxazol byly odečteny při 80% inhibici pro bod průniku; ciprofloxacin, levofloxacin, gentamicin a streptomycin byly odečteny při 100% inhibici. Pro analýzu dat byly MIC Etestu zaokrouhleny nahoru na nejbližší log2 ředění. Pro kontrolu kvality BMD a Etestu byly použity Escherichia coli ATCC 25922 a Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. MIC pro kmeny kontroly kvality byly stanoveny inkubací po dobu 16 až 20 h. Přijatelné rozsahy kontroly kvality BMD pro streptomycin byly dříve stanoveny v CDC (nepublikované údaje). Kontrola kvality Etestu chloramfenikolu byla provedena testováním Escherichia coli ATCC 25922 a použitím přijatelného rozmezí pro BMD CLSI.
Pro měření shody mezi výsledky Etestu a BMD bylo pro každé léčivo zkoumáno rozložení rozdílů v MIC při ředění log2 a vypočteno procento stanovení MIC, které poskytlo shodné hodnoty (základní shoda v mezích přesnosti referenční metody ). Rovněž za účelem zjištění, zda metoda Etest poskytla významně nižší nebo vyšší hodnoty MIC než referenční metoda, jsme provedli Wilcoxonův signed-rank test s hodnotami MIC v log2 ředění obou testů pomocí statistického softwaru SAS (SAS Institute Inc., Cary, NC); hodnoty MIC v rozmezí ± 1 log2 ředění byly pro tento test považovány za shodné. Porovnání výsledků interpretačních kategorií (citlivé, středně citlivé a rezistentní) bylo provedeno výpočtem míry menších, větších a velmi velkých chyb.
Všeobecně byly koncové body MIC lépe rozeznatelné pomocí BMD než pomocí Etestu po 24 hodinách (údaje nejsou uvedeny). Na třech testovacích místech (A, B a C) byly téměř všechny MIC BMD a Etestu čitelné po 24 h inkubace; výjimkou byl jediný výsledek Etestu. Na pracovišti D byly zjištěny čitelné MIC BMD za 24 h u všech kmenů kromě jednoho. U osmi kmenů v lokalitě D nebyl zaznamenán dostatečný růst pro stanovení 24hodinových MIC Etestu. Počty MIC Etestu, které nebyly čitelné z důvodu nedostatečného růstu po 24 hodinách podle léčiva, byly následující: pro chloramfenikol n = 6, pro ciprofloxacin n = 4, pro doxycyklin n = 3, pro gentamicin n = 2, pro levofloxacin n = 5, pro streptomycin n = 5, pro tetracyklin n = 4 a pro trimethoprim-sulfametoxazol n = 4. U těchto kmenů byly zjištěny následující hodnoty. Všechna testovací pracoviště byla schopna odečíst všechny výsledky po 48 hodinách, proto byly při srovnání použity výsledky po 48 hodinách. Počty kolonií prokázaly, že hustota inokula v jamkách BMD byla v přijatelných mezích pro všechna čtyři testovací místa; průměry pro místa se pohybovaly od 1,1 × 105 CFU/ml do 4,2 × 105 CFU/ml.
MIK90 a rozsah MIC pro jednotlivé antimikrobiální látky byly porovnány podle metod (tabulka 1). U všech léčiv s výjimkou chloramfenikolu byly hodnoty MIC90 u všech metod stejné nebo v rozmezí ± 1 log2 ředění. Shoda kategorií mezi metodami Etest a BMD byla u všech léčiv vynikající a dosahovala 97 % až 100 %; všechny chyby byly malé (tabulka 1). Všechny MIC BMD a Etestu byly po 24 hodinách inkubace v citlivém rozmezí (údaje nejsou uvedeny). Po 48 h byla většina MIC v citlivém rozmezí s výjimkou následujících necitlivých výsledků: chloramfenikol (n = 2); ciprofloxacin (n = 1) a streptomycin (n = 5). Většina necitlivých výsledků pocházela spíše z metody BMD než z Etestu (obr. 1).
Tabulka 1.
MIC90, rozmezí MIC a shoda interpretačních kategorií pro 48hodinový Etest a 48hodinové bujónové mikrodiluční MIC pro osm antimikrobiálních látek testovaných proti 26 Y. pestis na čtyřech testovacích místech (104 výsledků testů)
| Antimikrobiální látka | BMD MIC (μg/ml) | Etesta MIC (μg/ml) | MIC breakpointb | % kategorie. shoda (% drobných chyb) | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| MIC90 | Range | MIC90 | Range | S | I | R | ||
| Chloramfenikol | 8 | 0.25-16 | 2 | 0,12-4 | ≤8 | 16 | ≥32 | 98 (2) |
| Ciprofloxacin | 0.12 | ≤0.03-0.5 | 0.06 | 0.008-0.12 | ≤0.25 | 99 (1)c | ||
| Doxycyklin | 2 | 0,12-4 | 2 | 0.25-2 | ≤4 | 8 | ≥16 | 100 |
| Gentamicin | 1 | 0,06-4 | 1 | 0.12-1 | ≤4 | 8 | ≥16 | 100 |
| Levofloxacin | ≤0,06 | ≤0,06-0,12 | 0,06 | 0,008-0,12 | ≤0.25 | 100 | ||
| Streptomycin | 4 | 1-8 | 4 | 1-8 | ≤4 | 8 | ≥16 | 97 (3) |
| Tetracyklin | 2 | 0.25-4 | 2 | 0,25-4 | ≤4 | 8 | ≥16 | 100 |
| Trimethoprim-sulfamethoxazoled | 0,06 | ≤0,015-0.25 | 0,03 | 0,008-0,06 | ≤2 | ≥4 | 100 | |
Počty výsledků MIC získaných pomocí 48hodinového Etestu a 48hodinové bujónové mikrodiluce (BMD) pro osm antimikrobiálních látek testovaných proti 26 izolátům Y. pestis na čtyřech testovacích místech (n = 104). Nejnižší ředění testované pomocí BMD je uvedeno u případů, kdy se hodnota lišila od nejnižšího ředění na ose x. Hodnoty MIC trimethoprimu a sulfametoxazolu označují pouze část trimethoprimu.
Dvě metody lze nejlépe porovnat analýzou základní shody (procenta MIC v rozmezí ± 1 log2 ředění pro obě metody ). Zásadní shoda pro všechna místa dohromady (včetně MIC mimo stupnici) byla ≥ 90 % pro ciprofloxacin, doxycyklin, levofloxacin, streptomycin a tetracyklin. Hodnoty základní shody pro gentamicin, trimethoprim-sulfametoxazol a chloramfenikol byly nižší, a to 88 %, 78 % a 35 %. S výjimkou chloramfenikolu a trimethoprim-sulfametoxazolu se základní shoda mezi jednotlivými pracovišti obecně lišila jen málo nebo vůbec (tabulka 3). U chloramfenikolu a trimethoprim-sulfametoxazolu se základní shoda mezi metodami MIC na jednotlivých pracovištích pohybovala v rozmezí od 4 % do 81 %, resp. od 58 % do 96 %.
Tabulka 2.
Srovnání 48hodinového Etestu s 48hodinovou bujónovou mikrodilucí MIC pro osm antimikrobiálních látek testovaných proti 26 izolátům Y. pestis na čtyřech testovacích místech (104 výsledků testů)
| Antimikrobiální látka | Č. výsledků s uvedenými rozdíly v log2 ředění MIC mezi Etestem a referenční metodou BMDa | % zásadní shodyb (% včetně off-)stupnice MIC) | P hodnoceno | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| ≤-3 | -2 | -1 | 0 | +1 | +2 | ≥+3 | |||
| Chloramfenikol | 25 | 43 | 27 | 8 | 1 | 35 | <0.001 | ||
| Ciprofloxacinc | 4 | 6 | 39 | 53 | 2 | 87 (90) | <0.001 | ||
| Doxycyklin | 1 | 14 | 48 | 35 | 6 | 93 | 0.03 | ||
| Gentamicin | 1 | 2 | 18 | 47 | 26 | 5 | 5 | 88 | 0.03 |
| Levofloxacinc | 6 | 98 | 100 (100) | N/Ae | |||||
| Streptomycin | 25 | 72 | 7 | 100 | N/A | ||||
| Tetracyklin | 2 | 26 | 47 | 27 | 2 | 96 | 0.5 | ||
| Trimethoprim-sulfametoxazolc | 3 | 20 | 61 | 20 | 78 (78) | <0.001 | |||
Tabulka 3.
Srovnání základní shody na čtyřech testovacích místech mezi 48hodinovými MIC Etestu a 48hodinovými MIC bujónového mikrodilučního roztoku pro osm antimikrobiálních látek testovaných proti 26 Y. pestis
| Testovací místo (místa) | % esenciální shody | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| CHL | CIP | DOX | GEN | LVX | STR | TET | SXT | |
| A | 4 | 85 | 100 | 81 | 100 | 100 | 100 | 85 |
| B | 4 | 92 | 96 | 77 | 100 | 100 | 100 | 73 |
| C | 81 | 100 | 85 | 96 | 100 | 100 | 92 | 96 |
| D | 50 | 85 | 92 | 96 | 100 | 100 | 92 | 58 |
| Všechny stránky | 35 | 90 | 93 | 88 | 100 | 100 | 96 | 78 |
MIK gentamicinu a doxycyklinu Etest byly významně (P = 0.03) vyšší než odpovídající MIC BMD (tabulka 2), nicméně hodnoty základní shody mezi metodami pro každé léčivo byly stále dobré a činily 88 %, resp. 93 % (tabulka 2). MIC chloramfenikolu, ciprofloxacinu a trimethoprim-sulfametoxazolu Etest byly v průměru významně (P < 0,001) nižší než odpovídající MIC BMD a pouze u ciprofloxacinu byla základní shoda ≥ 90 %. U levofloxacinu, streptomycinu a tetracyklinu nebyly pozorovány žádné statistické rozdíly mezi MIC Etest a BMD.
Při diskové difúzi vytvářely všechny antimikrobiální disky s výjimkou disků se streptomycinem zóny o velkém průměru; některé zóny přesahovaly průměr 40 až 50 mm (tabulka 4) a na destičce MHA se vzájemně překrývaly. Okraje zón u léčiv vytvářejících tyto velké zóny byly často rozmazané nebo nezřetelné. Dva izoláty na jednom testovacím místě měly nečitelné zóny pro všechna léčiva v důsledku slabého růstu po 24 h. Disky s chloramfenikolem a trimethoprim-sulfametoxazolem občas vytvářely efekt dvojité zóny se světlejším vnitřním okrajem růstu, pravděpodobně v důsledku statické aktivity léčiva u tohoto pomalu rostoucího organismu. Disky se streptomycinem vytvářely nejmenší (průměr 23 až 24 mm) průměrnou velikost inhibiční zóny disku a nejzřetelnější, čitelné zóny. Velikost zón ostatních typů disků měla po 48 hodinách průměrně 30 až 42 mm v průměru a jejich průměry byly hůře čitelné.
Tabulka 4.
Výsledky diskové difuze pro testy provedené s použitím Mueller-Hintonova agaru a 26 Y. pestis na dvou místecha
| Antimikrobiální disk (concn ) | Inhibiční zóna diam. (mm) pro uvedenou inkubační dobu (h) | |||
|---|---|---|---|---|
| Rozsah | Avg | |||
| 24 | 48 | 24 | 48 | |
| Chloramfenikol (30) | 28-47 | 25-51 | 39 | 38 |
| Ciprofloxacin (5) | 30-51 | 30-53 | 42 | 42 |
| Doxycyklin (30) | 26-40 | 26-41 | 33 | 33 |
| Gentamicin (10) | 24-36 | 22-42 | 29 | 30 |
| Levofloxacin (5) | 34-48 | 34-50 | 41 | 42 |
| Streptomycin (10) | 17-30 | 18-32 | 23 | 24 |
| Tetracyklin (30) | 27-40 | 26-39 | 32 | 33 |
| Trimetoprim-sulfamethoxazol (1.25-23,75) | 34-50 | 34-49 | 43 | 42 |
Všeobecně byla mezi metodou Etest a referenční metodou BMD pro testování antimikrobiální citlivosti dobrá základní shoda. Míra základní shody mezi metodami Etest a BMD pro chloramfenikol, gentamicin a trimethoprim-sulfametoxazol však byla nižší než minimum 90 %, které doporučuje americký Úřad pro kontrolu potravin a léčiv (FDA) pro použití nové metody v klinickém testování (http://www.fda.gov/downloads/MedicalDevices/DeviceRegulationandGuidance/GuidanceDocuments/ucm071462.pdf).
Rozdílná intenzita osvětlení v kabinetu biologické bezpečnosti na jednotlivých testovacích pracovištích může být faktorem, který přispívá ke stanovení konečného bodu. Zjistili jsme, že odečítání koncové hodnoty Etestu je snazší, když je ve skříni umístěna čtecí lampa, která doplňuje zdroj světla. Všechna pracoviště s výjimkou pracoviště D využila tento dodatečný zdroj světla ke zlepšení čitelnosti testů citlivosti. Etesty tetracyklinu a doxycyklinu, stejně jako etesty chloramfenikolu a trimethoprim-sulfametoxazolu, byly také čteny při 80 % koncovém bodu, ale nebyly patrné žádné dvojité elipsy a základní shoda byla ≥ 90 % pro obě léčiva tetracyklinové třídy, takže se zdá, že tento jev Etestu se u Y. pestis liší podle třídy léčiv.
Pro gentamicin byla celková základní shoda 88 %, což je těsně pod doporučenou hranicí shody 90 %. Dvě místa vykazovala vysokou (96 %) základní shodu, ale u dalších dvou míst byla shoda nižší (77 % a 81 %). Důvod této variability není znám. Celkové rozložení MIC pro Etest a BMD MIC je však podobné (obr. 1). Bylo navrženo, že u nových metod citlivosti, které se provádějí s pomalu rostoucími nebo rychle rostoucími organismy, by se testování nemělo tak přísně držet tohoto standardu a že je přípustná nižší základní shoda (14). Tato logika se zdá být vhodná pro gentamicin Etest, protože základní shoda byla 88 %. Přijatelnost trimethoprim-sulfametoxazol Etestu při 78% základní shodě je nejasná.
Omezením této studie bylo, že nebyly zahrnuty žádné izoláty se známou rezistencí. Přístup k madagaskarským kmenům rezistentním k lékům (3, 9-11) je omezený. Další zprávy o lékové rezistenci u Y. pestis jsou vzácné a rezistentní kmeny nejsou dobře charakterizovány (15, 16, 24). Proto jsme nemohli vyhodnotit schopnost metody Etest odhalit známou rezistenci u Y. pestis.
Disková difuzní metoda se pro Y. pestis nedoporučuje z důvodu obtížného odečítání špatně definovaných inhibičních zón a velkých průměrů zón, které se vyskytují u většiny testovaných léčiv. Diskové testování streptomycinu může být důvodem k dalšímu studiu, pokud budou dostupné izoláty rezistentní vůči streptomycinu, protože velikosti zón byly menší a zřetelnější než zóny získané s jinými disky.
Shrnuto, při porovnání dvou metod MIC pro testování citlivosti Y. pestis výsledky pro všechny antimikrobiální látky dobře korelovaly mezi Etestem a BMD s výjimkou chloramfenikolu a trimethoprim-sulfametoxazolu, pro které bylo obtížné stanovit koncové body pomocí Etestu. U chloramfenikolu a trimethoprim-sulfametoxazolu byla také větší variabilita mezi jednotlivými místy než u ostatních léčiv. Metoda Etest se zdá být přijatelnou alternativou k BMD pro ciprofloxacin, doxycyklin, gentamicin, levofloxacin, streptomycin a tetracyklin, ale ne pro chloramfenikol a trimethoprim-sulfametoxazol. Protože Y. pestis roste na MHA pomalu, doporučuje se pro Etest 48hodinová inkubace. Protože se nám však do naší studie nepodařilo zahrnout žádné kmeny Y. pestis rezistentní k léčivům, doporučuje se také potvrdit necitlivé MIC Etestu referenčním testem BMD MIC. Doporučujeme také provést potvrzující test BMD u všech izolátů Y. pestis s MIC ciprofloxacinu nebo levofloxacinu Etest 0,25 μg/ml, což je MIC na horní hranici citlivého rozmezí, protože není známo, zda lze u těchto dvou léčiv metodou Etest zjistit vznikající rezistenci.
.