Construcción de plásmidos

Cada scFv quimérico anti-HA probado en este estudio se construyó injertando seis bucles CDR de un anticuerpo anti-HA 12CA5 en cada andamio scFv seleccionado. El plásmido \(\chi _{15{mathrm{{F}}11}^{mathrm{{HA}}}}\}) se construyó en dos pasos: (1) un gblock de scFv injertado en el bucle CDR y un vector H4K20me1 mintbody 15F1138 linealizado por sitios de restricción EcoRI se ligaron mediante ensamblaje Gibson (mezcla maestra preparada por House); (2) el enlazador que conectaba el scFv y la EGFP, así como la EGFP, se sustituyó por un gblock que codificaba un enlazador flexible (G4S) × 5 y la mEGFP mediante ensamblaje Gibson a través de sitios de restricción NotI. Para los otros cuatro plásmidos scFv quiméricos, cada gblock de scFv injertado en el bucle CDR se ligó en el vector \(\chi _{15{mathrm{F}}11}^{{mathrm{HA}}}}\}) linealizado por sitios de restricción EcoRI mediante ensamblaje Gibson.

El plásmido objetivo 1 × HA-mCh-H2B se construyó sustituyendo la sfGFP de un plásmido Addgene sfGFP-H2B (plásmido nº 56367) por un gblock de mCherry marcado con el epítopo de 1 × HA en el que se insertó un sitio de restricción NotI entre el epítopo de 1 × HA y el mCherry para la siguiente clonación. El 4 × HA-mCh-H2B se construyó sustituyendo la etiqueta 1 × HA de la construcción 1 × HA-mCh-H2B por un gblock con epítopo 4 × HA a través de los sitios de restricción AgeI y NotI. La 10 × HA-mCh-H2B (smHA-mCh-H2B) se construyó sustituyendo la etiqueta 1 × HA de la construcción 1 × HA-mCh-H2B por la smHA amplificada a partir de un plásmido Addgene smHA-KDM5B-MS2 (plásmido nº 81085) utilizando los cebadores NZ-098 y 099 (todas las secuencias de los cebadores se muestran en la tabla suplementaria 1). El smHA-H2B se construyó sustituyendo el 1 × HA-mCh de la construcción 1 × HA-mCh-H2B por smHA amplificado a partir del plásmido smHA-KDM5B-MS2 utilizando los cebadores NZ-098 y 100.

Se construyó otro plásmido objetivo 4 × HA-mCh-β-actina sustituyendo el H2B del 4 × HA-mCh-H2B por un amplicón de β-actina a través de los sitios de restricción BglII y BamHI. El amplicón de β-actina se amplificó a partir de un plásmido Addgene smFlag-ActinB-MS2 (Plásmido # 81083) utilizando los cebadores NZ-073 y NZ-074.

El plásmido 4 × HA-mRuby-Kv2.1 se generó amplificando primero la etiqueta 4 × HA de 4 × HA-mCh-H2B utilizando los cebadores NZ-105 y 106. A continuación, el amplicón de 4 × HA se introdujo en un plásmido publicado pCMV-mRuby2-Kv2.161 (un regalo del Dr. Michael Tamkun), que había sido linealizado mediante una digestión de restricción con AgeI, utilizando el ensamblaje de Gibson. El plásmido smHA-Kv2.1 se generó mediante la amplificación por PCR de la secuencia codificante de Kv2.1 de rata a partir de pBK-Kv2.140 y su posterior ligadura en los sitios de restricción AsiSI y PmeI del plásmido smHA-KDM5B-MS2 utilizando los cebadores Kv2.1-1 y 2.

El H2B-mCh-1 × HA se construyó mediante dos pasos: (1) sustituir la etiqueta 1 × HA del 1 × HA-mCh-H2B por H2B a través de los sitios AgeI y NotI, en los que el H2B se amplificó a partir del 1 × HA-mCh-H2B utilizando los cebadores NZ-092 y 093; (2) sustituir el H2B en el C-terminal de mCherry por una etiqueta 1 × HA a través de los sitios BglII y BamHI, en los que la etiqueta 1 × HA se sintetizó por PCR superpuesta con los cebadores NZ-094 y 095. El Mito-mCh-1 × HA se construyó sustituyendo el H2B en el H2B-mCh-1 × HA por el gblock23 de Mito a través de los sitios AgeI y NotI. El Mito-mCh-smHA se construyó sustituyendo la etiqueta 1 × HA del Mito-mCh-1 × HA por smHA amplificado a partir del smHA-KDM5B-MS2 utilizando los cebadores NZ-096 y 097. El mCh-H2B se generó sustituyendo la sfGFP del plásmido sfGFP-H2B por un gblock de mCherry utilizando el ensamblaje de Gibson.

Los plásmidos FB-mCh, FB-Halo, FB-SNAP se construyeron sustituyendo la mEGFP del plásmido sfGFP-H2B por un gblock de mCherry, HaloTag y SNAP-tag, respectivamente.

pET23b-FB-GFP, el plásmido para la expresión y purificación de frankenbody recombinante, fue ensamblado por Gibson con un amplicón FB-GFP y un plásmido publicado pET23b-Sso7d62,63 linealizado por sitios de restricción NdeI y NotI. El amplicón de FB-GFP se amplificó a partir de \ {{15{mathrm{{F}}11} por PCR con los cebadores NZ-075 y 077.

Para el ensayo de traducción, la construcción reportera smHA-KDM5B-MS2 y SunTag-kif18b se obtuvieron de Addgene (plásmido # 81085 y # 74928), y el plásmido SunTag scFv (plásmido # 60907) se modificó eliminando el epítopo HA codificado en el enlazador. El epítopo HA se eliminó mediante mutagénesis dirigida al sitio con QuikChange Lightning (Agilent Technologies) siguiendo las instrucciones del fabricante y utilizando los cebadores HAout-1 y 2.

Los bloques g fueron sintetizados por Integrated DNA Technologies y los plásmidos recombinantes fueron verificados en su secuencia por Quintara Biosciences. Las secuencias de los cebadores se muestran en la Tabla Suplementaria 1. Todos los plásmidos utilizados para la traducción de imágenes fueron preparados por el kit NucleoBond Xtra Midi EF (Macherey-Nagel) con una concentración final de aproximadamente 1 mg mL-1.

Cultivo de células U2OS

Las células U2OS (ATCC HTB-96) se cultivaron en una incubadora a 37 °C, humidificada, con un 5% de CO2 en medio DMEM (Thermo Scientific) complementado con un 10% (v/v) de suero bovino fetal (Altas Biologicals), 1 mM de l-glutamina (Gibco) y 1% (v/v) de penicilina-estreptomicina (Gibco o Invitrogen).

Transfección y carga de microesferas

Para el seguimiento de la localización de proteínas, las células se sembraron en una cámara MatTek de 35 mm (MatTek) 2 días antes de la obtención de imágenes y se transfectaron transitoriamente con el reactivo LipofectamineTM LTX con el reactivo PLUS (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante 18-24 h antes de la obtención de imágenes.

Para la traducción de imágenes con ARNm marcado por la proteína MCP-Halo, las células se colocaron en una cámara MatTek de 35 mm (MatTek) el día anterior a la obtención de imágenes. El día de la obtención de imágenes, antes de cargar las cuentas, el medio de la cámara MatTek se cambió a Opti-MEM (Thermo Scientific) con un 10% de suero bovino fetal. Se cargó una mezcla de plásmidos (smHA-KDM5B-MS2/FB) y la proteína MCP-HaloTag purificada17 como se ha descrito previamente6,17,26. Brevemente, después de retirar el Opti-medium de la cámara MatTek, se pipetearon 4 µl de una mezcla de plásmidos (1 µg cada uno) y MCP-HaloTag (130 ng) en PBS sobre las células y se distribuyeron uniformemente por encima perlas de vidrio de ~106 µm (Sigma Aldrich). A continuación, se golpeó firmemente la cámara siete veces y se añadió Opti-medium a las células. 3 h después de la carga de las perlas, las células se tiñeron en 1 mL de 0,2 nM de ligando JF646-HaloTag48 diluido en DMEM completo sin fenol. Tras una incubación de 20 minutos, las células se lavaron tres veces en DMEM completo libre de fenol-rojo para eliminar las perlas de vidrio y los colorantes no ligados. A continuación, las células estaban listas para la obtención de imágenes.

Para la traducción de imágenes sin etiquetado de ARNm, las células chapadas en la cámara MatTek se transfectaron transitoriamente con los plásmidos necesarios, smHA-KDM5B-MS2/FB con o sin SunTag-kif18b/Sun (con el epítopo HA eliminado), utilizando el reactivo LipofectamineTM LTX con el reactivo PLUS (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante el día de la obtención de imágenes. 3 horas después de la transfección, se cambió el medio a DMEM completo sin fenol. Las células estaban listas para la obtención de imágenes.

Purificación de FB-GFP

Las células de E. coli BL21 (DE3) pLysS transformadas con pET23b-FB-GFP se cultivaron a 37 °C hasta una densidad de OD600 0,6 en medio 2xYT que contenía Ampicilina (100 mg L-1) y Cloranfenicol (25 mg L-1) con agitación. Se añadió isopropil-β-d-tiogalactósido (IPTG) para inducir la expresión de proteínas a una concentración final de 0,4 mM, y se bajó la temperatura a 18 °C. Las células se cosecharon tras 16 h por centrifugación y se resuspendieron en tampón PBS suplementado con 300 mM de NaCl, inhibidores de la proteasa (ThermoFisher), 0,2 mM de AEBSF (20 mL L-1 de cultivo) y se lisaron por sonicación. El lisado se aclaró por centrifugación. El sobrenadante se cargó en dos columnas HisTrap HP de 5 mL conectadas (GE Healthcare), se lavó y se eluyó mediante un gradiente lineal de 0-500 mM de imidazol. Las fracciones que contenían la PDI se agruparon, se concentraron utilizando la unidad de filtrado centrífugo Amicon Ultra-15 30 kDa MWCO (EMD Millipore) y se cargaron en una columna HiLoad Superdex 200 PG de exclusión por tamaño (GE healthcare) en un tampón basado en HEPES (25 mM HEPES pH 7,9, 12,5 mM MgCl2, 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 0,01% NP40, 10% glicerol y 1 mM DTT). Las fracciones que contenían la proteína FB-GFP se recogieron, se concentraron y se almacenaron a -80 °C tras su congelación instantánea mediante nitrógeno líquido.

Inmunotinción

Las células U2OS se transfectaron transitoriamente con 4 × HA-mCh-H2B o 4 × HA-mCh-β-actina con el reactivo LipofectamineTM LTX con el reactivo PLUS (Invitrogen). 26 h después de la transfección, las células se fijaron con paraformaldehído al 4% (Electron Microscopy Sciences) durante 10 minutos a temperatura ambiente, se permeabilizaron en Tritón 100 al 1% en PBS, pH 7,4 durante 20 minutos, se bloquearon en Blocking One-P (Nacalai Tesque) durante 20 minutos y se tiñeron a 4 °C durante toda la noche con proteína FB-GFP purificada (0,5 µg mL-1 en tampón de bloqueo al 10%). A la mañana siguiente, se lavaron las células con PBS y se obtuvieron imágenes del PDI con un microscopio confocal de disco giratorio Olympus IX81 (cabezal CSU22) utilizando un objetivo de inmersión en aceite ×100 (NA 1,40) en las siguientes condiciones 488 nm (0,77 mW; medido en el plano focal posterior del objetivo; en el presente documento todas las mediciones de la potencia del láser corresponden al plano focal posterior del objetivo) y 561 nm (0,42 mW) de imágenes secuenciales para 50 puntos de tiempo sin retardo, tasa de giro de 2 × 2, tiempo de exposición de 100 ms. Las imágenes se adquirieron con una cámara CCD Cascade II de Photometrics utilizando el software SlideBook (Intelligent Imaging Innovations). Las imágenes de inmunotinción se generaron promediando imágenes de 50 puntos temporales para cada canal mediante Fiji64.

Las células U2OS se transfectaron transitoriamente con 4 × HA-mCh-H2B o 4 × HA-mCh-β-actina con el reactivo LipofectamineTM LTX con el reactivo PLUS. 10 h después de la transfección, se cosecharon las células y se lisaron en 120 µl de tampón RIPA con el inhibidor de proteasas cOmplete (Roche). Se cargaron 6,5 µl de cada lisado celular en un gel de proteínas NuPAGETM 4-12% Bis-Tris (Invitrogen) y se ejecutó durante 60 min a 100 V y 25 min a 200 V. Las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF (Invitrogen), se bloquearon en tampón de bloqueo (leche en polvo al 5% en TBS-Tween 20 al 0,05%) durante 1 h y se tiñeron durante la noche con la proteína FB-GFP purificada (0,5 µg mL-1 en tampón de bloqueo) o con el anticuerpo parental anti-HA 12CA5 (Sigma-Aldrich Cat #11583816001; dilución de 2000 veces con una concentración final de 0,5 µg mL-1 en tampón de bloqueo). Para el anticuerpo primario 12CA5, se realizó una incubación adicional durante 1 h con anticuerpo anti-ratón/Alexa488 (Thermo Fisher Cat #A11001; dilución de 5000 veces en tampón de bloqueo). La PDI se detectó a partir de la fluorescencia de la GFP en el caso de la FB-GFP o de Alexa 488 en el caso del anticuerpo anti-HA utilizando un Typhoon FLA 9500 (GE Healthcare Life Sciences) con las siguientes condiciones: longitud de onda de excitación 473 nm, filtro LPB (≥510 nm), tubo fotomultiplicador de 300 V y tamaño de píxel de 10 µm. Los western blots sin recortar y sin procesar se suministran en la Fig. Suplementaria 3.

Recuperación de la fluorescencia tras el fotoblanqueo

Para estudiar la afinidad de unión de FB a los epítopos de HA en células vivas, se realizaron experimentos FRAP en células transfectadas transitoriamente con 4 × HA-mCh-H2B (1,25 µg) y FB-GFP (1,25 µg) 24 h antes de FRAP. Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio confocal de disco giratorio Olympus IX81 (cabezal CSU22) acoplado a una unidad de fotomanipulación Phasor (Intelligent Imaging Innovations) con un objetivo de inmersión en aceite ×100 (NA 1,40). Antes del fotoblanqueo, se adquirieron 20 o 10 fotogramas con un intervalo de tiempo de 1 o 5 s. Las imágenes se capturaron utilizando un láser de 488 nm (0,77 mW) con un tiempo de exposición de 100 ms, seguido de un láser de 561 nm (0,42 mW) con un tiempo de exposición de 15 ms. El disco giratorio se configuró a una velocidad de giro de 1 × 1. Después de adquirir las imágenes pre-FRAP, se utilizó el láser de p488 nm (de la unidad Phasor para el fotoblanqueo) a 17 mW con 100 ms de tiempo de exposición, o 4 mW con 500 ms de exposición, para fotoblanquear una región circular del núcleo. Después del fotoblanqueo, se capturaron 30 imágenes sin retardo o con 500 ms de retardo, y luego se adquirieron 100 imágenes con un retardo de 1 s y 100 imágenes con un retardo de 5 s utilizando los mismos ajustes de imagen que las imágenes pre-FRAP. La intensidad fluorescente a través del tiempo del punto fotoblanqueado se exportó utilizando el software Slidebook. La intensidad fluorescente del núcleo y el fondo se obtuvieron con Fiji64 después de corregir el movimiento celular utilizando el plugin StackReg Fiji65. La curva FRAP y el fondo se obtuvieron utilizando easyFRAP-web66, según las instrucciones del sitio web. La figura 4b, d se generó con Mathematica (Wolfram Research).

Purificación de MCP

MCP-HaloTag se purificó mediante cromatografía de afinidad de metales inmovilizados17. Brevemente, el MCP-HaloTag marcado con His se purificó a través de una columna empaquetada de Ni-NTA-agarosa (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante, con pequeñas modificaciones. La E. coli que expresaba la proteína interesada se lisó en un tampón PBS con un conjunto completo de inhibidores de proteasa (Roche) y 10 mM de imidazol. La resina se lavó con un tampón basado en PBS que contenía 20 y 50 mM de imidazol. A continuación, la proteína se eluyó en un tampón PBS con 300 mM de imidazol. La MCP etiquetada en His eluida se dializó en un tampón basado en HEPES (10% de glicerol, 25 mM de HEPES pH 7,9, 12,5 mM de MgCl2, 100 mM de KCl, 0,1 mM de EDTA, 0,01% de detergente NP-40 y 1 mM de DTT), se congeló en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 °C.

Preparación de las células para el seguimiento de la cadena naciente

El plásmido informador smHA-KDM5B-MS2 (plásmido Addgene #81085) y la construcción FB se transfectaron transitoriamente sin la proteína MCP-HaloTag o se cargaron con la proteína MCP-HaloTag en células U2OS chapadas en una cámara MatTek de 35 mm 4-6 h antes de la obtención de imágenes. 3 horas después, si la proteína MCP-HaloTag estaba cargada con la perla, las células se tiñeron con el ligando JF646-HaloTag, y luego se lavaron con medio DMEM completo sin fenol. Si no se necesitaba la proteína MCP-HaloTag, el medio de las células se cambió a medio DMEM completo libre de fenol-rojo 3 h después de la transfección. A continuación, las células estaban listas para la obtención de imágenes.

Para la obtención de imágenes multiplexadas, se transfectaron transitoriamente dos plásmidos informadores, smHA-KDM5B-MS2 y SunTag-kif18b, así como dos sondas, FB-mCh y Sun-GFP (con el epítopo HA eliminado), en células U2OS colocadas en una cámara MatTek 4-6 h antes de la obtención de imágenes. 3 h después, se cambió el medio de las células a un medio DMEM completo sin fenol. Las células estaban entonces listas para la obtención de imágenes.

Condición de obtención de imágenes para los ensayos de traducción y colocalización

Para obtener imágenes de ARNm individuales y su estado de traducción con FB, se utilizó un microscopio de fluorescencia de campo amplio construido a medida y basado en un esquema de iluminación inclinada (HILO)17,67. Brevemente, los haces de excitación, láseres de estado sólido de 488, 561 y 637 nm (Vortran), se acoplaron y enfocaron fuera del eje en el plano focal posterior de la lente del objetivo (APON 60XOTIRF, Olympus). Todas las potencias láser indicadas se midieron en el plano focal posterior del objetivo. Las señales de emisión se dividieron mediante un espejo dicroico ultraplano de calidad de imagen (T660lpxr, Chroma). Las señales de emisión más largas (rojo lejano) después de la división se pasaron por un filtro de paso de banda (FF01-731/137-25, Semrock). Las señales de emisión más cortas (rojo y verde) después de la división se pasaron a través de un filtro de paso de banda para el rojo (FF01-593/46-25, Semrock) o un filtro de paso de banda para el verde (FF01-510/42-25, Semrock) instalado en una rueda de filtros (HS-625 HSFW TTL, Finger Lakes Instrumentation). Las señales de emisión más largas (rojo lejano) y más cortas (rojo y verde) se detectaron con dos cámaras EM-CCD separadas (iXon Ultra 888, Andor) enfocando con un objetivo doble acromático de 300 mm (AC254-300-A-ML, Thorlabs). La combinación de la lente de objetivo ×60 de Olympus, la lente de tubo de 300 mm y la iXon Ultra 888 produce imágenes ×100 con 130 nm de píxel-1. Un incubador con temperatura (37 °C), humedad y 5% de CO2 (Okolab) está equipado con una platina piezoeléctrica (PZU-2150, Applied Scientific Instrumentation) para la obtención de imágenes de células vivas. Los láseres, las cámaras, la platina piezoeléctrica y la rueda de filtros se sincronizaron mediante un microcontrolador de código abierto, la placa Arduino Mega (Arduino). La adquisición de imágenes se realizó mediante el software de código abierto Micro-Manager (1.4.22)68.

El tamaño de la imagen se fijó en el centro 512 × 512 píxeles2 (66,6 × 66,6 µm2), y el tiempo de integración de la cámara se fijó en 53,64 ms. El tiempo de lectura de las cámaras a partir de la combinación de nuestro tamaño de imagen, el modo de lectura (30 MHz) y la velocidad de desplazamiento vertical (1,13 µs) fue de 23,36 ms, lo que dio como resultado nuestra tasa de imagen de 13 Hz (70 ms por imagen). Las señales rojas y verdes se visualizaron alternativamente. La posición del filtro de emisión se cambió durante el tiempo de lectura de la cámara. Para minimizar el sangrado, la señal roja lejana se visualizó simultáneamente con la señal verde. Para capturar todo el grosor de las células, se tomaron imágenes de 13 pilas z con un tamaño de paso de 500 nm (6 µm en total) utilizando la platina piezoeléctrica. Esto dio lugar a nuestra tasa de imagen celular total de 1 Hz para la imagen de cualquiera de las señales de color rojo o verde, y 0,5 Hz para la imagen de ambas señales de color rojo y verde, independientemente de la imagen de color rojo lejano.

Para las Figs. 1c, d, 2a, e, un solo plano de las células fue imaginado de forma continua a 6,5 Hz durante 100 puntos de tiempo y se promedió durante todo el tiempo (láseres: 488 nm, 130 µW; 561 nm, 4 µW (Fig. 1c), 90 µW (Fig. 1d), 19 µW (Fig. 2a), 155 µW (Fig. 2e); 637 nm, 220 µW). Para la Fig. 2b (izquierda), la célula fue fotografiada continuamente a 0,5 Hz, con láseres de 488 nm (100 µW) y 561 nm (10 µW) con 13 z-stacks cada punto de tiempo y promediados a lo largo del tiempo. Las 13 pilas z promediadas adquiridas fueron deconvertidas usando Fiji. Para la Fig. 6b, c, e y f, las células fueron fotografiadas cada 10 s con 13 z-stacks por punto de tiempo (láseres: 488 nm, 13 µW (Fig. 6b), 18 µW (Fig. 6c); 561 nm, 172 µW (Fig. 6f); 637 nm, 150 µW (Fig. 6b, c), 35 µW (Fig. 6e)). Para la Fig. 7b, la célula fue fotografiada de forma continua a 0,5 Hz con 13 pilas z en cada punto de tiempo (láseres: 488 nm, 130 µW; 561 nm, 172 µW). En la Fig. 8b, las células fueron fotografiadas cada 14 s con 13 z-stacks en cada punto de tiempo (láser: 488 nm, 70 µW). Para la Fig. 8c, las células fueron fotografiadas cada 40 s con 13 z-stacks cada punto de tiempo (láser: 488 nm, 130 µW). Para la determinación de la velocidad de los puntos de traslación motorizados (Fig. 8e), las neuronas fueron fotografiadas continuamente a 1 Hz con 13 pilas z cada punto de tiempo.

Para las Fig. 2b (derecha) y 2c, la co-localización fue fotografiada por el microscopio confocal de disco giratorio Olympus IX81 (cabezal CSU22) descrito anteriormente utilizando un objetivo de inmersión en aceite ×100 (NA 1,40) bajo las siguientes condiciones: Imágenes secuenciales a 488 nm (0,77 mW) y 561 nm (0,42 mW) durante cinco puntos temporales sin retardo con múltiples cortes z para cubrir todo el cuerpo celular para cada punto temporal, velocidad de giro 1 × 1, tiempo de exposición ajustado por el brillo celular. Las imágenes se adquirieron con una cámara CCD Cascade II de Photometrics utilizando el software SlideBook (Intelligent Imaging Innovations). Las imágenes mostradas en las figuras se generaron promediando cinco puntos de tiempo y luego se realizó una proyección máxima de todos los cortes z con Fiji64.

Seguimiento de partículas de sitios de traslación

La detección y seguimiento de sitios de traslación individuales se realizó en imágenes de proyección de intensidad máxima con un código personalizado de Mathematica (Wolfram Research)17. Brevemente, las imágenes se procesaron con un filtro de paso de banda para resaltar las partículas, y luego se binarizaron para detectar sus centros de intensidad como posiciones utilizando la rutina incorporada de Mathematica ComponentMeasurements. Las partículas detectadas fueron rastreadas y enlazadas a través del tiempo mediante una búsqueda del vecino más cercano. Las coordenadas precisas (ubicaciones superresueltas) de los ARNm y los sitios de traducción se determinaron ajustando (utilizando la rutina incorporada de Mathematica NonlinearModelFit) las imágenes originales a gaussianos 2D de la siguiente forma:

donde IBG es la fluorescencia de fondo, I la intensidad de la partícula, (x0, y0) la ubicación de la partícula, y (σx, σy) la extensión de la partícula. El desplazamiento entre las dos cámaras se registró utilizando la rutina incorporada de Mathematica FindGeometricTransform para encontrar la función de transformación que mejor alineaba las posiciones ajustadas de las cuentas Tetraspeck de 100 nm de diámetro distribuidas uniformemente a través del campo de visión de la imagen.

Para las Figs. 6c, e, f, 7c, 8b, d, las partículas fueron rastreadas por un código personalizado de Mathematica y trazadas posteriormente con Mathematica. Para la Fig. 7c, se calcularon los desplazamientos medios al cuadrado a partir de las coordenadas ajustadas por Gauss (a partir de imágenes de proyección de intensidad máxima en 2D). La constante de difusión se obtuvo ajustando los primeros cinco puntos de tiempo a una línea con pendiente m = 4D, donde D es el coeficiente de difusión. Los puntos de traslación motorizados individuales (Fig. 8e) fueron rastreados por el plugin Fiji TrackMate69 después de la proyección máxima y trazados posteriormente con Mathematica. Todo el código de Mathematica está disponible bajo petición.

Seguimiento de una sola molécula de proteínas marcadas con 1×HA en células

El día anterior a la obtención de imágenes, las células se colocaron en una cámara MatTek y se transfectaron transitoriamente con 1 × HA-mCh-H2B y FB-Halo utilizando el reactivo LipofectamineTM LTX con el reactivo PLUS (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 3 h después de la transfección, se cambió el medio a DMEM completo. Antes de la obtención de imágenes, las células se tiñeron con borohidruro de sodio (NaBH4) tratado con el ligando Halo TMR (Promega)45 . Brevemente, se redujo 1 µL del colorante Halo ligand TMR de 1 mM durante 10 minutos en 200 µL de una solución de NaBH4 de 50 mM (previamente disuelta en PBS durante 10 minutos, pH 7,4). A continuación, se diluyeron 200 µl de la TMR reducida con 800 µl de DMEM sin fenol para producir 1 mL de medio con TMR reducida. El medio de las células transfectadas se sustituyó por el medio TMR reducido y las células se colocaron en una incubadora (5% de CO2, 37 °C) durante 30 minutos para la tinción. A continuación, las células se lavaron tres veces con DMEM sin fenol. Entre los lavados, las células se incubaron durante 5 minutos en una incubadora (5% de CO2, 37 °C).

Las células se visualizaron utilizando un microscopio de fluorescencia de campo amplio construido a medida y basado en un esquema de iluminación inclinada (HILO)17,67. El campo de visión de las imágenes se fijó en 256 × 256 píxeles2 (33,3 × 33,3 µm2), y el tiempo de integración de la cámara se fijó en 30 ms. Las células se fotografiaron con un láser de 7,7 mW y 561 nm a una velocidad de imagen de 43,8 ms por imagen durante un total de 10.000 puntos de tiempo (7,3 min). Durante la obtención de imágenes, se encendió un láser de 6,2 mW y 405 nm durante 50 ms una vez cada 10 s para fotoactivar el ligando reducido Halo-TMR. Las moléculas individuales se rastrearon utilizando el plugin Fiji TrackMate69. Para asegurar que las pistas representan FB-Halo unido a 1 × HA-mCh-H2B, las pistas se filtraron en Mathematica. El filtro eliminó las pistas de longitud inferior a 16 fotogramas. Además, todos los saltos entre fotogramas debían ser inferiores a 220 nm. Este criterio ha sido utilizado por otros para distinguir los factores de transcripción que están unidos a la cromatina de los que no lo están46. Finalmente, en Mathematica, las pistas se codificaron por colores según el momento en que se adquirieron (como en la Fig. Suplementaria 5) o el tamaño medio de los saltos entre fotogramas (como en la Fig. 5).

Tratamiento con puromicina

Las células U2OS transfectadas transitoriamente con smHA-KDM5B-MS2 y FB o cargadas con smHA-KDM5B-MS2, FB y MCP-HaloTag fueron fotografiadas como se ha indicado anteriormente con intervalos de 10 s entre fotogramas. Después de adquirir 5 o 10 puntos de tiempo como imágenes de pretratamiento, las células se trataron con una concentración final de 0,1 mg mL-1 de puromicina justo antes de adquirir el 6º u 11º punto de tiempo. Después de añadir la puromicina, se tomaron imágenes de las células en las mismas condiciones utilizadas para las imágenes de pretratamiento hasta que desaparecieron las manchas de traslación.

Cultivo y transfección de neuronas

Las neuronas corticales de rata se obtuvieron de las cortezas desechadas de fetos de día embrionario (E)18 que se diseccionaron previamente para obtener el hipocampo, y se congelaron en medio Neurobasal (ThermoFisher Scientific) que contenía un 10% de suero bovino fetal (FBS, Atlas Biologicals) y un 10% de dimetilsulfóxido (Sigma-Aldrich, D8418) en nitrógeno líquido. Las neuronas corticales de rata criopreservadas se sembraron a una densidad de ∼15.000-30.000 células por cm2 en placas MatTek (MatTek) y se cultivaron en medio Neurobasal que contenía 2% de suplemento B27 (ThermoFisher Scientific), 2 mM de l-alanina/l-glutamina y 1% de FBS (Atlas Biologicals). Las transfecciones se realizaron tras 5-7 días de cultivo utilizando Lipofectamine 2000 (ThermoFisher Scientific) según las instrucciones del fabricante. Las neuronas que coexpresaban 4 × HA-mRuby-Kv2.1 y FB-GFP fueron fotografiadas 1-2 días después de la transfección (Fig. 2b). Las neuronas que coexpresan smHA-Kv2.1 y FB-GFP fueron fotografiadas entre 1 y 7 días después de la transfección (Fig. 2 izquierda). Para los ensayos de traducción, las neuronas fueron fotografiadas entre 4 y 12 horas después de la transfección. Todos los experimentos de obtención de imágenes de neuronas se llevaron a cabo en un entorno de temperatura controlada (37 °C), humidificado y con un 5% de CO2 en medio Neurobasal sin rojo fenol (ThermoFisher Scientific). La identidad neuronal se confirmó siguiendo los procesos que emanaban del cuerpo de la célula para obtener imágenes durante cientos de micras para asegurar que eran verdaderas neuritas.

Seguimiento del desarrollo del pez cebra

Todos los experimentos con el pez cebra han sido aprobados por el Comité de Seguridad de Experimentos Genéticos de Tokyo Tech (I2018001) y el manejo de los animales se realiza de acuerdo con las directrices. Para visualizar FB-GFP en el embrión de pez cebra, se prepararon ARNm para FB-GFP y N × HA-mCh-H2B. Se insertaron fragmentos de ADN que codifican FB-GFP y N × HA-mCh-H2B en un plásmido que contenía el promotor T7 y poli A70. Los plásmidos subsiguientes (T7-FB-GFP y T7-N × HA-mCh-H2B) se linealizaron con el sitio de restricción XbaI para la transcripción in vitro utilizando el kit mMESSAGE mMACHINE (ThermoFisher Scientific). El ARN se purificó utilizando el RNeasy Mini Elute Cleanup Kit (QIAGEN) y se resuspendió en agua. Antes de la microinyección, los huevos de pez cebra (AB) se descoronaron sumergiéndolos en 2 mg mL-1 de pronasa (Sigma Aldrich; P5147) en sal marina al 0,03% durante 10 minutos. Se inyectó una mezcla (~0,5 nL) que contenía ARNm (200 pg cada uno para FB-GFP y N × HA-mCh-H2B) en la yema (cerca de la parte celular) de embriones en fase de 1 célula. Para un control negativo, se omitió el ARNm de HA-mCh-H2B. 5-10 minutos después de la inyección de ARNm, se inyectó Fab marcado con Cy5 específico para la acetilación endógena de la histona H3 Lys9 (CMA310)25 (100 pg en ~0,5 nL). Los embriones inyectados se incubaron a 28 °C hasta el estadio de cuatro células y se incrustaron en agarosa al 0,5% (Sigma Aldrich, A0701) en sal marina al 0,03% con el polo del animal hacia abajo en una placa de fondo de cristal de 35 mm (MatTek). Las imágenes de fluorescencia se recogieron utilizando un microscopio confocal (Olympus; FV1000) equipado con una platina calefactada (Tokai Hit) ajustada a 28 °C y un objetivo de inmersión en aceite de silicona UPLSAPO ×30 (NA 1,05), operado por el software incorporado FV1000 FLUOVIEW ver.4.2. Se adquirieron secuencialmente tres imágenes en color cada 5 minutos utilizando láseres de 488, 543 y 633 nm (640 × 640 píxeles; 0,662 µm píxel-1, agujero de alfiler de 800 μm; 2,0 μs píxel-1) sin promediar. Se crearon proyecciones de máxima intensidad a partir de 20 pilas z con 5 μm.

Los núcleos dentro de los embriones de pez cebra se rastrearon en 4D utilizando el plugin Fiji TrackMate69. Los resultados fueron post-procesados y trazados con Mathematica. Para cuantificar el número y el área de los núcleos y el promedio de la intensidad nuclear, citoplásmica y nuclear:citoplásmica a través del tiempo, se midió la intensidad de todos los núcleos en proyecciones de máxima intensidad utilizando la función incorporada de Mathematica ComponentMeasurements. ComponentMeasurements requiere máscaras binarias de los objetos a medir. Se hicieron máscaras binarias de los núcleos utilizando la función incorporada de Mathematica Binarize con un umbral de intensidad apropiado para resaltar sólo los núcleos en las imágenes de Fab etiquetadas con Cy5 (específicas para la acetilación endógena de la histona H3 Lys9). Las máscaras del citoplasma alrededor de cada núcleo se hicieron dilatando las máscaras nucleares en 4 píxeles (usando el comando incorporado Dilation) y luego restando de la máscara dilatada las máscaras nucleares originales dilatadas en 1 píxel. Esto crea máscaras en forma de anillo alrededor de cada núcleo, a partir de las cuales se midió la intensidad citoplasmática media.

Resonancia de plasmón superficial

La cinética de unión del FB purificado al epítopo HA se midió mediante resonancia de plasmón superficial (OpenSPR, Nicoyalife). Después de que el péptido HA marcado con biotina fuera capturado por un chip sensor de estreptavidina (Nicoyalife), se hizo fluir lentamente sobre el chip sensor un FB-GFP purificado diluido en tampón de funcionamiento PBS, pH 7,4, durante 5 minutos para permitir la interacción. A continuación, se dejó fluir el tampón de funcionamiento durante 10 minutos para recoger los datos de disociación. La curva de unión no específica se obtuvo haciendo fluir la misma concentración de FB-GFP en el mismo tampón de funcionamiento sobre un chip sensor de estreptavidina diferente (Nicoyalife). Los datos del control se recogieron exactamente igual que en el experimento. Para 100 y 30 nM de FB-GFP, la respuesta de unión fue significativamente mayor que la del control, con una interacción de unión no específica insignificante. Por lo tanto, elegimos esas dos concentraciones para el ajuste de la cinética de unión. Después de restar el control, se obtuvo la curva de respuesta de la señal frente al tiempo, como se muestra en la Fig. Suplementaria 4. Los parámetros cinéticos de unión se obtuvieron ajustando la curva a un modelo de unión uno a uno utilizando el software TraceDrawer (Nicoyalife) (Fig. Suplementaria 4).

Resumen del informe

Puede obtenerse más información sobre el diseño de la investigación en el resumen del informe de Nature Research vinculado a este artículo.