(a) Las células MCF7 y HepG2 se transfectaron con ARNsi de control o con ARNsi dirigido a DDRGK1 durante 72 h. Las células se tiñeron posteriormente con Annexin V y PI y se sometieron a un análisis de citometría de flujo seguido de la cuantificación de células apoptóticas (Annexin V+). (b) Análisis de Western blot de PARP y caspasa 3 escindida en las células MCF7 y HepG2 descritas en a. (c,d) Análisis de Q-PCR de los niveles relativos de expresión de ARNm de BAX, BAK, NOXA, Bid, DR-5 y Bcl-2 en las células MCF7 y HepG2 descritas en control y DDRGK1. (e,f) Análisis Q-PCR de los niveles relativos de expresión de ARNm de BiP, HSPA8 y CHOP en las células MCF7 y HepG2 de control y de inhabilitación de DDRGK1. Todos los datos se presentan como media±desviación estándar de tres experimentos. *P<0,05, **P<0,01 y ***P<0,001 mediante la prueba t de Student.

(a). Las células HepG2 se transfectaron con ARNsi de control o con ARNsi contra DDRGK1 durante 72 h, y luego las células se trataron con DMSO (control del vehículo) o Tg (2,5 μM) durante 24 h antes de la cosecha. Las células se tiñeron con Annexin V y PI, seguido de un análisis de citometría de flujo. (b). Cuantificación de las células apoptóticas (Annexin V+) en a. (c) Análisis de Western blot de PARP y caspasa-3 escindida en las células HepG2 descritas en a. (d) Las células HepG2 fueron transfectadas con el vector de control o DDRGK1 durante 36 h, y las células fueron tratadas con DMSO o Tg (2,5 μM) durante 24 h antes de la cosecha. Las células se tiñeron con Annexin V y PI, seguido de un análisis de citometría de flujo. (e) Cuantificación de las células apoptóticas (Annexin V+) en d. (f) Análisis de Western blot de PARP y caspasa-3 escindida en las células HepG2 descritas en d. Todos los datos se presentan como media±d de tres experimentos. **Para entender cómo DDRGK1 regula la homeostasis del RE, primero analizamos los cambios en los niveles de proteína de tres sensores de la UPR y sus objetivos posteriores en las células que no tienen DDRGK1. Los resultados mostraron que el knockdown de DDRGK1 en las células MCF7 y HepG2 redujo significativamente los niveles de IRE1α total pero disminuyó débilmente la IRE1α fosforilada (p-IRE1α), lo que puede deberse a los niveles reducidos de IRE1α total (Fig. 3a). Los niveles de ATF6 y de ATF6 escindido no se vieron afectados (Fig. 3a). Curiosamente, el knockdown de DDRGK1 no afectó a los niveles de PERK total, pero los niveles de PERK fosforilada (p-PERK) y BiP aumentaron significativamente (Fig. 3a). A continuación, examinamos los efectos de la depleción de DDRGK1 sobre el sustrato de IRE1α, XBP1. Los resultados mostraron que XBP1s, una forma empalmada de XBP1, se redujo significativamente en las células MCF7 con eliminación de DDRGK1 de forma dependiente del tiempo (Fig. 3b), lo que se correlacionó con los cambios en los niveles de proteína IRE1α (Fig. 2A suplementaria). Además, el agotamiento de DDRGK1 aumentó los niveles de fosforilación de eIF2α (p-eIF2α) y la expresión de CHOP tanto en las células MCF7 como en las HepG2 (Fig. 2B suplementaria). Estos resultados indican que el agotamiento de DDRGK1 reprime la señalización UPR-IRE1α y activa la vía apoptótica UPR-PERK, que en consecuencia desencadena la apoptosis, como se observa en las Figs. 1 y 2. Sin embargo, el nivel de IRE1α aumentó en las células que sobreexpresaban DDRGK1 de forma dependiente de la dosis (Fig. 3c), mientras que los niveles de p-PERK, PERK, ATF6, p-IRE1α, BiP y la forma empalmada de XBP1 no cambiaron significativamente (Fig. 3c; Fig. suplementaria 2C y D). Para explorar la relación funcional entre DDRGK1 y el UPR, evaluamos los cambios dinámicos de IRE1α y PERK en las células MCF7 con DDRGK1-knockdown y en las células de control tras el tratamiento con Tg en diferentes puntos temporales. El tratamiento con Tg aumentó los niveles de IRE1α y p-IRE1α, p-PERK y BiP en las células de control, como se esperaba. Sin embargo, los niveles totales de IRE1α disminuyeron significativamente (0-24 h), mientras que los niveles de p-IRE1α disminuyeron modestamente (4-24 h) en las células empobrecidas en DDRGK1 en comparación con las células control (Fig. 3d). De forma concomitante, el nivel de XBP1s disminuyó en las células empobrecidas en DDRGK1 en comparación con las células de control (4-12 h) (Fig. 3e). Los niveles de PERK total no se modificaron, pero la p-PERK aumentó significativamente en las células empobrecidas en DDRGK1 (0-12 h) (Fig. 3d). Se obtuvieron resultados similares en las células HepG2 (Fig. 2E y F suplementarias). En conjunto, nuestros resultados sugieren que la depleción de DDRGK1 provoca la degradación de IRE1α y la activación de PERK.

(a) Las células MCF7 y HepG2 se transfectaron con ARNsi de control o con ARNsi dirigido a DDRGK1 durante 72 h. Los niveles de proteína de p-IRE1α, IRE1α, p-PERK, PERK, ATF6 y BiP se determinaron mediante western blot. (b) Las células MCF7 se transfectaron con ARNsi de control o ARNsi contra DDRGK1, y las células se cosecharon a los tiempos indicados para el análisis por RT-PCR del empalme de XBP-1. (c) Las células MCF7 y HepG2 se transfectaron con vectores de control o contra DDRGK1 en varias dosis durante 36 h. Los niveles de proteína de p-IRE1α, IRE1α, p-PERK, PERK y ATF6 se determinaron mediante western blot. (d) Las células MCF7 se transfectaron con ARNsi de control o ARNsi dirigido a DDRGK1 durante 72 h. Las células se recogieron para realizar un western blot tras el tratamiento con 2,5 μM de Tg a los tiempos indicados. (e) Análisis por RT-PCR del empalme de XBP-1 en d. *Representa una banda no específica.

DDRGK1 regula el UPR dirigiéndose a IRE1α

El UPR es desencadenado por los sensores de estrés del RE en caso de estrés del RE para regular la homeostasis del RE8. Se ha informado de que la supresión específica de IRE1α en hepatocitos en ratones dio lugar a la activación de la vía UPR-PERK23. Para determinar si la inducción de p-PERK observada en las células con depleción de DDRGK1 estaba mediada por la disminución de los niveles de IRE1α, examinamos los niveles de p-PERK, PERK y sus dianas descendentes en las células con depleción de IRE1α. Los resultados mostraron que la eliminación de IRE1α aumentó significativamente los niveles proteicos de p-PERK y p-eIF2α tanto en las células MCF7 como en las HepG2 (Fig. 4a), de forma similar a los observados en las células sin DDRGK1 (Fig. 3a; Fig. 2B suplementaria). Estos resultados indican que DDRGK1 regula la UPR dirigiéndose a IRE1α. A continuación, investigamos cómo DDRGK1 regula IRE1α. Nuestros resultados mostraron que los niveles de proteína IRE1α, pero no los niveles de ARNm (Fig. Suplementaria 3A), disminuyeron drásticamente en las células inhabilitadas por DDRGK1 (Fig. 3a). El tratamiento de las células con el inhibidor del proteasoma MG132 bloqueó la reducción de la proteína IRE1α mediada por DDRGK1 (Fig. 4b; Fig. 3B suplementaria). Además, observamos que el agotamiento de DDRGK1 redujo drásticamente la vida media de IRE1α en un ensayo de persecución con cicloheximida (Fig. 4c). De acuerdo con estas observaciones, descubrimos que la expresión ectópica de IRE1α mejoraba la supervivencia celular tanto en las células MCF7 como en las HepG2 agotadas por DDRGK1 en comparación con las células de control, caracterizadas por la tinción de Annexin V/PI y la activación de la caspasa-3 (Fig. 4d,e; Fig. Suplementaria 3C y D). En conjunto, estos resultados sugieren que DDRGK1 regula la estabilidad de IRE1α y, por tanto, regula la UPR.

(a). Las células MCF7 y HepG2 se transfectaron con ARNsi de control o con ARNsi dirigido a IRE1α durante 72 h. Los niveles de proteína de p-PERK, PERK, p-eIF2α y eIF2α se determinaron mediante western blot. (b). Análisis de Western blot de IRE1α en las células MCF7 de control y de DDRGK1-knockdown tratadas con o sin MG132 (20 μM, 8 h). (c). Análisis de Western blot de la decadencia de IRE1α en células MCF7 de control y DDRGK1-knockdown tras el tratamiento con 100 μg ml-1 de cicloheximida durante los tiempos indicados. El gráfico representa la cuantificación de los niveles de proteína IRE1α. (d) Las células MCF7 se transfectaron con ARNsi de control o con ARNsi dirigido a DDRGK1 durante 72 h. Antes de la recolección, las células con DDRGK1-knockdown se transfectaron con vectores de control o de IRE1α durante 36 h. Las células se tiñeron posteriormente con Annexin V y PI y se sometieron a un análisis de citometría de flujo, seguido de la cuantificación de las células apoptóticas (Annexin V+). Todos los datos se presentan como media±desviación estándar de tres experimentos. *P<0,05 mediante la prueba t de Student. (e) Análisis de Western blot de IRE1α en células MCF7 en d.

DDRGK1 interactúa con IRE1α

Para entender cómo DDRGK1 regula la estabilidad de IRE1α, probamos si DDRGK1 interactúa con IRE1α mediante un ensayo de inmunoprecipitación recíproca (IP) en células HEK293T. Los resultados mostraron que Flag-IRE1α expresado exógenamente interactuaba específicamente con DDRGK1 y BiP endógenos (Fig. 5a). De forma consistente, Flag-DDRGK1 expresada exógenamente interactuó específicamente con IRE1α endógena y con la conocida proteína C53 asociada a DDRGK1 (ref. 14). Sin embargo, no pudimos detectar BiP en los inmunoprecipitados de Flag-DDRGK1 (Fig. 5b), lo que sugiere que DDRGK1 podría no interactuar directamente con BiP. IRE1α, como sustrato endógeno de la degradación asociada al RE (ERAD), se degrada a través de la asociación entre IRE1α y el complejo Sel1L-Hrd1 ERAD de forma dependiente de BiP24. Por lo tanto, examinamos si la BiP está implicada en la interacción entre DDRGK1 e IRE1α. Los resultados mostraron que la interacción entre DDRGK1 e IRE1α no se vio afectada por el knockdown de BiP (Fig. 4 suplementaria). Para confirmar aún más la interacción de DDRGK1 con IRE1α, realizamos experimentos de tinción de inmunofluorescencia. Los resultados mostraron que estas dos proteínas se co-localizaron en el RE (Fig. 5c). Para mapear la región implicada en la interacción de IRE1α con DDRGK1, co-transfectamos Flag-IRE1α de tipo salvaje y mutantes de truncamiento junto con DDRGK1 en células HEK293T, y los resultados de la IP mostraron que el dominio quinasa citoplasmático de IRE1α era necesario para su interacción con DDRGK1 (Fig. 5d). Para entender los cambios dinámicos en la interacción entre DDRGK1 e IRE1α bajo condiciones de estrés de RE, las células HEK293T fueron transfectadas con Flag-DDRGK1 y tratadas con Tg durante diferentes puntos de tiempo. Como se esperaba, observamos que el total de IRE1α, p-IRE1α y BiP se incrementaron significativamente bajo estrés de RE. Curiosamente, encontramos que DDRGK1 interactuaba específicamente con IRE1α no fosforilada, pero no con p-IRE1α, en los inmunoprecipitados (Fig. 5e). Estos resultados sugieren que DDRGK1 interactúa con IRE1α no fosforilada y mantiene su estabilidad.

(a). Análisis de Western blot de inmunoprecipitados de gel de afinidad de Flag M2 en células HEK293T transfectadas con vectores Flag-Vector o Flag-IRE1α durante 36 h. (b). Análisis de Western blot de los inmunoprecipitados del gel de afinidad de Flag M2 en células HEK293T transfectadas con Flag-Vector o Flag-DDRGK1 durante 36 h. (c). Las células MCF7 se sometieron a una doble inmunotinción con el anticuerpo anti-DDRGK1 (verde) y el anticuerpo anti-IRE1α (rojo). Los núcleos celulares se contratinaron con DAPI (azul). La co-localización entre las dos proteínas endógenas DDRGK1 e IRE1α se muestra en el panel de fusión. Barra de escala, 20 μm. (d) Esquemas de las construcciones de IRE1α de tipo salvaje y truncada y análisis de Western blot de los inmunoprecipitados en gel de afinidad de Flag M2 en células HEK293T transfectadas con Flag-Vector o Flag-IRE1α de tipo salvaje y truncada. (e) Análisis de Western blot de los inmunoprecipitados del gel de afinidad de Flag M2 en células HEK293T tratadas de forma simulada o con Tg (2,5 μM) que expresan Flag-Vector o Flag-DDRGK1.

Se requiere ufm1 para la interacción de DDRGK1 e IRE1α

Un estudio reciente demostró que DDRGK1 es un sustrato de ufmilación y se requiere para la ufmilación de ASC115,20. Para investigar si la ufmilación está implicada en la regulación de la estabilidad de IRE1α por DDRGK1, examinamos si el agotamiento de Ufm1 afecta a la expresión de la proteína IRE1α. De forma similar a la depleción de DDRGK1, observamos que el knockdown de la expresión de Ufm1 redujo drásticamente los niveles de la proteína IRE1α (Fig. 6a), indicando que DDRGK1 regula IRE1α a través de la ufmilación. De forma consistente, encontramos que la sobreexpresión de DDRGK1 no consiguió estabilizar la proteína IRE1α en las células MCF7 con Ufm1-knockdown en comparación con las células control (Fig. 6b). Además, los niveles de la proteína IRE1α disminuyeron drásticamente en las células MCF7 inhabilitadas por Ufm1 tanto en ausencia como en presencia de Tg (Fig. 6c), lo que sugiere que la ufmilación es necesaria para la regulación de la estabilidad de la proteína IRE1α por DDRGK1. A continuación, nos preguntamos si IRE1α está sujeta a la modificación por ufmilación. Para abordar esta cuestión, detectamos la ufmilación de IRE1α en células que expresaban DDRGK1 y Ufm1, así como UBA5 (E1), UFC1 (E2) y UFL1 (E3), como se había descrito anteriormente20. Sin embargo, no pudimos detectar ninguna ufmilación de la proteína IRE1α, aunque la ufmilación de la proteína DDRGK1 fue fácilmente detectable, como se describió previamente (datos no mostrados)15,20,25, lo que sugiere que IRE1α podría no ser un objetivo de la ufmilación. Curiosamente, descubrimos que la asociación entre DDRGK1 e IRE1α disminuía significativamente en las células HEK293T inhabilitadas por Ufm1 en comparación con las células de control (Fig. 6d). En consonancia con esta observación, descubrimos que la interacción de DDRGK1 K267R (un mutante de DDRGK1 deficiente en ufmilación, en el que el residuo de lisina 267 fue sustituido por un residuo de arginina)15 con IRE1α disminuyó drásticamente en comparación con el DDRGK1 de tipo salvaje (Fig. 6e), lo que indica que la ufmilación de DDRGK1 es necesaria para la asociación entre DDRGK1 e IRE1α. Además, DDRGK1 K267R no pudo estabilizar la proteína IRE1α en comparación con DDRGK1 de tipo salvaje (Fig. 6f). En conjunto, estos resultados sugieren que la ufmilación de DDRGK1 en K267 es necesaria para su interacción con IRE1α y la regulación de la estabilidad de la proteína IRE1α.

(a) Las células MCF7 se transfectaron con ARNsi de control o con ARNsi dirigido a Ufm1 durante 72 h. Los niveles de proteína de IRE1α se determinaron mediante western blot. (b) Análisis de Western blot de IRE1α en las células MCF7 de control y de Ufm1-knockdown que expresan vector o DDRGK1. (c) El nivel de proteína de IRE1α se determinó mediante western blot en las células MCF7 de control y de Ufm1-knockdown tras el tratamiento con 2,5 μM de Tg durante los tiempos indicados. (d) Análisis de Western blot de inmunoprecipitados de gel de afinidad Flag M2 en células HEK293T de control y Ufm1-knockdown que expresan Flag-Vector o Flag-DDRGK1. (e) Análisis de Western blot de inmunoprecipitados de gel de afinidad de Flag M2 en células HEK293T transfectadas con Flag-Vector, Flag-DDRGK1 WT o el mutante K267R. (f) Análisis de Western blot de IRE1α en células MCF7 transfectadas con Flag-Vector, Flag-DDRGK1 WT o K267R mutante.

DDRGK1 es necesaria para la capacidad de reconstitución de las HSC en ratones

Un estudio reciente sugirió que las células madre hematopoyéticas (HSC) son extremadamente sensibles al estrés del RE26. Esto nos llevó a especular que DDRGK1 podría ser crítico en la función de las HSC. Primero determinamos el nivel de expresión de DDRGK1 en múltiples linajes hematopoyéticos de ratones de 2 meses de edad de tipo salvaje. La Q-PCR reveló un nivel significativamente más alto de expresión de DDRGK1 en las CEH, incluyendo las CEH de larga duración (CEH-LT), las CEH de corta duración (CEH-CT) y los progenitores multipotentes (PPM) (Fig. 7a). Además, el nivel de proteína de DDRGK1 estaba altamente expresado en las células de médula ósea (BM) enriquecidas con HSC Lineage-c-Kit+ en comparación con las células BM Lineage+c-Kit- (Fig. 7b). Estas observaciones sugieren un importante papel de DDRGK1 en las células madre. Para examinar el papel de DDRGK1 en la función de las HSC, se llevaron a cabo experimentos de trasplante competitivo con HSCs tras el knockdown lentiviral de DDRGK1 (Fig. 7c). Las células Lineage-Sca1+c-Kit+ (LSK) de ratones donantes CD45.1 fueron transducidas con el lentivirus de control o con el de inhabilitación de DDRGK1 y trasplantadas a ratones receptores CD45.2 irradiados letalmente. El análisis de citometría de flujo mostró que el porcentaje de células de la sangre periférica (PB) derivadas del donante se redujo significativamente en el grupo de DDRGK1-knockdown en comparación con el control, lo que indica que el knockdown de DDRGK1 perjudicó significativamente la capacidad de reconstitución competitiva de las HSC (Fig. 7d). Mientras que en un experimento de trasplante no competitivo, los ratones receptores trasplantados con CMHs inhabilitadas por DDRGK1 seguían vivos 3 meses después del trasplante, esto sugiere que la inhabilitación de DDRGK1 simplemente comprometía la capacidad de reconstitución competitiva de las CMHs. Para excluir los efectos fuera del objetivo, diseñamos otro ARNhc dirigido a DDRGK1 y observamos resultados similares (Fig. suplementaria 5A). Tres meses después del trasplante, los ratones receptores fueron eutanasiados para el análisis de la médula ósea y los ensayos de formación de colonias in vitro. Los análisis de citometría de flujo mostraron que el knockdown de DDRGK1 perjudicaba drásticamente el mantenimiento de las CMH transducidas sin afectar a su potencial de linaje (es decir, los linajes mieloide, de células B y de células T), tal y como indicaba la disminución de la frecuencia de las células madre y progenitoras hematopoyéticas derivadas del donante, así como de las células hematopoyéticas diferenciadas en la médula y la médula espinal (Fig. 7e). Un resultado similar se observó en un experimento independiente utilizando otro ARNhc dirigido a DDRGK1 (Fig. 5B suplementaria). Además, aislamos células CD34-Flt3-LSK derivadas de donantes (LT-HSCs) de los ratones receptores y realizamos un ensayo de formación de colonias de una sola célula. Los resultados mostraron que el knockdown de DDRGK1 disminuía la capacidad de las HSC de formar colonias intermedias y grandes (Fig. 7f). En conjunto, estos datos sugieren que DDRGK1 es necesaria para el mantenimiento de la función de las HSC.

(a) Análisis Q-PCR de los niveles de expresión relativa de ARNm de DDRGK1 en las subpoblaciones indicadas de BM de ratones jóvenes de tipo salvaje (2 meses de edad, n=3). La expresión relativa de DDRGK1 se normalizó con respecto a GAPDH. Los datos se presentan como media±s.d. (b) Análisis de Western blot de DDRGK1 en células enriquecidas Lineage+ c-Kit- y Lineage- c-Kit+ de ratones jóvenes de tipo salvaje (2 meses de edad). (c) Esquema experimental del ensayo de reconstitución. (d) Patrón FACS representativo que muestra el porcentaje de células GFP-positivas en las células PB derivadas del donante (sh-Vector) o DDRGK1-knockdown (sh-DDRGK1) (panel izquierdo). Los valores representan los porcentajes normalizados de células GFP+ derivadas del donante en el injerto total (panel derecho, n=3). Los datos se presentan como media±d. **P<0,01 y ***P<0,001 mediante la prueba t de Student. (e) Los valores representan los porcentajes de células GFP+ derivadas del donante en LT-HSC (CD34-Flt3- LSK), ST-HSC (CD34+Flt3- LSK), MPP (CD34+Flt3+ LSK), CMP (CD34+CD16/32-Sca1-c-Kit+Lin-), GMP (CD34+CD16/32+Sca1-c-Kit+Lin-), MEP (CD34- CD16/32-Sca1-c-Kit+Lin-), B, T y poblaciones de células de linaje mieloide en la BM de ratones receptores primarios 12 semanas después del trasplante (n=3). Los datos se presentan como media±d. ***P<0,001 mediante la prueba t de Student. (f) Las CMH-LT derivadas de un solo donante de ratones receptores se clasificaron en placas de 96 pocillos y se cultivaron durante 14 días in vitro. El porcentaje de colonias se calculó dividiendo el número de colonias por el número original de células individuales que se sembraron. Los datos se presentan como media±s.d. **P<0,01 mediante la prueba t de Student.

Para examinar si el deterioro de la función de las CEH se debía a la reducción de la eficiencia de homing, marcamos con colorante fluorescente (violeta) las células LSK transducidas por lentivirales de control o sh-DDRGK1 de ratones de 2 meses de edad, y las inyectamos en receptores irradiados letalmente. El porcentaje de células LSK marcadas presentes en la médula ósea del receptor 18 horas después del trasplante se analizó mediante citometría de flujo. Los resultados mostraron que la capacidad de retorno de las células LSK eliminadas por DDRGK era comparable a la de las células de control (Fig. suplementaria 6A y B). Para determinar si el knockdown de DDRGK1 tenía un efecto sobre el estado del ciclo celular de las células LSK, se tiñeron las células LSK derivadas de donantes y de DDRGK1-knockdown con el marcador de proliferación Ki67 y DAPI y no se encontraron diferencias significativas en los perfiles del ciclo celular entre las HSCs DDRGK1-knockdown y las HSCs de control (Supplementary Fig. 7A). A continuación, examinamos el efecto de la inhabilitación de DDRGK1 en la apoptosis de las CEH mediante la tinción con Annexin V y descubrimos una frecuencia de apoptosis significativamente mayor en las células LSK inhabilitadas por DDRGK1 derivadas del donante en comparación con las células LSK de control; este fenómeno se observó con ambos ARNh dirigidos a DDRGK1 (Fig. 8a; Fig. 7B suplementaria). A continuación, examinamos los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) en las HSC transducidas. Los resultados mostraron que el nivel de ROS era comparable entre los grupos de control y los de DDRGK1-knockdown (Supplementary Fig. 7C). Sobre la base de las observaciones anteriores, concluimos que el knockdown de DDRGK1 en las HSCs indujo la muerte celular apoptótica, perjudicando así la función de las HSCs.

(a) Patrón FACS representativo que muestra el porcentaje de células Annexin V-positivas dentro de las células LSK derivadas del donante y de las células DDRGK1-knockdown después del trasplante (panel izquierdo). El gráfico de barras muestra el porcentaje de células Annexin V-positivas dentro de las células LSK (panel derecho, n=3). Los datos se presentan como media±d. *P<0,05 mediante la prueba t de Student. (b) Análisis Q-PCR de los niveles relativos de expresión de ARNm de DDRGK1, BiP y CHOP en las células LSK derivadas del donante de control y de DDRGK1-knockdown después del trasplante (n=3). Los datos se presentan como media±d. **P<0,01 y ***P<0,001 mediante la prueba t de Student. (c) Análisis de Western blot de p-IRE1α, IRE1α, p-PERK, PERK y ATF6 en células GFP+Lineage-c-Kit+ derivadas de donantes y enriquecidas a partir de ratones receptores de control o de DDRGK1-knockdown. *Representa una banda no específica. (d) Análisis por RT-PCR del empalme de XBP-1 en las células LSK derivadas del donante y de DDRGK1-knockdown después del trasplante. Las células MEF con tratamiento Tg sirvieron como control de empalme de XBP-1.

Para investigar si el deterioro de la función de las CEH se debía a la activación de la respuesta al estrés del RE en las CEH inhabilitadas por DDRGK1, analizamos los niveles de expresión de BiP y CHOP mediante Q-PCR en las CEH injertadas de control y inhabilitadas por DDRGK, los resultados mostraron que los niveles de ARNm de BiP y CHOP estaban significativamente aumentados en las CEH inhabilitadas por DDRGK1 (Fig. 8b). Además, examinamos los niveles de proteína de los sensores de estrés del RE en las células BM de control y de DDRGK-knockdown Lineage-c-Kit+. De acuerdo con lo observado en las líneas celulares de cáncer, el knockdown de DDRGK1 mostró una disminución de los niveles proteicos de IRE1α y p-IRE1α y un aumento del nivel de p-PERK, mientras que los niveles de ATF6 no difirieron en los grupos de control y de knockdown de DDRGK1 (Fig. 8c). De forma consistente, el nivel de XBP1s se redujo en las células LSK derivadas del donante y desactivadas por DDRGK1 (Fig. 8d). En conjunto, estos resultados indican que el knockdown de DDRGK1 perjudicó la señalización de IRE1α pero activó la vía PERK y apoya aún más que DDRGK1 es crítico para el mantenimiento adecuado de la homeostasis del RE y por lo tanto esencial para la supervivencia y el mantenimiento de las HSCs.