Optimización del ensayo ELISpot de IFN-γ tras la estimulación de PBMC con antígenos de CMV activados por T® IE-1 y pp65

Se utilizaron PBMC recién aisladas para el ensayo ELISpot. Para evitar la pérdida de funcionalidad de las células T, por ejemplo debido a la activación de los granulocitos, las muestras de sangre heparinizadas se procesaron sin más aditivos en un plazo de 8 h. Se eligió un número total de 2 × 105 PBMC por pocillo para el desarrollo del protocolo del ensayo ELISpot, ya que este recuento de células está por debajo de la confluencia y normalmente puede obtenerse a partir de muestras de menos de 15 ml de sangre total. La proteína inmediata-temprana IE-1 del CMV y la proteína tardía del tegumento pp65 representan antígenos inmunodominantes de células T bien caracterizados. La IE-1 completa y un fragmento C-terminal de 181 aminoácidos de la pp65 se produjeron y formularon en presencia de urea (T-activation®) para aumentar su capacidad de estimulación de diferentes tipos de células efectoras de la inmunidad mediada por células del CMV. En primer lugar, se determinó la concentración óptima de antígeno T-activated® mediante la realización de experimentos de dosis-respuesta. Las PBMC recién aisladas de un donante sano seropositivo al CMV se estimularon con 31,6 fg/ml a 31,6 μg/ml de T-activated® pp65 o con 0,01 a 31,6 μg/ml de T-activated® IE-1, y el número de células secretoras de IFN-γ se determinó mediante IFN-γ ELISpot. T-activated® pp65 reveló una capacidad mucho mayor para estimular las células efectoras secretoras de IFN-γ que T-activated® IE-1, alcanzando una meseta de respuesta entre 0,316 y 3,16 ng/ml de pp65 frente a aproximadamente 31,6 μg/ml de IE-1 (Fig. 1). En consecuencia, se seleccionaron concentraciones de antígeno T-activado® de 3 μg/ml de pp65 y 15 μg/ml de IE-1 para nuevas estimulaciones de PBMC y ensayos ELISpot.

Se determinó la sensibilidad y especificidad del ensayo estimulando PBMC aisladas de 10 de cada uno de los donantes sanos seropositivos al CMV y seronegativos al CMV con las concentraciones de antígeno T-activado® definidas de pp65 e IE-1. El número de células efectoras reactivas se cuantificó mediante IFN-γ ELISpot. La estimulación significativa se definió mediante una prueba U de Mann-Whitney como una diferencia estadísticamente significativa entre los valores de SFC de las condiciones no estimuladas y las estimuladas con antígeno CMV (cada una de ellas por cuadruplicado). T-activated® pp65 e IE-1 indujeron una activación significativa de las células efectoras receptivas en 10 de 10 y 9 de 10 preparaciones de PBMC de donantes individuales seropositivos al CMV, respectivamente (Fig. 2). En este colectivo, T-activated® pp65 mostró una mayor capacidad global de activar células receptivas con una mediana de 399 SFC/200.000 PBMC (rango 12-864 SFC/200.000 PBMC), en comparación con T-activated® IE-1 con una mediana de 26 SFC/200.000 PBMC (rango 1,3-96 SFC/200.000 PBMC). No obstante, se detectó una respuesta sustancial de hasta 96 SFC/200.000 PBMC en respuesta a T-activated® IE-1 en muestras individuales de donantes seropositivos al CMV (Fig. 2). Las 10 muestras de PBMC (100%) de diferentes donantes seronegativos al CMV mostraron resultados negativos tras la estimulación con pp65 (mediana de 0,3 SFC/200.000 PBMC; rango 0-2,8), mientras que 9 de 10 (90%) muestras de PBMC de individuos seronegativos al CMV fueron negativas tras la estimulación con IE-1 (mediana de 2,9 SFC/200.000 PBMC; rango 0,3-6,8). El recuento de manchas en las PBMC estimuladas con IE-1 por los CMV-seronegativos fue mayor que en las PBMC estimuladas con pp65 por los CMV-seronegativos, pero no superó los 7 SFC/200.000 PBMC (Fig. 2).

Se ha demostrado que el IFN-γ se secreta continuamente durante la estimulación del antígeno. Así, la intensidad de la señal en el IFN-γ ELISpot depende de la duración de la estimulación . La duración de la estimulación del antígeno en el IFN-γ ELISpot reportada en la literatura suele oscilar entre 16 y 24 h . Para abordar la influencia del tiempo de incubación en los resultados de la prueba, se realizaron ELISpot de IFN-γ en PBMC de 3 donantes sanos independientes seropositivos al CMV tras la estimulación con antígenos pp65 e IE-1 activados por T durante 17, 19 y 21 h. No se detectaron diferencias estadísticamente significativas en los números de SFC entre las 3 condiciones (Fig. 3), lo que demuestra la estabilidad de la señal en este rango de tiempo. Por lo tanto, se eligió un tiempo de incubación de 19 h para el ensayo ELISpot optimizado.

Numerosas variables de protocolo pueden afectar a los resultados de la prueba ELISpot. Por ejemplo, el medio utilizado para el cultivo de células primarias a menudo incluye suero que contiene varias moléculas bioactivas no caracterizadas dependientes del lote en diferentes concentraciones . Para definir las condiciones estandarizadas de cultivo celular, se investigó el impacto en el rendimiento del ensayo de diferentes medios que contienen suero (RPMI 1640 complementado con un 5% de FCS, AB humano, NTA sintético o NTS sintético) y de medios sin suero (AIM-V®, UltraCulture). Los medios sin suero produjeron las mejores respuestas de las células efectoras, comparables a las de RPMI 1640 suplementado con un 5% de FCS (Fig. 4a). Además, AIM-V® mostró las señales de fondo más bajas en condiciones no estimuladas (Fig. 4b), maximizando así la relación señal-ruido. En consecuencia, el protocolo ELISpot se estableció además utilizando el medio sin suero AIM-V®.

Los ensayos ELISpot pueden realizarse con varios materiales de membrana, incluyendo nitrocelulosa (NC), éster de celulosa mixta (MCE) y fluoruro de polivinilideno (PVDF). Comparamos los resultados de IFN-γ ELISpot de muestras de PBMC de seis individuos sanos (cuatro réplicas cada una, dos preparaciones por donante) empleando las placas MCE más utilizadas, las placas de PVDF y las tiras de PVDF de Millipore (Merck Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, Alemania). Las membranas de PVDF requieren un paso de activación con etanol antes de la unión del anticuerpo de captura. Además, en las placas de PVDF fueron necesarios pasos de lavado más estrictos antes del desarrollo de las manchas, en comparación con las placas de MCE, para evitar la indeseable tinción de fondo de las membranas. Sin embargo, la resolución de las manchas detectadas en términos de nitidez y homogeneidad mejoró en las membranas de PVDF (no se muestra), lo que dio lugar a un mayor número de manchas en comparación con las membranas de MCE (hasta 10 veces más en el caso de las estimulaciones de IE-1, con una mediana de SFC de 155 frente a 13/200.000 PBMC, respectivamente; Fig. 5). Dado que las tiras de 8 pocillos de PVDF eran más eficaces y que su uso podría permitir reducir los costes, en particular cuando se analizan muestras de un solo paciente en la rutina clínica, se eligió el formato de tiras de 8 pocillos de PVDF para el desarrollo del ensayo optimizado.

El recubrimiento óptimo de las placas de microtitulación con el anticuerpo de captura es crucial para un rendimiento sólido del ensayo. La densidad del anticuerpo de captura de IFN-γ unido a la membrana de PVDF no debe ser limitante y, en particular, debe permitir la detección fiable de un elevado número de manchas. Las tiras de PVDF se recubrieron con concentraciones crecientes (de 2,5 a 7,5 μg/ml) de anticuerpo anti-IFN-γ. Se sembraron PBMC de cinco donantes seropositivos al CMV en los pocillos recubiertos y se dejaron sin estimular o se estimularon con T-activated® IE-1 o pp65. En el rango de 2,5 a 7,5 μg/ml, el aumento de las concentraciones de anticuerpos no tuvo efecto sobre la tinción de fondo en las PBMC no estimuladas (mediana de SFC de 0 a 0,5/200.000 PBMC independientemente de la concentración de anticuerpos de captura de IFN-γ; Figs. 6a-b). Del mismo modo, los niveles de SFC bajos a moderados específicos de IE-1 (medianas de 19 a 26 SFC/200.000 PBMC) fueron comparables en todas las condiciones de revestimiento-anticuerpo (Fig. 6a). Lo mismo ocurrió con las respuestas específicas de pp65 hasta ~300 SFC/200.000 PBMC (donantes d032, d120 y d241; Fig. 6c). Por el contrario, en donantes individuales con recuentos de manchas más elevados (por ejemplo, d172, d202; Fig. 6c), la detección de células reactivas a la pp65 aumentó de forma dependiente de la dosis con la concentración del anticuerpo de captura de IFN-γ utilizado para el recubrimiento, especialmente entre 2,5 y 5 μg/ml de anticuerpo. A concentraciones de anticuerpo de 5 μg/ml y superiores, los recuentos de manchas permanecieron estables (Figs. 6b-c). Basándose en estos resultados, se eligió una concentración de 5 μg/ml de anticuerpo de captura de IFN-γ para el recubrimiento en el protocolo ELISpot optimizado.

Los ensayos ELISpot se basan en la detección de la citocina capturada mediante anticuerpos específicos de citocina, que pueden acoplarse directamente a una enzima informadora (desarrollo del ensayo en un paso), como la fosfatasa alcalina (AP), o una combinación de un anticuerpo secundario biotinilado y una enzima informadora conjugada con estreptavidina (desarrollo del ensayo en dos pasos). El desarrollo del ensayo en un solo paso ahorra tiempo de manipulación y evita errores del operador. Se utilizó mAb conjugado con AP (7-B6-1) (MicroCoat Biotechnologie GmbH, Bernried, Alemania) como conjugado de detección para el protocolo ELISpot estandarizado. Se probaron diferentes parámetros de incubación (por ejemplo, 0,5 – 3 h a 37 °C, 2 h a temperatura ambiente). Los recuentos de manchas fueron comparables en todas las condiciones. Sin embargo, la morfología de las manchas y, por tanto, la detección adecuada fue mejor con la incubación con el conjugado AP durante 2 h a temperatura ambiente, en comparación con otras condiciones (no se muestra). El aumento de la concentración del conjugado de detección de 0,025 a 0,4 U/ml dio lugar a valores medios de SFC ligeramente elevados para pp65, y los recuentos máximos de manchas superaron los generados por el desarrollo del ensayo en dos pasos (no se muestra). Por lo tanto, se eligió un desarrollo de ensayo de un paso durante 2 h a RT con 0,4 U/ml de conjugado de detección.

Por último, se abordó la estandarización de la reacción de tinción SFC para completar la optimización del ensayo. La duración de la incubación con el sustrato AP afecta al tamaño de la mancha y/o al nivel de fondo, por lo que es fundamental para una enumeración fiable de la mancha. Se utilizó un sustrato cromogénico de fosfatasa alcalina NBT/BCIP (Thermo Fischer Scientific, Waltham, EE.UU.) como solución de tinción, y se evaluaron tiempos de incubación que iban de 2 a 13 minutos en la oscuridad. Los recuentos de SFC fueron comparables en todas las condiciones. Sin embargo, los tiempos de incubación más cortos dieron lugar a un menor diámetro de las manchas, mientras que los tiempos de incubación más largos produjeron mayores niveles de fondo (datos no mostrados). Por lo tanto, se definió una duración de la tinción de seis minutos en la oscuridad para el protocolo ELISpot optimizado.

Linealidad y precisión del ensayo ELISpot CMV optimizado

El protocolo ELISpot optimizado se utilizó para determinar el rango de trabajo de PBMC que garantiza la linealidad del ensayo. Se sembraron PBMC de un donante sano seropositivo al CMV a una densidad que oscilaba entre 2 × 104 y 2,5 × 105 PBMC por pocillo. Para números de células entre 6 × 104 y 2 × 105 PBMC por pocillo, los recuentos de ELISpot fueron directamente proporcionales al número de PBMC sembradas, tras la estimulación con IE-1 (análisis de regresión lineal; R2 = 0,97) o pp65 (R2 = 0,99) (Fig. 7a). Debido al recuento de manchas generalmente más bajo resultante de la estimulación con IE-1, se eligió el uso de 2 × 105 PBMC por pocillo para el ensayo ELISpot estandarizado, a fin de garantizar suficientes valores de SFC.

Para verificar aún más la linealidad entre el número de células efectoras reactivas al CMV y la SFC enumerada, se sembraron números crecientes de PBMC de un donante sano CMV-seropositivo y el número total de PBMC se ajustó a 2 x 105 por pocillo utilizando PBMC de un donante CMV-seronegativo. Para estos experimentos se eligieron dos pares de donantes (d034 + d219, d204 + d067) que no mostraron alorreactividad en un cocultivo de 19 horas. Debido a los bajos números de SFC (por debajo de 20 SFC/200.000 PBMC), los resultados de la estimulación con IE-1 mostraron una mayor variabilidad en comparación con la pp65 y no permitieron un cálculo fiable de la linealidad (valores R2 inferiores a 0,96; datos no mostrados). Los resultados del ensayo ELISpot tras la estimulación de la pp65 mostraron una buena correlación lineal para ambos pares de donantes, con valores R2 de 0,99 (d034 + d219) y 0,98 (d204 + d067) en el análisis de regresión lineal (Fig. 7b).

La precisión y la repetibilidad del ensayo optimizado se evaluaron calculando la variabilidad intra-ensayo, inter-ensayo, inter-operador e inter-sitio. En cada caso, las PBMC de tres donantes sanos CMV-seropositivos se analizaron por cuadruplicado, y la variabilidad se evaluó calculando el coeficiente de variación (CV), definido como la relación entre la desviación estándar y la media. No se calculó el CV para los valores de ELISpot < 10 SFC/200.000 PBMC (véase el cálculo del punto de corte de positividad más adelante). El CV intraensayo alcanzó el 14% para la estimulación de IE-1 y el 6% para la estimulación de pp65 (Archivo adicional 1: Tabla S1). El CV inter-ensayo no superó el 17% para IE-1 y el 22% para pp65 (Archivo Adicional 1: Tabla S2). El CV inter-operador fue inferior al 13% y al 18% para IE-1 y pp65 respectivamente (Archivo Adicional 1: Tabla S3). Por último, se evaluó la variación entre centros, que es esencial para la validación del ensayo con fines de diagnóstico. Se recogieron simultáneamente muestras de sangre total de tres donantes sanos CMV-seropositivos y se enviaron (en condiciones constantes a RT) a cuatro laboratorios diferentes en Alemania. Las PBMC se aislaron en fresco y los ensayos ELISpot se realizaron según el protocolo optimizado por un total de 7 operadores. El CV inter-site alcanzó un máximo del 39% para IE-1 y del 28% para pp65 (Archivo Adicional 1: Tabla S4).

Se ha recomendado la evaluación de al menos cuatro mediciones independientes para lograr resultados ELISpot estadísticamente significativos. Para abordar la influencia de las variaciones intrareplicadas en el resultado del ensayo, se compararon los resultados de ELISpot de las mediciones por quintuplicado y cuatriplicado de cada control y estimulación de antígeno. No se encontró ninguna variación significativa de los resultados del ensayo (datos no mostrados). Por lo tanto, las mediciones por cuadruplicado de condiciones no estimuladas y activadas por T® IE-1 y pp65 permiten la fiabilidad del ensayo, así como la viabilidad en combinación con el uso de tiras de 8 pocillos.

La enterotoxina estafilocócica B (SEB) es un potente superantígeno, y la fitohemaglutinina (PHA) un potente mitógeno, ambos inducen la secreción masiva de IFN-γ por las células T . Por lo tanto, la SEB y la PHA son controles positivos adecuados para la viabilidad celular, la estimulación exitosa de la secreción de citoquinas y la funcionalidad general de las células T. Esto es particularmente importante para la interpretación de los resultados cuando se espera una baja frecuencia de células T, por ejemplo en receptores de trasplantes de células madre alogénicas. En el ensayo ELISpot optimizado, las estimulaciones de las muestras de ensayo con SEB o PHA se realizan por duplicado.

Además, se estableció un control del operador independiente de las células efectoras para validar el rendimiento adecuado del ensayo. Este control del operador se basa en la detección de IFN-γ recombinante tras la incubación directa con el anticuerpo de captura antiIFN-γ humano inmovilizado (1-D1K). Este control, también realizado por duplicado, debe producir una tinción oscura homogénea de la membrana de PVDF.

Validación técnica del ensayo: definición de un punto de corte de positividad

Para facilitar la interpretación de los resultados del ensayo IFN-γ ELISpot y para maximizar la especificidad (es decir, evitar falsos positivos dentro de las condiciones no estimuladas y dentro de las condiciones estimuladas en individuos seronegativos al CMV), se definió un punto de corte técnico. Los ensayos ELISpot de IFN-γ se realizaron según el protocolo optimizado en PBMC de 45 donantes sanos, de los cuales 32 eran CMV IgG-seropositivos (Tabla 1).

La mediana y el rango de los valores de SFC de PBMC no estimuladas de individuos CMV-seronegativos y CMV-seropositivos fueron comparables . Los recuentos de puntos en las PBMC estimuladas con IE-1 y pp65 de los sujetos CMV-seropositivos fueron bajos. En los individuos CMV-seropositivos, los niveles de SFC en las PBMC estimuladas con IE-1 y pp65 alcanzaron 1114 y 954 recuentos de puntos/200.000 PBMC (mediana de 22 y 265 respectivamente; Fig. 8). Para la determinación de un punto de corte técnico, se tomaron en consideración los recuentos de puntos en el control no estimulado, así como en condiciones de activación por T® pp65 y estimulación por IE-1 de individuos CMV-seronegativos y CMV-seropositivos. El umbral de positividad se determinó utilizando la estadística z (nivel α = 0,05) sobre los valores de la media geométrica transformados en log10. Los valores = 0 se sustituyeron por valores cercanos al límite de detección, que se asumió como 0,5. La desviación estándar (SD) de las mediciones de ELISpot para el control no estimulado, la estimulación con IE-1 y la estimulación con pp65 fue respectivamente de 0,234, 0,192 y 0,136. Considerando una DE de 0,2 y asumiendo que se miden 4 réplicas para cada control negativo y muestras de prueba, se calculó el criterio de que la relación de las medias geométricas de los valores estimulados y no estimulados es de al menos 2,5. Por otra parte, se generaron perfiles de precisión a partir de los resultados de las pruebas específicas de IE-1 y pp65, en los que se utilizó un coeficiente de variación (CV) no superior al 40% como límite de aceptación de la validez del ensayo para determinar el respectivo límite de cuantificación (LoQ). Los perfiles de precisión para los resultados ELISpot específicos de IE-1 y pp65 de los 45 donantes sanos arrojaron valores de LoQ de 8,6 y 7,1 respectivamente (archivo adicional 2). Cabe destacar que un análisis similar realizado en una cohorte de 124 pacientes en hemodiálisis proporcionó valores de SD comparables dentro de las condiciones no estimuladas y estimuladas por antígeno (rango 0,199-0,240) y arrojó valores de LoQ de 7,8 (IE-1) y 8,3 (pp65) . Sobre la base de estos análisis, se eligió un punto de corte de 10 SFC/200.000 PBMC para definir los resultados positivos de la prueba.

En total, utilizando los antígenos pp65 e IE-1 activados por T y el ensayo ELISpot de IFN-γ optimizado, los resultados de la prueba se consideran positivos si la media geométrica de las manchas resultantes de las estimulaciones de pp65 o IE1 es ≥ 10 SFC/200.000 PBMC y si la relación de las medias geométricas de las condiciones estimuladas y no estimuladas es ≥ 2.5. Según estas definiciones, el colectivo de 45 donantes sanos (32 CMV IgG-seropositivos, 13 CMV IgG-seregativos) reveló una sensibilidad (definida como la concordancia positiva con la CMV IgG-serología, utilizada como procedimiento de medición de referencia primaria) del 97% y una especificidad (concordancia negativa con la CMV IgG-serología) del 85% (Fig. 8).

Validación del ensayo funcional: Los antígenos activados por T estimulan un amplio espectro de células efectoras del CMV clínicamente relevantes

Las proteínas recombinantes (activadas por T®) formuladas con urea son procesadas por las vías de procesamiento y presentación de antígenos exógenos (MHC clase II) y endógenos (MHC clase I) . La estimulación de las PBMC con proteínas T-activated® reproduce, por lo tanto, una infección natural con mayor fidelidad, lo que puede dar lugar a la activación de un amplio espectro de células reactivas al CMV clínicamente relevantes (por ejemplo, células Th, CTL, NK, NKT; ), lo que podría contribuir a la alta sensibilidad del ensayo IFN-γ ELISpot. Para caracterizar aún más las células a las que se dirigen los antígenos IE-1 y pp65 activados por T y para investigar la posible variabilidad interindividual en la respuesta de las células efectoras, se realizaron tinciones de IFN-γ intracelular y análisis de citometría de flujo en paralelo a los ensayos de IFN-γ ELISpot. Se estimularon las PBMC recién aisladas de seis donantes sanos seropositivos al CMV con las proteínas IE-1 y pp65 activadas por T durante 19 horas y se enumeraron las células productoras de IFN-γ según el ensayo ELISpot optimizado. Las mismas preparaciones de PBMC (4 réplicas cada una) se estimularon durante 6 h con el mismo lote de proteínas T-activated® IE-1 y pp65 en presencia de anticuerpos coestimuladores anti-CD28 y anti-CD49d. Los marcadores de superficie (CD3, CD4, CD8, CD56) y la tinción de IFN-γ intracelular se analizaron mediante citometría de flujo, como se describe en la sección de Métodos. Se enumeraron las subpoblaciones IFN-γ+ de linfocitos CD3+CD4+ (Th), CD3+CD8+ (CTL), CD3+CD56+ (NKT-like) y CD3-CD56+ (NK), siguiendo la estrategia de separación ilustrada en el archivo adicional 3. Los seis donantes diferían en su capacidad de provocar una respuesta dependiente de IE-1 y/o pp65 en el ensayo ELISpot de IFN-γ. La intensidad de la respuesta también fue heterogénea entre los seis donantes, con valores que oscilaron entre 7 y 1.054 SFC (estimulación de IE-1) y entre 28 y 780 SFC (estimulación de pp65) por 200.000 PBMC (Fig. 9a). Del mismo modo, los donantes individuales diferían en la frecuencia y proporción de las diversas subpoblaciones celulares investigadas por citometría de flujo (Fig. 9b). Curiosamente, los individuos sanos seropositivos al CMV con recuentos de manchas más bajos (d120, d300, d343; Fig. 9a) también mostraron frecuencias más bajas de linfocitos IFN-γ+ por citometría de flujo (Fig. 9b), destacando la capacidad del ensayo ELISpot para distinguir los respondedores bajos de los altos. La activación de cada subpoblación de linfocitos investigada se detectó en algunos donantes, pero no en todos. Por ejemplo, se detectó una activación entre débil y fuerte de los linfocitos T CD4+ en 4 de los 6 donantes (d120, d172, d300, d343) en respuesta a IE-1, pp65 o a ambos. Del mismo modo, 5 de los 6 donantes (d172, d290, d300, d343, d361) mostraron activación de células T CD8+ en una o ambas condiciones de estimulación. Las CD3-CD56+ (células NK) fueron evidentes en un donante (d120) en respuesta a ambos antígenos. Las células CD3+CD56+ (tipo NKT) se activaron débilmente en 4 de los 6 individuos (d120, d172 d300, d361) en respuesta tanto a IE-1 como a pp65 (Fig. 9b). Sorprendentemente, una fuerte activación CD4+ específica de pp65 en d172 se correlacionó con una fuerte respuesta específica de pp65 en ELISpot, y una fuerte activación CD8+ específica de pp65 (d290) y específica de IE-1 (d361) se asoció con un alto recuento de manchas en el ELISpot correspondiente (Figs. 9a-b), sugiriendo que estas células efectoras reactivas al CMV contribuyen significativamente a las señales detectadas en ELISpot. En conjunto, estos datos demuestran la capacidad de las proteínas IE-1 y pp65 activadas por T para estimular una amplia gama de células efectoras específicas del CMV. Estos experimentos también revelaron la gran heterogeneidad de las respuestas entre los individuos seropositivos al CMV. En particular, la observación de que algunos individuos responden tanto a IE-1 como a pp65 enfatiza la importancia de evaluar la respuesta a ambos antígenos. La monitorización de las respuestas específicas a IE-1 y pp65 en el ensayo ELISpot de IFN-γ optimizado podría mejorar la sensibilidad general de la prueba.

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