Fusión de la unión

Como primer paso para evaluar la aplicabilidad del modelo 3SPN.2 para predecir las propiedades termodinámicas de la unión Holliday, evaluamos las propiedades de fusión de la unión a partir de simulaciones del modelo 3SPN.2 y las comparamos con nuestros experimentos de absorción. Simulamos la fusión de la unión mediante dinámica molecular de intercambio de réplicas (REMD, ver métodos) para mejorar el muestreo de los estados parcialmente fundidos. El muestreo preciso de la fracción relativa de configuraciones de unión intactas, fundidas y parcialmente fundidas no es posible actualmente utilizando una representación de todas las átomos.

La figura 2 muestra la fracción de una sola hebra α en función de T sobre un rango de concentraciones de sal tanto para el modelo 3SPN.2 como para las mediciones de absorción. Véanse los métodos para la definición de α en las simulaciones. La similitud entre las simulaciones y los experimentos es sorprendente. Tanto las simulaciones como los experimentos muestran que la temperatura de fusión aumenta con el incremento de la concentración de sal y que la transición se hace cada vez más brusca, o «cooperativa». Los datos pueden describirse bien mediante la ley de acción de masas, o relación de van’t Hoff46,

Propiedades de fusión de la unión J34.

Comparación de la fracción α de una sola hebra a partir de (a) simulaciones y (b) experimentos. Ajustamos los datos utilizando la ecuación de van’t Hoff (ecuación 1), indicada por las líneas sólidas. Siguiendo la convención, definimos TM como la temperatura a la que α = 0,5.

donde K es la constante de equilibrio para la fusión de la unión, ΔH y ΔS son la diferencia de entalpía y entropía entre la unión fundida e intacta, que se suponen constantes en este rango de temperaturas y C es la concentración total de la hebra (la concentración de cada hebra es C/4). Nótese que ΔS controla la agudeza de la transición de fusión. A continuación discutiremos el comportamiento de ΔH y ΔS, que se determinan a partir de datos de ajuste en el rango 0,1<α<0,9.

La temperatura de fusión TM es una métrica termodinámica útil de la estabilidad de la unión y se define comúnmente como la temperatura a la que α = 1/2. La figura 3 muestra los valores de TM experimentales y simulados en función de la concentración de sal. Tal y como se preveía en las curvas de fusión, las simulaciones reflejan fielmente la dependencia experimental de la TM. La similitud cuantitativa también es notable. Los resultados de la simulación se desplazan sistemáticamente hacia una T más alta entre 5 y 8 K, una diferencia inferior al 3%. Tanto para los experimentos como para las simulaciones, la temperatura de fusión es casi independiente de la concentración de sal para ≥ 200 mM. Esta independencia está relacionada con el cribado de las interacciones electrostáticas a altas concentraciones de sal; en consecuencia, la Fig. 3 también muestra la longitud de cribado de Debye utilizada en el modelo 3SPN.2 para la aproximación de Debye-Hückel de las interacciones electrostáticas. La longitud de cribado es <6 Å a alta concentración de sal, lo que hace que la repulsión electrostática sea insignificante. La correspondencia entre los valores de TM del experimento y la simulación valida el tratamiento aproximado de la electrostática en el modelo 3SPN.2. Dado que el modelo 3SPN.2 sólo se parametrizó para imitar la fusión del ADN-B dúplex, los datos de fusión de la unión sugieren que el modelo 3SPN.2 es transferible a la termodinámica de estructuras de ADN más complejas. Al mismo tiempo, este hallazgo no es del todo imprevisto, ya que la fusión de cada brazo debería ser muy similar a la del ADN dúplex ordinario.

Dependencia de la concentración de sal de la temperatura de fusión de la unión TM.

En todas las concentraciones, la TM difiere en <3% entre las simulaciones 3SPN.2 (círculos verdes) y los experimentos de absorción (diamantes rojos). Las líneas sólo pretenden ser una guía para el ojo. La figura también muestra la longitud de cribado de Debye utilizada por el modelo 3SPN.2 en la aproximación de Debye-Hückel a las interacciones electrostáticas. La meseta de la temperatura de fusión coincide con un fuerte cribado de las interacciones electrostáticas.

El ajuste de los datos mediante la relación de van’t Hoff (ecuación 1) proporciona una estimación de la entalpía y la entropía de fusión. Los valores de ΔH y ΔS de este ajuste son del orden de magnitud correcto que se esperaría basado en los parámetros termodinámicos determinados por SantaLucía y colaboradores47,48. El recuadro de la Fig. 4 muestra que las simulaciones sobrestiman modestamente los valores de ΔH y ΔS, en relación con los experimentos y que ΔH varía casi linealmente con ΔS. Esta relación lineal se denomina a veces relación de «compensación». De hecho, la ecuación de van’t Hoff implica una relación específica entre ΔH y ΔS

Termodinámica de la fusión de uniones.

La entropía ΔS y la entalpía ΔH de fusión obtenidas ajustando los experimentos (diamantes rojos) y las simulaciones (círculos verdes) a la ecuación de van’t Hoff (ecuación 1). El recuadro muestra una relación lineal aproximada de compensación entropía-entalpía. Tanto los datos experimentales como los simulados muestran una mejor concordancia con la ecuación de van’t Hoff evaluada a TM (ecuación 2, línea azul).

que se deduce de la ecuación 1 fijando α = 1/2 a TM. La figura 4 demuestra la coherencia con esta relación y aclara que la compensación lineal entre ΔH y ΔS es sólo aproximada; si los valores de TM variaran más significativamente con la concentración, las desviaciones de la linealidad entre ΔH y ΔS serían más evidentes, mientras que la ec. 2 debería seguir siendo válida. Más importante desde un punto de vista práctico es que estos resultados demuestran la eficacia del modelo 3SPN.2 en la reproducción de las características energéticas y termodinámicas de las uniones que están en estrecha concordancia con los datos experimentales.

Abundancias conformacionales y estructura

Para probar aún más la capacidad del modelo 3SPN.2 para predecir las propiedades experimentales de la unión, examinamos la población relativa de conformaciones de la unión. Experimentalmente, se sabe que la forma planar abierta es predominante a baja concentración de sal, y, a mayor concentración de sal, las uniones adoptan conformaciones apiladas (Fig. 1). A una concentración relativamente alta = 50 mM y T = 298 K, los experimentos indican una abundancia relativa del 23/77% de isoformas apiladas I/II, respectivamente15. Aquí, utilizamos el modelo 3SPN.2 para examinar un amplio rango de concentraciones de sal a T = 300 K para validar el modelo y proporcionar una predicción para la dependencia general de la concentración de sal de las poblaciones de unión. Obsérvese que examinamos el efecto del Na+, en lugar del Mg2+, que produce resultados similares16,45.

Como destacaron Thirumalai y colaboradores26, la correspondencia entre una media temporal y la media del conjunto (ergodicidad) para las uniones de cuatro vías puede romperse a lo largo de escalas de tiempo observacionales bastante grandes, debido a la tasa de conversión entre conformaciones de la unión. Así, para estimar las poblaciones relativas de las conformaciones apiladas, necesitamos un conjunto significativo de simulaciones. En consecuencia, para cada concentración de sal, realizamos 100 simulaciones independientes, cada una de ellas partiendo de la configuración abierta, ya que esta conformación se convierte rápida y aleatoriamente en iso-I o iso-II. Cada simulación se ejecuta durante 2 μs, lo que produce un total de 200 μs de datos de trayectoria para cada concentración de sal, divididos entre 100 muestras independientes. Esto proporciona una estimación inicial de la población relativa de cada conformación. Basándonos en esta estimación, realizamos otras 100 simulaciones utilizando una proporción de configuraciones iniciales abiertas, iso-I o iso-II que se ajustan a la estimación preliminar de la población para ver si nuestros resultados son sensibles a partir del estado abierto. Comprobamos que las estimaciones de la población permanecen estables dentro de nuestra incertidumbre estadística, por lo que no encontramos efectos significativos debidos a empezar en el estado abierto. Nuestros resultados se ven afectados si utilizamos todas las configuraciones iniciales iso-I o todas las configuraciones iso-II, debido a la interconversión relativamente lenta de estos estados.

Para evaluar las poblaciones de la unión, necesitamos identificar una métrica que distinga con precisión entre las tres conformaciones primarias de la unión. Experimentalmente, los estudios de FRET suelen utilizar la distancia entre los extremos de los brazos seleccionados (que define el ángulo interdúplex) para distinguir los estados conformacionales. Inicialmente examinamos el ángulo interdúplex, pero descubrimos (como se discute más adelante) que el IDA fluctúa sustancialmente en cada isoforma, lo que dificulta la distinción inequívoca de las conformaciones. En su lugar, encontramos que las separaciones entre bases cerca del corazón de la unión proporcionan un indicador más fiable de la conformación de la unión. Estas distancias también deberían ser accesibles experimentalmente utilizando un par de análogos de bases de nucleótidos fluorescentes, como la 6-metil isoxantopterina (6-MI) o la 2-aminopurina, colocados juiciosamente cerca del centro de la unión. Los paneles inferiores de la Fig. 1 muestran las ocho bases en el centro de la unión en los conformadores iso-I e iso-II, así como la forma abierta. En el conformador iso-I, la separación dTT de las bases T (en las hebras X y H) y la separación dCC de las bases C (también en las hebras X y H) son mucho menores que las separaciones dAG de las bases A y G (en las hebras B y R); en el conformador iso-II, el apilamiento inverso conduce al comportamiento opuesto de las distancias relativas. En la forma abierta, todas estas distancias son similares, pero mayores que las distancias de los conformadores iso-I y II apilados.

Por lo tanto, deberíamos ser capaces de distinguir entre iso-I y II simplemente basándonos en estas separaciones entre bases. Para confirmar esto, en la Fig. 5 trazamos la distribución de frecuencia normalizada de las distancias inter-base P(dTT ∪ dCC) y P(dAG), que demuestra la presencia de dos picos distintos para todas las concentraciones ≥50 mM. En el caso de P(dAG) (Fig. 5a), el pico con poca separación indica los estados conformadores iso-II y el pico con mayor separación se debe a conformaciones iso-I o abiertas. Para P(dTT ∪ dCC) (Fig. 5b), el pico a pequeñas distancias indica estados iso-I y el pico a mayores distancias se debe a conformaciones iso-II o abiertas. Adoptamos un corte de 12 Å de separación, la ubicación aproximada del mínimo de las distribuciones, para distinguir las uniones como el conformador iso-I apilado o iso-II. Las configuraciones que no se identifican como iso-I ni II se clasifican como conformadores abiertos. En consonancia con la expectativa de que la conformación abierta domina a baja concentración de sal, ninguna de las dos distribuciones tiene un pico para una separación pequeña, por lo que casi todas las configuraciones a baja sal se identifican con la conformación abierta.

Criterio para distinguir las conformaciones de unión.

Distribución de la separación entre bases en el centro de la unión para (a) las bases AG, donde una pequeña separación identifica el conformador iso-II y (b) los pares TT o CC, donde una pequeña separación identifica el conformador iso-I. El pico de mayor distancia a baja concentración de sal se debe a conformaciones abiertas; a mayor sal, surge principalmente de la forma complementaria apilada. La línea vertical de puntos indica el criterio de corte que utilizamos para identificar posteriormente los estados conformacionales de las configuraciones individuales.

Usando estos criterios para distinguir los conformadores, identificamos las configuraciones individuales con uno de los tres isómeros y mostramos series temporales representativas de las conformaciones de unión para cinco simulaciones a = 300 mM en la Fig. 6a. La figura 7a muestra configuraciones representativas de estos conformadores. Los datos de las series temporales muestran cualitativamente que la conformación abierta es de vida extremadamente corta y actúa como un estado de transición entre los conformadores iso-I e iso-II de vida larga. Esto se ha deducido previamente a partir de experimentos con una sola molécula8,15,16,50 y, en este estudio, observamos y confirmamos explícitamente el mecanismo de transición entre los estados conformadores de equilibrio. Demostramos cuantitativamente el papel de la conformación abierta como intermedia evaluando las nueve probabilidades de transición (incluyendo las transiciones a la misma conformación) entre los tres conformadores. La figura 6b muestra que las probabilidades de transición para Iso I→II y II→I son increíblemente pequeñas en la escala de estos gráficos (cero, dentro de la incertidumbre de nuestro cálculo). En consecuencia, el único camino entre los conformadores apilados es a través del conformador abierto, estableciéndolo como el estado de transición. La Figura 6c muestra cómo las probabilidades de transición entre las conformaciones apiladas y abiertas varían con la concentración de sal, dominando las transiciones al estado abierto a bajas concentraciones de sal. Las cinco series temporales de la Fig. 6a también demuestran que la media temporal de los datos varía de una muestra a otra. Está claro que 2 μs es inadecuado para un muestreo ergódico de las abundancias conformacionales y hace necesario nuestro enfoque de utilizar un conjunto de simulaciones. Este enfoque es posible para el modelo de grano grueso, pero está más allá de los recursos computacionales actuales para un modelo de todos los átomos. Esta «ergodicidad rota» es similar al hallazgo experimental de que el muestreo conformacional no es ergódico en grandes escalas de tiempo26. Sin embargo, debemos tener cuidado en señalar que la ergodicidad rota aquí se debe enteramente a la naturaleza estocástica del muestreo conformacional, mientras que en los experimentos de la ref. 26, las variaciones en la unión de los iones a las uniones individuales también juegan un papel.

Variaciones de molécula a molécula en el muestreo conformacional y en las probabilidades de transición conformacional.

(a) Ejemplo de serie temporal de conformaciones de unión para cinco de los 100 miembros del conjunto a = 300 mM. La isoforma abierta es de corta duración y actúa como estado de transición entre iso-I e iso-II. (b) Matriz de las probabilidades de transición desde un estado inicial dado hasta el estado final a = 300 mM. Las probabilidades de transición al mismo estado (elementos diagonales) no se muestran, ya que la tendencia a permanecer en el estado actual domina la escala de otras probabilidades de transición49. Nótese que las probabilidades de transición para iso I→II (y viceversa) son casi nulas. (c) Dependencia de la concentración de sal de las cuatro probabilidades de transición clave.

Conformaciones de unión, abundancia y estructura.

(a) Conformaciones representativas observadas en nuestras simulaciones; sólo se muestra la columna vertebral del ADN, por simplicidad. (b) La abundancia relativa de las isoformas primarias en función de la concentración de sal. Las identidades de las isoformas se definen por las separaciones de bases en el interior de la unión, como se describe en el texto. (c) Ángulo interdúplex (IDA) para cada conformación. Nótese que la conformación planar abierta sólo predomina a baja sal. A mayor sal, la pequeña fracción de conformaciones abiertas muestreadas adoptan (en promedio) una conformación tetraédrica.

Basado en los datos de las series temporales para la conformación de la unión, evaluamos directamente la fracción de configuraciones en las conformaciones abierta, iso-I o iso-II en función de la concentración de sal (Fig. 7b). Como esperábamos, para bajas concentraciones de sal (= 10 mM), observamos esencialmente sólo el estado planar abierto con geometría cuadrada. A todas las concentraciones de sal más altas, se prefieren los conformadores apilados, con una media de ≈58% en iso-II y 36% en iso-I (para ≥200 mM). Nuestras simulaciones predicen que, excepto para concentraciones de sal bastante bajas, la fracción relativa de conformadores no depende significativamente de la sal. El predominio de las conformaciones apiladas a altas concentraciones de sal puede esperarse debido al fuerte cribado de las interacciones electrostáticas, similar a la dependencia de la concentración de sal de la temperatura de fusión. Sin embargo, este cribado no explica el sesgo hacia la conformación iso-II apilada. La diferencia en la población de isómeros debe surgir debido a los efectos de la secuencia de bases cerca del núcleo de unión, como se ha observado experimentalmente16,17. El hecho de que el modelo reproduzca el sesgo conocido experimentalmente hacia la iso-II indica el grado de éxito del modelo de grano grueso en la captura de la estructura dependiente de la secuencia. También encontramos una pequeña fracción, el 6%, de configuraciones de unión en el estado abierto a alta sal. Como se ha comentado anteriormente, estas conformaciones son de corta duración y facilitan las transformaciones entre las conformaciones apiladas. En comparación con los experimentos de Ha y colaboradores15 a concentraciones de sal relativamente altas, el modelo 3SPN.2 infra predice el sesgo hacia la iso-II en aproximadamente un 15%. La diferencia puede deberse en parte a la diferencia en los criterios experimentales y computacionales utilizados para definir las isoformas; en concreto, nosotros examinamos las separaciones de las bases en el interior de la unión, mientras que los experimentos de FRET utilizan etiquetas que son sensibles a la separación de los extremos de los brazos R y X de la unión (efectivamente la IDA). Para las conformaciones tipo H con un centro de unión abierto (observado experimentalmente en presencia de endonucleasas12), estos enfoques alternativos diferirían sistemáticamente en su clasificación (i) basándose en los extremos de la unión, las conformaciones H se clasificarían como iso-I o II; (ii) a la inversa, basándose en la separación en el centro de la unión, las conformaciones H se clasificarían como abiertas, por lo que nuestro criterio siempre arrojará una fracción apilada menor.

Dado que nuestros criterios nos permiten categorizar las conformaciones de las configuraciones individuales de la unión, también podemos evaluar directamente la estructura media de cada una de estas conformaciones. Caracterizamos la estructura de la unión por el ángulo interdúplex (IDA), que definimos por el ángulo formado por los brazos XR y RH con el vértice de la unión51. En consecuencia, el IDA de iso-II debería ser sustancialmente menor que el de iso-I. La figura 7c confirma esta expectativa, ya que el IDA de la iso-II se aproxima a los 90° a altas concentraciones de sal y el IDA de la iso-I se acerca a los 140°. Un valor de 90° para la iso-II es grande comparado con las estimaciones experimentales, que son del orden de 40-60° basadas en mediciones de FRET en equilibrio41,44,45, un punto al que volveremos. También debemos tener claro que 90° para iso-II no implica una configuración plana, lo que es visualmente evidente en las configuraciones representativas mostradas en la Fig. 7a; debido a la estructura tridimensional, incluso una estructura apilada puede adoptar un ángulo cercano a 90°. En las concentraciones de sal más bajas, no podemos estimar el ángulo para las conformaciones apiladas, ya que esencialmente no están muestreadas. A = 10 mM, encontramos que el IDA de la unión abierta es de 95°, lo que concuerda con una unión casi plana, lo que también se aprecia visualmente en la Fig. 7a. A mayores concentraciones de sal, la pequeña fracción de configuraciones abiertas adopta un ángulo algo mayor de ≈105°. Este ángulo mayor es consistente con una configuración casi tetraédrica (Fig. 7a), que quizás debería considerarse distinta de la configuración abierta planar a baja concentración de sal. Así, nuestros resultados sugieren que los estados de transición entre los conformadores apilados son predominantemente conformaciones tetraédricas abiertas, en lugar de planas. Tales intermedios de tipo tetraédrico se han observado previamente en simulaciones23. De hecho, la posibilidad de una multitud de conformaciones de unión se ha inferido a partir del análisis de datos de una sola molécula26.

Comparaciones de estructuras de unión

Como punto final de comparación, consideramos cómo la IDA evaluada a partir del modelo 3SPN.2 se compara con las mediciones experimentales y la estimada a partir de nuestra simulación AMBER de todos los átomos. Las mediciones de FRET han estimado que la IDA de iso-II es de 43 ± 8° a T = 283 K y concentración de sal = 200 mM45. En consecuencia, simulamos tanto el modelo AMBER como el 3SPN.2 en condiciones coincidentes, partiendo de una configuración inicial de iso-II con un IDA de 43° (véase la Fig. 1b). Tanto para el modelo 3SPN.2 como para el AMBER, la unión se abre a una IDA mayor y se asienta en un valor estable después de ≈50 ns (inset Fig. 8). El panel principal de la Fig. 8 muestra los valores de IDA muestreados por cada modelo en el estado estacionario. El modelo 3SPN.2 muestra fluctuaciones más amplias de la IDA que el modelo AMBER, aunque la IDA media es similar en los dos modelos. Cuantitativamente, para AMBER, la IDA media es de 85,3° con una desviación estándar de 12,3°; para 3SPN.2 la IDA media es de 95,7° con una desviación estándar de 24,1°.

Comparación de la estructura de unión entre los modelos de todo átomo y de grano grueso.

La IDA para el modelo de todo átomo AMBER (negro) y el modelo de grano grueso 3SPN.2 de grano grueso (rojo) a T= 283 K y = 200 mM. El panel principal muestra la distribución de los valores IDA muestreados; las líneas sólidas son la frecuencia calculada y las líneas punteadas son una distribución normal con la misma media y desviación estándar que los datos. El recuadro muestra las series temporales originales de cada modelo, a partir de las cuales se determinan las distribuciones. Nótese que para el modelo 3SPN.2, tenemos 2 μs de datos, no todos los cuales se muestran en el recuadro.

Las simulaciones muestran ambas un IDA sustancialmente mayor que el anticipado a partir de las mediciones de FRET y los estudios cristalográficos45,52. Esto puede sugerir que ninguno de los dos modelos proporciona una estimación precisa de la IDA, o que las aproximaciones que deben hacerse para estimar la IDA a partir de los datos de FRET subestiman la IDA. Ciertamente, en los experimentos de FRET a granel la presencia de los colorantes externos, sus enlazadores asociados y su orientación relativa pueden introducir un error considerable en la determinación de la distancia. Las diferencias entre las determinaciones actuales de IDA y las medidas por cristalografía podrían surgir de algunas restricciones de la red cristalina. Al comparar los modelos de todo el átomo y de grano grueso, la casi duplicación de la desviación estándar muestra claramente que los brazos de unión son más flexibles en el modelo de grano grueso. Esto puede deberse en parte a la ausencia de disolvente explícito, ya que el agua solvente en la representación todo-atómica dificulta necesariamente la flexibilidad de los brazos de unión.