TEXT

Yersinia pestis är det etiologiska agenset för pest och kan potentiellt användas som ett biologiskt vapen (1, 13, 17-20, 23). På grund av detta är det viktigt att framväxande läkemedelsresistens, oavsett om den är naturlig eller konstruerad, ska kunna påvisas med hjälp av standardiserade metoder som är lätta att genomföra i flera laboratorier. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) beskriver en referensmetod för mikrodilution av buljong (BMD) för testning av antimikrobiell känslighet hos Y. pestis och ger riktlinjer för tolkning av MIC för åtta antimikrobiella medel (6). BMD använder katjonjusterad Mueller-Hinton-buljong (CAMHB) och kräver inkubering vid 35 °C i 24 timmar med möjlighet till inkubering i 48 timmar när tillväxten vid 24 timmar är otillräcklig för tolkning av slutpunkten. Tyvärr är det svårt att införliva BMD-referensmetoden i många laboratorier eftersom den är relativt kostsam och arbetskrävande och kräver att panelerna förvaras i fryst eller dehydrerat format. Det finns flera alternativa metoder för känslighetstestning, bland annat diskdiffusions- och Etest-metoderna. Innan dessa metoder kan användas för en art måste de dock utvärderas och jämföras med BMD för att fastställa korrelationer mellan de resultat som erhålls genom jämförelser av metoderna.

Y. pestis-isolat är fastidiösa och kan växa långsammare på konstgjorda medier än andra vanliga arter av Enterobacteriaceae, och därför har det varit svårt att standardisera metoder för känslighetstestning för Y. pestis. Flera metoder beskrivs i litteraturen. Diskdiffusionstestning har i allmänhet utförts på Mueller-Hinton-agar (MHA), vanligtvis med 48 timmars inkubation vid 35 °C, men metodbeskrivningarna är ibland bristfälliga i detalj (10, 16, 24). Etest-metoden användes av Wong et al. (25) som använde MHA med 5 % fårblod, inkubation vid 35 °C och ett inokulum som motsvarade en nr. 1 McFarland i stället för den 0,5 McFarland-standard som används i de flesta disk- eller Etest-diffusionsstudier. Agarutspädning med MHA som inkuberats vid 27-30 °C i 48 timmar är den vanligaste metoden i litteraturen (7, 8, 11, 12, 22). Makrodilutions- och mikrodilutionsmetoder i buljong har också använts med olika inkubationstemperaturer (2, 21).

Det finns flera egenskaper hos diskdiffusions- och Etest-metoderna som gör dem till attraktiva alternativa metoder för känslighetsprövning, bl.a. att de är lätta att förvara och att skivorna och remsorna har en lång hållbarhetstid. Dessutom är dessa metoder agarbaserade och slutpunkterna kan vara lättare att avläsa än BMD-metoderna. Etest har den extra fördelen att det ger ett MIC-resultat. I denna rapport presenterar vi resultaten av en multicenterstudie som jämför Etest- och diskdiffusionsmetoder med CLSI:s referens BMD-metod för känslighetstestning av Y. pestis.

(Denna rapport presenterades delvis vid det 107:e allmänna mötet för American Society for Microbiology, Toronto, Kanada, 21-25 maj 2007.)

Tjugosex olika Y. pestis-stammar från samlingarna från Centers for Disease Control and Prevention (CDC) och U.S. Army Medical Research Institute of Infectious Diseases (USAMRIID) testades med både Etest- och BMD-metoderna på fyra testplatser och dessutom med diskdiffusion på två av dessa platser. Sex stammar tillhörde biovar Antiqua, sju biovar Medievalis och tolv biovar Orientalis. Ett atypiskt isolat kunde inte hänföras till någon biovar. De antimikrobiella medlen testades med både BMD och Etest (bioMérieux, Durham, NC), och deras motsvarande intervall var följande för BMD respektive Etest: för kloramfenikol, 0,03-64 μg/ml och 0,016-256 μg/ml; för ciprofloxacin, 0,03-64 μg/ml och 0,002-32 μg/ml; för doxycyklin, 0,03-64 μg/ml och 0,022-32 μg/ml.016-256 μg/ml, för gentamicin 0,03-64 μg/ml och 0,016-256 μg/ml, för levofloxacin 0,06-64 μg/ml och 0,002-32 μg/ml, för streptomycin 0,03-64 μg/ml och 0,03-64 μg/ml och 0,002-32 μg/ml.016-256 μg/ml, för tetracyklin 0,03-64 μg/ml och 0,016-256 μg/ml, och för trimetoprim-sulfametoxazol 0,015/32-16/304 μg/ml och 0,002/0,038-32/608 μg/ml. Eftersom intervallerna för BMD-testning av vissa läkemedel inte omfattade de lägre koncentrationer som kan erhållas med Etest, ansågs den väsentliga överensstämmelsen (± 1 log2-utspädning) mellan metoderna vara utanför skalan för vissa resultatjämförelser (t.ex. en BMD-levofloxacin-MIC på ≤0,06 μg/ml och en Etest-MIC på 0,03 μg/ml). Vid CDC förbereddes MIC-brickor med 96 brunnar med 100 μl CAMHB (BBL, Sparks, MD) per brunn; brickorna förvarades frysta vid -70 °C och skickades till de deltagande laboratorierna. Testerna utfördes enligt CLSI:s standardmetoder för BMD och diskdiffusion (4-6). Inokula framställdes från 18-24 timmars aeroba kulturer som odlats på 5 % fårblodagarplattor (BBL) med hjälp av den direkta kolonisuspensionsmetoden i Mueller-Hinton-buljong (MHB) (Remel, Lenexa, KS) för att motsvara en 0,5 McFarland-standard för turbiditet (4); samma inokula användes för att inokulera MHA-plattor med en diameter på 150 mm för Etest- och skivdiffusionstester. Omedelbart efter inokuleringen utfördes minst två slumpmässiga koloniräkningar på varje testplats med den positiva BMD-tillväxtkontrollbrunnen för att bedöma inokulumstorleken. Högst fyra Etest-remsor applicerades på en platta. För skivdiffusion applicerades kommersiella skivor (BBL) med en självtrampande multidiskdispenser (BBL). BMD-paneler och MHA-plattor för både Etest- och skivdiffusion inkuberades vid 35 °C och avlästes efter 24 och 48 timmar. Etesterna avlästes enligt anvisningarna i Etests bipacksedlar enligt följande: kloramfenikol, doxycyklin, tetracyklin och trimetoprim-sulfametoxazol avlästes vid 80 % hämning för intersektionspunkten; ciprofloxacin, levofloxacin, gentamicin och streptomycin avlästes vid 100 % hämning. För dataanalyser avrundades Etest MIC-värdena uppåt till närmaste log2-spädning. Escherichia coli ATCC 25922 och Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 användes för BMD- och Etest-kvalitetskontroll. MIC för kvalitetskontrollstammar bestämdes genom inkubation i 16-20 timmar. Acceptabla BMD-kvalitetskontrollintervall för streptomycin har tidigare fastställts av CDC (opublicerade uppgifter). Kvalitetskontrollen av Etest för kloramfenikol utfördes genom att testa Escherichia coli ATCC 25922 och tillämpa det acceptabla intervallet för CLSI BMD.

För att mäta överensstämmelsen mellan Etest- och BMD-resultaten undersöktes fördelningen av skillnaderna i log2-utspädnings-MIC:erna och procentandelen MIC-bestämningar som gav identiska värden (väsentlig överensstämmelse inom referensmetodens noggrannhetsgränser ) beräknades för varje läkemedel. För att fastställa om Etest-metoden gav signifikant lägre eller högre MIC-värden än referensmetoden utförde vi också ett Wilcoxon signed-rank-test med log2-utspädnings-MIC-värdena för de två testerna med hjälp av den statistiska programvaran SAS (SAS Institute Inc., Cary, NC); MIC-värden inom ± 1 log2-utspädning betraktades som identiska för detta test. Jämförelse av resultat från tolkningskategorier (mottaglig, intermediär och resistent) gjordes genom att beräkna andelen mindre, större och mycket stora fel.

I allmänhet var MIC-slutpunkterna lättare att urskilja med BMD än med Etest efter 24 timmar (data visas inte). På tre testplatser (A, B och C) kunde nästan alla BMD- och Etest-MIC-värden avläsas efter 24 timmars inkubation; ett enda Etest-resultat var undantaget. Plats D rapporterade läsbara BMD MIC-värden efter 24 timmar för alla stammar utom en. Tillväxten var otillräcklig för att avläsa Etest MIC-värden efter 24 timmar för åtta stammar på plats D. Antalet Etest MIC-värden som var oläsbara på grund av otillräcklig tillväxt efter 24 timmar per läkemedel var följande: för kloramfenikol n = 6, för ciprofloxacin n = 4, för doxycyklin n = 3, för gentamicin n = 2, för levofloxacin n = 5, för streptomycin n = 5, för tetracyklin n = 4 och för trimetoprim-sulfametoxazol n = 4. Alla testplatser kunde avläsa alla resultat efter 48 timmar. Därför användes resultaten efter 48 timmar i jämförelsen. Koloniräkningar visade att inokulumtätheterna i BMD-brunnarna låg inom acceptabla gränser för alla fyra testplatser; medelvärdena för platserna varierade från 1,1 × 105 CFU/ml till 4,2 × 105 CFU/ml.

MIC90 och MIC-intervallet för varje antimikrobiellt medel jämfördes per metod (tabell 1). För alla läkemedel utom kloramfenikol var MIC90 för alla metoderna desamma eller inom ± 1 log2 utspädning av varandra. Kategoriöverensstämmelsen mellan Etest- och BMD-metoderna för alla läkemedel var utmärkt, 97-100 %, och alla fel var små (tabell 1). Alla BMD- och Etest MIC-värden låg inom det mottagliga intervallet efter 24 timmars inkubation (data visas inte). Efter 48 timmar låg de flesta MIC inom det mottagliga området med undantag för följande icke mottagliga resultat: kloramfenikol (n = 2), ciprofloxacin (n = 1) och streptomycin (n = 5). De flesta av de icke mottagliga resultaten kom från BMD-metoden snarare än Etest (fig. 1).

MIKO:n för gentamicin och doxycyklin Etest var signifikant (P = 0.03) högre än motsvarande BMD MIC (tabell 2); värdena för väsentlig överensstämmelse mellan metoderna för varje läkemedel var dock fortfarande goda med 88 % respektive 93 % (tabell 2). Kloramfenikol, ciprofloxacin och trimetoprim-sulfametoxazol Etest MICs var i genomsnitt signifikant (P < 0,001) lägre än motsvarande BMD MICs, och endast ciprofloxacin hade en väsentlig överensstämmelse på ≥90 %. För levofloxacin, streptomycin och tetracyklin sågs inga statistiska skillnader mellan Etest- och BMD-MIC.

För skivdiffusion producerade alla antimikrobiella skivor utom streptomycinskivorna zoner med stor diameter; vissa zoner översteg 40 till 50 mm i diameter (tabell 4) och överlappade varandra på MHA-plattan. Zongränserna för de läkemedel som producerade dessa stora zoner var ofta suddiga eller otydliga. Två isolat på en testplats hade oläsbara zoner för alla läkemedel på grund av dålig tillväxt efter 24 timmar. Kloramfenikol- och trimetoprim-sulfametoxazolskivor gav ibland upphov till en dubbelzons-effekt med en ljusare inre tillväxtmarginal, möjligen på grund av läkemedlets statiska aktivitet med denna långsamt växande organism. Streptomycinskivorna gav den lägsta (23-24 mm i diameter) genomsnittliga hämmande zonen i skivan och de mest distinkta, läsbara zonerna. Zonstorlekarna för de andra skivtyperna var i genomsnitt 30 till 42 mm i diameter vid 48 timmar, och deras diametrar var svårare att avläsa.

I allmänhet fanns det en god väsentlig överensstämmelse mellan Etest-metoden och BMD-referensmetoden för testning av antimikrobiell känslighet. Den väsentliga överensstämmelsen mellan Etest och BMD för kloramfenikol, gentamicin och trimetoprim-sulfametoxazol var dock lägre än de 90 % minimum som rekommenderas av den amerikanska livsmedels- och läkemedelsmyndigheten (FDA) för användning av en ny metod i klinisk testning (http://www.fda.gov/downloads/MedicalDevices/DeviceRegulationandGuidance/GuidanceDocuments/ucm071462.pdf).

Differenser i belysningsintensitet i det biologiska säkerhetsskåpet på varje testplats kan vara en bidragande faktor för bestämning av slutpunkt. Vi har funnit att det är lättare att läsa av en Etestslutpunkt när en läslampa är placerad i skåpet för att komplettera ljuskällan. Alla platser utom plats D använde denna extra ljuskälla för att förbättra läsbarheten av känslighetstesterna. Tetracyklin- och doxycyklin Etest, liksom de för kloramfenikol och trimetoprim-sulfametoxazol, lästes också vid en 80-procentig slutpunkt, men inga dubbla ellipser märktes och den väsentliga överensstämmelsen var ≥90 % för båda läkemedlen i tetracyklinklassen, så det verkar som om detta Etest-fenomen varierar beroende på läkemedelsklass för Y. pestis.

För gentamicin var den övergripande väsentliga överensstämmelsen 88 %, vilket är strax under den rekommenderade gränsen för 90 % överensstämmelse. Två platser uppvisade hög (96 %) väsentlig överensstämmelse, men överensstämmelsen var lägre (77 % och 81 %) för de andra två platserna. Orsaken till denna variation är okänd. De övergripande MIC-fördelningarna för Etest och BMD MIC är dock likartade (fig. 1). Det har föreslagits att för nya känslighetsmetoder som utförs med långsamt växande eller kräsna organismer bör testerna inte vara lika strängt hållna till denna standard och att en lägre väsentlig överensstämmelse är tillåten (14). Denna logik förefaller lämplig för gentamicin Etest, eftersom den väsentliga överensstämmelsen var 88 %. Acceptabiliteten av trimetoprim-sulfametoxazol Etest med 78 % väsentlig överensstämmelse är oklar.

En begränsning i denna studie var att inga isolat med känd resistens ingick. Tillgången till Madagaskars läkemedelsresistenta stammar (3, 9-11) är begränsad. Andra rapporter om läkemedelsresistens hos Y. pestis är sällsynta och resistenta stammar är inte väl karakteriserade (15, 16, 24). Därför kunde vi inte utvärdera Etest-metodens förmåga att upptäcka känd resistens hos Y. pestis.

Diskdiffusionsmetoden rekommenderas inte för Y. pestis på grund av svårigheten att avläsa de dåligt definierade hämmande zoner och stora zondiametrar som förekommer med de flesta av de testade läkemedlen. Streptomycin diskdistanstestning kan motivera ytterligare studier om streptomycinresistenta isolat blir tillgängliga, eftersom zonstorlekarna var mindre och mer distinkta än de som erhölls med andra diskar.

Sammanfattningsvis, i en jämförelse av två MIC-metoder för Y. pestis känslighetstestning, korrelerade resultaten för alla antimikrobiella medel väl mellan Etest och BMD utom för kloramfenikol och trimetoprim-sulfametoxazol, för vilka slutpunkterna var svåra att bestämma med Etest. Det fanns också större variabilitet från plats till plats för kloramfenikol och trimetoprim-sulfametoxazol än för de andra läkemedlen. Etest-metoden verkar vara ett godtagbart alternativ till BMD för ciprofloxacin, doxycyklin, gentamicin, levofloxacin, streptomycin och tetracyklin men inte för kloramfenikol och trimetoprim-sulfametoxazol. Eftersom Y. pestis växer långsamt på MHA rekommenderas 48 timmars inkubation för Etest. Eftersom vi inte kunde inkludera några läkemedelsresistenta Y. pestis-stammar i vår studie rekommenderas dock också att icke-mottagbara MIC-värden för Etest bekräftas med ett referens BMD MIC-test. Vi rekommenderar också att bekräftande BMD-test utförs på alla Y. pestis-isolat med ett Etest MIC-värde för ciprofloxacin eller levofloxacin på 0,25 μg/ml, ett MIC-värde i den övre delen av det mottagliga intervallet, eftersom det är okänt om ny resistens kan detekteras för dessa två läkemedel med Etest-metoden.