Abstract

Framstegen med sekvensering av det mänskliga genomet driver genetiska metoder för att definiera genernas funktion. Strategier som genfällor och kemisk mutagenes kommer snart att generera en stor resurs av muterade möss. Punktmutationer inducerade av N -etyl- N -nitrosourea (ENU) utgör en unik mutantresurs eftersom de: (I) återspeglar konsekvenserna av en enskild genförändring oberoende av positionseffekter, ii) ger en finstrukturell dissektion av proteinfunktionen, iii) uppvisar en rad olika mutanteffekter, från fullständig eller partiell funktionsförlust till överdriven funktion, och iv) upptäcker genfunktioner på ett opartiskt sätt. Fenotypdrivna ENU-undersökningar i musen betonar relevansen för kliniska sjukdomar hos människor genom att rikta in sig på kardiologi, fysiologi, neurologi, immunitet, hematopoesi och däggdjursutveckling. Sådana metoder är extremt kraftfulla när det gäller att förstå komplexa mänskliga sjukdomar och egenskaper: basparförändringarna kan exakt modellera basförändringar som finns i mänskliga sjukdomar, och subtila muterade alleler i en genetisk standardbakgrund ger möjlighet att analysera konsekvenserna av sammansatta genotyper. Pågående mutationsexperiment med ENU-mutationer på möss genererar en skattkammare av nya mutationer som gör det möjligt att göra djupgående studier av en enskild gen, ett kromosomalt område eller ett biologiskt system.

Introduktion

De manipulativa genetiska verktygen hos musen är omfattande och kraftfulla. Musgenetiker kan eliminera eller överuttrycka gener i hela djuret eller i en specifik vävnad, införa stora bitar av eget eller främmande DNA i genomet och konstruera hela kromosomer. Dessa tekniker, i kombination med de genetiska, utvecklingsmässiga, patologiska och fysiologiska likheterna mellan mus och människa, har gjort laboratoriemusen till en viktig modellorganism för forskning om sjukdomar hos människor. Inavlade musstammar ger möjlighet att studera ett sjukdomsdrag i en definierad genetisk bakgrund, vilket gör det möjligt att särskilja de fenotyper som orsakas av en enskild mutation från bidragen från andra genetiska modifierare.

Förmågan att skapa funktionsförlustmutationer genom homolog rekombination i embryonala stamceller var banbrytande för en revolution inom musbiologin. Med hjälp av tekniken för embryonala stamceller kan alla gener som är inblandade i sjukdomar hos människor störas, vilket ger värdefull information om konsekvenserna av mutationer i hela djuret. Även om nollmutationer är nödvändiga är subtila mutationer som framkallas av N -etyl-N -nitrosouré (ENU) ovärderliga för att undersöka hela skalan av genernas funktion. Mutationer i kodande regioner och reglerande element kan ge mycket olika fenotyper samtidigt som de ger en finstrukturell dissektion av proteinfunktion och genreglering. Serier av alleler kan genereras genom homolog rekombination, men fenotypdriven mutagenes ger många fördelar när det gäller snabbhet i genereringen och undanröjande av forskarens bias. Därför bör en knockout-databas för musens genom endast betraktas som en utgångspunkt; ytterligare alleler och vävnadsspecifika egenskaper är obligatoriska för att slutföra den funktionella analysen.

Mutagenisering av musens arvsmassa

ENU kan överföra sin etylgrupp till syre- eller kväveradikaler i DNA, vilket leder till felparning och basparsubstitution om det inte repareras. De högsta mutationsfrekvenserna uppträder i premeiotiska spermatogoniala stamceller, med enstaka locus-mutationsfrekvenser på 6–1,5 × 10 -3 ( 1-3 ), vilket motsvarar en mutation i en enskild valfri gen i en av 175-655 undersökta könsceller. På grund av dess förmåga att isolera mutationer i vilken gen eller region som helst av intresse har ENU använts hos musen för att: (i) erhålla multialleliska serier av enskilda gener för att ytterligare definiera funktionen, (ii) dissekera biokemiska eller utvecklingsvägar, (iii) erhålla nya recessiva mutationer på en enskild kromosom eller i hela genomet, och (iv) mätta regioner av musens genom som inte täcks av deletioner ( 4-10 ). Analysen av 62 sekvenserade germina mutationer från 24 gener visar att ENU huvudsakligen modifierar A/T-baspar, med 44 % A/T→T/A-transversioner, 38 % A/T→G/C-övergångar, 8 % G/C →A/T-övergångar, 3 % G/C→C/G-transversioner, 5 % A/T→C/G-övergångar och 2 % G/C→T/A-övergångar ( tabell 1 ; fig. 1 ). När de översätts till en proteinprodukt resulterar dessa förändringar i 64 % missense-mutationer, 10 % nonsense-mutationer och 26 % splicingfel ( tabell 1 ; fig. 1 ).

Eftersom ENU är en punktmutagen kan det framkalla många olika typer av alleler. Funktionsförlustmutationer, livskraftiga hypomorfer av dödliga komplementationsgrupper, antimorfer och funktionsförstärkande mutationer har isolerats i mutagenesiscreening av möss ( 4 , 9-16 ). Serier av alleler på enskilda loci är extremt kraftfulla när de analyseras tillsammans för att definiera funktionen. Alleliska serier vid komplexa loci kan störa enskilda proteinisoformer, vilket leder till upptäckten av olika funktioner i olika vävnader under en organisms hela livstid ( 17 ). Ett slående exempel på en sådan allelisk serie är locus quaking ( qk ). Innan de ENU-inducerade allelerna isolerades definierades quaking locus av en enda spontan allel, qkV , med en homozygot fenotyp med anfall och quaking orsakad av allvarlig dysmyelinisering i centrala nervsystemet (CNS) ( 18 ). De ENU-inducerade allelerna visar emellertid att quaking även fungerar under embryogenesen ( 7 , 13 ). Homozygoter av fyra av fem ENU-inducerade alleler ( qk1-1 , qkkt1 , qkk2 , qkkt3/4 ) dör vid embryonala dagar (E) 8,5-10,5 med CNS-defekter, medan endast en är livskraftig med kväkningar och kramper ( qke5 ) (19; J.K. Noveroske och M.J. Justice, opublicerade data). Även om quaking-allelerna kan grupperas utifrån embryoletalitet eller livskraftig dysmyelinisering, avviker varje allel på något betydande sätt från dessa allmänna fenotyper för att göra den till en unik och värdefull resurs för finstruktur-/funktionsstudier och modellering av mänskliga neuralrörsdefekter samt krampanfall och myeliniseringsstörningar ( tabell 2 ). Alleliska serier som genereras genom ENU eller genmålning vid andra komplexa loci kommer att vara värdefulla verktyg för att dissekera proteinfunktioner ( 17 ).

Isolering av sjukdomsmodeller med hjälp av ENU

Differentierade genetiska screeningar kan användas för att isolera ENU-inducerade mutationer. En screening med en enda generation kan snabbt generera livskraftiga och fertila mutanter som representerar allelserier, modifieringar eller dominanta mutationer. Två generationers deletionsscreening kan identifiera recessiva dödliga mutationer i en definierad region av genomet. Tre generationers stamträdsscreening kan användas för att söka igenom hela genomet efter en livskraftig mutation av intresse eller, i kombination med länkade markörer eller balanskromosomer, för att isolera letala eller sterila alleler (se nedan).

Storskaliga screeningar

Flera storskaliga mutagenesescreeningar har redan finansierats internationellt. De viktigaste egenskaperna hos dessa screeningar sammanfattas i tabell 3 . I var och en av dessa screeningar används en annan genetisk strategi för att isolera mutationer: vissa screeningar är inriktade på dominanta mutationer, medan andra är utformade för att isolera recessiva mutationer. Vissa grupper söker efter recessiva dödliga och skadliga mutationer med regional mutagenes för att undersöka genernas funktion parallellt med Human Genome Project. Andra grupper undersöker ett stort antal mutageniserade genomer för att hitta dominerande neurologiska och kliniska hematologiska eller biokemiska varianter.

Småskaliga screeningar

Screening av mutationer behöver inte utföras i stor skala. Två kostnadseffektiva strategier för det lilla laboratoriet är alleliska serier och sensitiserade banescreeningar. En sensitized pathway screen är inriktad på en enda biologisk eller biokemisk väg och utnyttjar icke-allelisk icke-komplementering för att isolera mutationer i den första generationens avkomma av mutageniserade hanar. I en sådan screening kan en inducerad mutation (*) på ett locus som interagerar med det intressanta locuset ( m ) misslyckas med att komplettera (*/+;+/ m ), men ändå ge en fenotyp som påminner om den ursprungliga homozygota mutanten ( m/m ). Vissa sensitiserade screeningar kan utföras i bakgrunden av en läkemedels- eller miljöförändring i stället för en genetisk förändring. Genom att till exempel använda en fenylalanininjektion som sensibilisator isolerades ett antal mutationer som påverkar fenylalaninmetabolismen som heterozygoter ( 20 , 21 ).

Kombination av genbaserade och fenotypdrivna metoder

En unik metod för att isolera mutationer kombinerar genbaserad inriktning i embryonala stamceller med fenotypdriven ENU-mutagenes. Kraftfulla genetiska strategier i Drosophila är beroende av tillgången till genetiska reagenser som deletioner, duplikationer och inversioner för att underlätta genetiska screeningar och ge ett enkelt och kostnadseffektivt lagerunderhåll. Deletioner är användbara för att generera haploidi i genetiska screeningar, liksom för kartläggning med hjälp av icke-kompletteringsstrategier ( Fig. 2 B) ( 22 ). Inversioner som bär en dominant markör och är homozygot dödliga är idealiska balanskromosomer för att undertrycka rekombination och enkelt identifiera klasser av avkommor för isolering och underhåll av dödliga eller skadliga mutationer ( Fig. 2 C). Förmågan att konstruera hela kromosomregioner med hjälp av Cre /loxP-teknik gör det möjligt att skapa dessa genetiska reagenser i en tvåstegsprocess för genmålning ( fig. 2 A) ( 23 , 24 ). Metoden är genbaserad eftersom deletionens eller inversionens slutpunkter är kända, vilket minimerar den arbetsinsats som krävs för att karakterisera omarrangemangen. Tekniska metoder gör det möjligt att märka omarrangemangen med en dominant gul pälsfärgsmarkör, K-14 agouti , vilket ger en resurs för enkel kartläggning, underhåll av bestånd och genetisk screening ( 22 , 24 , 25 ). Skapandet av musgenombibliotek som innehåller de konstruktioner som är nödvändiga för målinriktningen ger ett snabbt system för att generera dem var som helst i musens genom ( fig. 2 A) ( 25 ).

En första mutagenesinsats, utformad för att isolera recessiva mutationer av många fenotypklasser, är inriktad på musens kromosom 11, som är en genrik kromosom som i hög grad är konserverad med människans kromosom 17. Målet är att mätta kromosomen med mutationer för att definiera genens funktion, och sedan använda bevarandet av kopplingar mellan mus och människa för att förutsäga genens funktion hos människan. Med hjälp av de genetiska reagenser som skapats genom Cre /loxP-teknik genomförs två mutagenesescheman: två generationers deletionsstamtavlor (fig. 2 B) och tre generationers stamtavlor med hjälp av balanserade kromosomer (fig. 2 C). Båda systemen drar nytta av den gula pälsfärg som ges av K14-agouti-transgenen. Deletionssystemet kan endast användas för stora deletioner som inte är skadliga för djuret, vilket begränsar screeningen till vissa regioner, men gör det möjligt att isolera mutationer på endast två generationer. Med inversionsmetoden kan en större del av kromosomen undersökas för mutationer, men kräver tre generationers avel.

Identifiera punktmutationer

För att vara värdefulla måste nya mutationer lokaliseras så att kandidatgener och relevanta sjukdomsmodeller för människor kan identifieras. Punktmutationer som isoleras genom sin fenotyp måste kartläggas med hjälp av fenotypinformation, eftersom en molekylär tagg inte finns tillgänglig. Traditionellt kartläggs dessa mutationer i meiotiska backcrosses där fenotypen segregeras i förhållande till flera molekylära polymorfismer (för en översikt se ref. 26 ). För att kartlägga med en upplösning på 10 cM krävs en analys av 100 meioser. För att isolera 100 nya mutationer i hela genomet krävs alltså en analys av 10 000 möss. Kartläggningsstrategier med hög upplösning för positionskloning innebär vanligen en analys av 1 000-2000 meioser per mutation. En mängd dominanta och recessiva mutationer kan isoleras i varje ENU-screening, vilket gör kartläggningen till flaskhalsen i processen och kräver enklare kartläggningsteknik som DNA-pooling ( 27 ). De pälsfärgmarkerade screeningar som beskrivs ovan är unika i det avseendet att mutationen är isolerad kopplad till synliga kromosomala markörer, så att dess kromosomplacering är känd vid isoleringen, vilket eliminerar behovet av meiotisk kartläggning. Dessutom kan de Cre /loxP-genererade deletionerna användas för att lokalisera mutationerna till en subkromosomal region genom icke-komplementering ( 22 , 28 ). Eftersom sekvensen av musens genom snart kommer att vara tillgänglig kommer många mutationer att tilldelas gener baserat på positionell kandidatur efter deras lokalisering. Dessutom kan BAC-komplementering användas för att identifiera korrelationer mellan mutationer och gener ( 29 ).