Aislamiento bacteriano e identificación de RdFucI

Una colonia que creció en el medio que contenía l-fucoidan procedente de Laminaria Japonica (Carbosynth, Compton, Berkshire, Reino Unido) como única fuente de carbono se aisló de un intestino de abalón recolectado en Corea del Sur (archivo adicional 1: Fig. S1). La comparación de la identidad de la secuencia basada en el ARN ribosomal 16S con la base de datos del NCBI reveló que la cepa aislada era filogenéticamente cercana a los miembros del género Raoultella (archivo adicional 1: Fig. S1). Así, la cepa aislada se identificó como Raoultella sp. KDH14. Tras realizar la secuenciación completa del genoma, se identificó RdFucI de Raoultella sp. KDH14 sobre la base de la identidad de la secuencia del gen.

RdFucI está compuesta por 595 aminoácidos con una masa molecular de 65,5 kDa y un punto isoeléctrico de 5,5. Los resultados de la herramienta de búsqueda de alineación local básica (BLAST) indicaron la alta identidad de secuencia de RdFucI (> 90%) con otras l-FucIs de varias bacterias pertenecientes a las familias Raoultella, Klebsiella y Citrobacter.

La RdFucI identificada se sobreprodujo en E. coli BL21(DE3) con la etiqueta hexa-histidina N-terminal y se purificó mediante cromatografía de afinidad his-tag. Cuando se analizó mediante electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio y poliacrilamida (SDS-PAGE), la banda única apareció en torno a los 65 kDa, lo que coincide con la masa molecular calculada de la subunidad monomérica.

La reacción catalizada por RdFucI favorece la formación de l-fucosa

Para examinar la actividad isomerasa de RdFucI, se realizó la reacción enzimática con l-fucosa o l-fuculosa como sustrato (Fig. 2). Se determinaron las actividades enzimáticas para las reacciones directa (l-fucosa a l-fuculosa) e inversa (l-fuculosa a l-fucosa). La producción de l-fuculosa a partir de l-fucosa se confirmó mediante cromatografía en capa fina (TLC) y análisis de cromatografía de gases/espectrometría de masas (GC/MS) (archivo adicional 2: Fig. S2). En la interconversión entre la l-fucosa y la l-fuculosa, no se observó ningún producto secundario, lo que significa que un sustrato produce un producto (archivo adicional 2: Fig. S2). Así, consideramos razonable utilizar la cantidad calculada de concentración de l-fuculosa midiendo experimentalmente la cantidad de l-fucosa.

Conversión enzimática de a l-fucosa en l-fuculosa (reacción directa) y b l-fuculosa en l-fucosa (reacción inversa) por RdFucI. La reacción enzimática se llevó a cabo mediante 3 µg de RdFucI con a l-fucosa o b l-fuculosa a 10 mM como sustrato de partida a 30 °C durante 10 minutos en 20 mM de fosfato de sodio (pH 7,0) en presencia de 1 mM de Mn2+. La concentración de l-fucosa se midió experimentalmente y la concentración de l-fuculosa se calculó restando la concentración de l-fucosa determinada experimentalmente de la concentración total de azúcar (10 mM). Los datos experimentales representan las medias ± desviaciones estándar de tres réplicas

La reacción inversa fue 6,6 veces más rápida que la reacción directa, y la actividad específica para la l-fuculosa (63,9 U/mg) fue mayor que la de la l-fucosa (9,6 U/mg). En ambas reacciones, la relación de equilibrio entre la l-fucosa y la l-fuculosa, que se determinó experimentalmente, fue de aproximadamente 9:1, con lo que la constante de equilibrio (Keq) fue de 0,11. El valor de Keq también se determinó teóricamente como 0,23, basándose en la relación termodinámica del cambio de energía libre de Gibbs estándar de la reacción y Keq en el equilibrio, \(\mathop \Delta \limits_{r} G^{ \circ } = – RT\ln K_{text{eq}}, donde R y T representan la constante del gas (8,314 J/mol K) y la temperatura (K), respectivamente. \mathop \Delta \limits_{r} G^{ \circ }\) representa el cambio de energía libre de Gibbs estándar para la reacción de l-fucosa a l-fuculosa (0,859993 kcal/mol), que figura en la base de datos BioCyc (https://biocyc.org). Hubo cierta discrepancia entre los valores experimentales y teóricos de Keq. Un Keq < 1 indica que se favorece la reacción inversa. La isomerización catalizada por RdFucI favoreció la reacción inversa, produciendo l-fucosa a partir de l-fuculosa con un rendimiento de aproximadamente el 90% a 30 °C y pH 7.

Efecto de la temperatura y el pH sobre la actividad de RdFucI y el equilibrio

Se realizaron reacciones enzimáticas a varias temperaturas que iban de 10 a 80 °C y pHs que iban de 4 a 11 utilizando l-fuculosa como sustrato (Fig. 3). La isomerización de l-fuculosa a l-fucosa por parte de RdFucI fue altamente dependiente de la temperatura, y las actividades máximas o casi máximas (> 80% del máximo) se mostraron a temperaturas que oscilaban entre 30 y 50 °C (Fig. 3a). Para investigar el efecto de la temperatura en el equilibrio de la isomerización de l-fucosa en l-fuculosa, se investigó la relación de equilibrio a 30, 40 y 50 °C a los que se mostraron actividades máximas o casi máximas (> 80% del máximo). Como resultado, no hubo una diferencia significativa en la relación de equilibrio entre las tres temperaturas (l-fucosa/l-fuculosa = 9:1; p > 0,05). En otras palabras, la l-fucosa se sintetizó a partir de la l-fuculosa con un rendimiento de aproximadamente el 90% a todas las temperaturas probadas (archivo adicional 3: Fig. S3a).

Efecto de a la temperatura y b el pH sobre la actividad relativa de RdFucI frente a la l-fuculosa. Las reacciones enzimáticas se realizaron a a varias temperaturas que iban de 10 a 80 °C y b a varios pH que iban de 4 a 11. Los tampones utilizados fueron acetato de sodio 50 mM (pH 4, 5 y 6), fosfato de sodio 50 mM (pH 6, 7 y 8), Tris-HCl 50 mM (pH 7, 8 y 9) y glicina-NaOH 50 mM (9, 10 y 11). Los datos experimentales representan las medias ± desviaciones estándar de tres réplicas

Se investigó el efecto del pH. Se observaron altas actividades de RdFucI (> 70% del máximo) a pH alcalinos y casi neutros (pH 9, 10 y 11 y pH 6, 7 y 8). Por debajo de pH 6, la actividad de la enzima disminuyó bruscamente, observándose poca actividad a pH 4. A pesar de las altas actividades específicas en condiciones alcalinas, el rendimiento de l-fucosa en equilibrio (60 min de incubación) fue mucho menor a pH 10 (54%) que a pH 7 (88%) (archivo adicional 3: Fig. S3b). Las actividades relativas a pH 7, 8 y 9 fueron mucho más bajas en el tampón Tris-HCl que las actividades en el tampón acetato de sodio o glicina-NaOH, lo que implica que Tris inhibe fuertemente la actividad enzimática de RdFucI. Los experimentos enzimáticos precedentes en este estudio se han realizado en mezclas de reacción que contenían Tris a 1 mM, que procedía del paso de cambio de tampón tras la purificación de la enzima. Para examinar si el Tris en la mezcla de reacción podría inhibir a RdFucI, se compararon las actividades de isomerización de las reacciones que se produjeron en ausencia y en presencia de 1 mM de Tris (archivo adicional 4: Fig. S4). No se observó ninguna diferencia significativa en las actividades enzimáticas de las dos reacciones, lo que indica que 1 mM de Tris no inhibió la actividad de RdFucI.

Efecto de los iones metálicos en la actividad de RdFucI

Las isomerasas de azúcar, incluidas las isomerasas de l-fucosa, requieren cationes divalentes, como Mn2+ y Co2+, como cofactores para sus actividades de isomerización . Para estudiar el efecto de los cationes divalentes en la actividad catalítica de RdFucI sobre la l-fuculosa, se ensayó la actividad enzimática en ausencia y en presencia de 1 mM de varios iones metálicos o de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) (Tabla 1). La enzima RdFucI nativa no expuesta a los iones metálicos ni al EDTA mostró una baja actividad, y la quelación del metal por el EDTA redujo la actividad de la enzima. Entre los iones metálicos probados, el Mn2+, el Mg2+, el Co2+, el Cd2+ y el Zn2+ produjeron un aumento pronunciado de la actividad enzimática. En particular, la adición de Mn2+ aumentó al máximo la actividad de RdFucI en aproximadamente 7,4 veces. Por el contrario, Ca2+, Cu2+ y Fe3+ inhibieron la actividad de RdFucI.

Especificidad de sustrato y parámetros cinéticos de RdFucI

En general, las isomerasas de azúcar y de fosfato de azúcar muestran una amplia especificidad hacia varios sustratos. Para evaluar si la actividad favorecedora de la cetosa de RdFucI mostrada con la l-fuculosa era también evidente con otros sustratos, se investigó la especificidad de sustrato de RdFucI frente a varios azúcares aldosa (l-fucosa, d-arabinosa, d-altrosa, d-galactosa, d-manosa y d-glucosa) y sus correspondientes azúcares cetosa (l-fuculosa, d-ribulosa, d-psicosa, d-tagatosa y d-fructosa) (Fig. 4). Entre todos estos sustratos, incluidos los azúcares aldosa y cetosa, las actividades más altas se observaron con la l-fuculosa (115,3 U/mg) y la d-ribulosa (127,3 U/mg), que son ambos azúcares cetosa. Las actividades de RdFucI para la l-fuculosa y la d-ribulosa fueron mucho más altas que las de los otros sustratos. Entre los azúcares aldosa, la actividad para la l-fuculosa fue la más alta (21,0 U/mg), y los demás sustratos produjeron actividades específicas que oscilaron entre 4,7 y 7,9 U/mg. Los azúcares cetósicos distintos de la l-fuculosa y la d-ribulosa mostraron actividades específicas de 0,0 a 10,8 U/mg. Así pues, la l-fuculosa y la d-ribulosa fueron los sustratos preferidos por RdFucI y la actividad favorecedora de la cetosa de RdFucI se demostró sólo con la l-fuculosa y la d-ribulosa.

Especificidad de sustrato de RdFucI. Las reacciones enzimáticas se realizaron frente a 10 mM de varios sustratos de aldosa y cetosa a 40 °C y pH 10. Para los sustratos de aldosa, se utilizaron l-fucosa, d-arabinosa, d-altrosa, d-galactosa, d-manosa y d-glucosa. Para los sustratos de cetosa, se utilizaron l-fuculosa, d-ribulosa, d-psicosa, d-tagatosa y d-fructosa. Los datos experimentales representan las medias ± desviaciones estándar de tres réplicas

Se determinaron los parámetros cinéticos utilizando l-fuculosa y d-ribulosa como sustratos (archivo adicional 5: Tabla S1). Los valores de Km (constante de Michaelis) y kcat (número de recambio del sustrato) para la l-fuculosa fueron 1,9 y 1,2 veces menores, respectivamente, que los de la d-ribulosa. La eficiencia catalítica de RdFucI, representada como kcat/Km, para la l-fuculosa, fue 1,5 veces mayor que la de la d-ribulosa, lo que indica que la l-fuculosa es preferida como sustrato de RdFucI.

Estructura cristalina global de RdFucI

Para comprender mejor la función molecular, determinamos la estructura cristalina de RdFucI (archivo adicional 6: Tabla S2). El mapa de densidad electrónica de RdFucI estaba bien definido a partir de los residuos Ser5-Arg591 para seis subunidades en la unidad asimétrica. El monómero RdFucI consta de 19 α-hélices y 23 β-correas que comprenden los dominios N1, N2 y C (Fig. 5a). El dominio N1 (Ser5-Met172) adopta un pliegue α/β y está implicado en el reconocimiento de sustrato de la formación hexamérica de RdFucI. Los dominios N2 (Lys173-Leu352) y C (Thr353-Arg591) contienen los residuos de unión a metales implicados en la actividad catalítica (Fig. 5a). En la unidad asimétrica, las subunidades de RdFucI forman el hexámero dispuesto como un dímero de trímeros con pseudosimetría D3h (Fig. 5b). Esto es coherente con el resultado de la cromatografía de exclusión de tamaño analítica en la que se reveló que RdFucI existe como un homohexámero en solución (archivo adicional 7: Fig. S5).

Estructura global de RdFucI. a Representación en dibujos del monómero RdFucI. El monómero RdFucI está compuesto por los dominios N1- (amarillo), N2- (rosa) y C-(verde). b Representación superficial del hexámero RdFucI. Las subunidades A, B, C, D, E y F están coloreadas en amarillo, rosa, cian, púrpura, verde y naranja, respectivamente. Un sitio de unión a metales en un sitio de bolsillo de unión a sustrato se indica con un punto rojo

En la formación hexamérica, la subunidad A (superficie total: 23011.7 Å2) interactúa con cuatro subunidades diferentes B (residuos en la interfaz: 47/área de superficie enterrada: 1909,6 Å2), C (58/1837,6 Å2), D (42/1482,9 Å2), y E (34/1086,2 Å2). La subunidad A no interactúa con la subunidad F restante (Fig. 5b). La subunidad A de RdFucI tiene una superficie total enterrada de 2569,1 Å2, que representa el 27,45% de la superficie total. Esta interfaz enterrada está estabilizada por la interacción que implica 59 enlaces de hidrógeno y 26 puentes de sal de otras subunidades (Archivo adicional 8: Tabla S3, Archivo adicional 9: Tabla S4, Archivo adicional 10: Tabla S5, Archivo adicional 11: Tabla S6).

Sitio de unión a sustrato y sitio activo de RdFucI

El bolsillo de unión a sustrato está formado por los dominios N2 y C de la subunidad A y el dominio N1 de la subunidad B (Fig. 6a-c) y tiene un total de seis sitios de unión a sustrato en la RdFucI homohexamérica. La entrada del bolsillo de unión a sustrato, donde el sustrato se acerca, es de aproximadamente 11 × 12,5 Å (Fig. 6a). El bolsillo de unión al sustrato, donde se forma el sitio de unión al metal, tiene una superficie cargada negativamente de aproximadamente 4 × 5 Å (Fig. 6b). La distancia entre el sitio de unión al metal y la superficie del bolsillo de unión al sustrato es de aproximadamente 16,7 Å (Fig. 6d), lo que implica que el centro activo se encuentra en la profundidad de un bolsillo. Esto indica que tanto la cadena abierta como la forma de anillo del sustrato son accesibles al centro del sitio activo y que, por el contrario, un sacárido a granel no sería accesible al sitio activo que existe en el interior del bolsillo de unión del sustrato.

Bolsillo de unión a sustrato y sitio activo de RdFucI. a El bolsillo de unión a sustrato está formado por el ensamblaje de las subunidades A y C. b Superficie electrostática del bolsillo de unión a sustrato. c Presentación del factor B de la superficie de unión a sustrato. d Vista seccional de la superficie del bolsillo de unión a sustrato. e El mapa de densidad de electrones 2Fo-F (malla gris, contorneada a 1,0 σ) en los sitios de unión a metales de RdFucI empapada en una solución que contiene 10 mM de Mn2+. f Análisis geométrico de los sitios de unión al Mn2+ de RdFucI

RdFucI requiere iones metálicos divalentes para su actividad catalítica en la reacción de isomerización utilizando el mecanismo de ene-diol . El sitio de unión al metal de RdFucI debería estar coordinado con Mn2+ por los residuos conservados Glu337, Asp359 e His528 (archivo adicional 12: Fig. S6). Sin embargo, no hay un mapa de densidad de electrones de Fo-Fc (contados en > 5σ) que se sospeche que está unido a Mn2+ como metal esencial para la unión del sustrato (archivo adicional 13: Fig. S7a). El análisis del factor B reveló que el factor de temperatura del Mn2+ (70,53 Å2) es mayor que el factor de temperatura medio de la proteína (36.22 Å2), lo que indica que el Mn2+ está presente en RdFucI con una baja ocupación. Este hallazgo era coherente con el resultado del análisis bioquímico en el que la enzima nativa mostraba un bajo nivel de actividad. Por otro lado, la adición de Mn2+ aumentó sustancialmente la actividad catalítica de RdFucI (Tabla 1). Por lo tanto, especulamos que la adición de Mn2+ al cristal de RdFucI aumentaría la ocupación de la unión del Mn2+. Tras sumergir los cristales de RdFucI en una solución de 10 mM de Mn2+, se observó una densidad de electrones Fo-Fc fiable (> 6σ) en el sitio de unión del metal, donde se aclaró la posición del Mn2+ en todas las subunidades (Fig. 6e y archivo adicional 13: Fig. S7b). Sin embargo, el factor B de temperatura del Mn2+ (76,56 Å2) fue mayor que el de toda la proteína (60,69 Å2), lo que implica que el ion Mn2+ aún no está totalmente ocupado en el sitio de unión al metal. El Mn2+ fue coordinado por los átomos OE1 (distancia media: 2,62 Å) y OE2 (2,65 Å) de Glu337, los átomos OD1 (2,72 Å) y OD2 (2,72 Å) de Asp361, el átomo NE2 (2,52 Å) de His528 y la molécula de agua (2,79 Å) (Fig. 6e). Los ángulos de enlace medios de Glu337(OE1)-Mn2+-Asp361(OD2), Glu337(OE1)-Mn2+-His528(NE2) y Asp361(OD1)-Mn2+-His528(NE2) fueron de 127,32°, 86,25° y 73,96°, respectivamente. El ángulo de enlace entre los ligandos y el Mn2+ mostró una coordinación octaédrica distorsionada.

Comparación estructural con otras l-FucIs

Se utilizó el servidor DALI para buscar homólogos estructurales. Esta búsqueda reveló que RdFucI es similar a l-FucIs de E. coli (EcFucI, código PDB 1FUI, puntuación Z: 60,6, rmsd: 0,3 para 587 átomos de Cαs), Aeribacillus pallidus (ApFucI, 3A9R, puntuación Z: 56.6, rmsd: 0,7 para 580 átomos de Cαs), y Streptococcus pneumonia (SpFucI, 4C20, puntuación Z: 55,9, rmsd: 0,7 para 585 átomos de Cαs). La superposición del bolsillo de unión al sustrato mostró que los residuos de unión al metal Glu337, Asp361 e His528 (numerados en RdFucI) son posicionalmente idénticos a los de las otras proteínas, mientras que los residuos de reconocimiento del sustrato (Arg16, W88, Gln300, Tyr437, Trp496 y Asn524) tienen una ligera diferencia conformacional en sus cadenas laterales (Fig. 7a). En particular, el bucle α7-α8 de cada l-FucI, que se encuentra en la superficie del bolsillo de unión al sustrato, tiene una conformación diferente. La alineación de secuencias de las l-FucIs mostró una gran similitud, pero la secuencia del bucle α7-α8 de cada l-FucI era muy variable (Fig. 7b). Dado que el bucle α7-α8 participa en la formación de la arquitectura del bolsillo de unión a sustrato, cada l-FucI forma un bolsillo de unión a sustrato único (Fig. 7c). Las l-FucIs suelen tener una superficie cargada negativamente alrededor del sitio de unión a metal, pero la superficie del bolsillo de unión a sustrato presenta diferentes estados de carga (Fig. 7c). Como resultado, las diferencias estructurales del bucle α7-α8 causarán diferencias en la especificidad de sustrato de las l-FucIs.

Comparación estructural de RdFucI con otras l-FucIs. Superposición de a sitio activo y b superficie de unión a sustrato de RdFucI con EcFucI (código PDB: 1FUI), ApFucI (3A9R) y SpFucI (4C20). Detalle de la gran diferencia conformacional de los bucles α8-α9 de las l-FucIs (izquierda). c Alineación parcial de la secuencia de la región de los bucles α8-α9 para la RdFucI y EcFucI, ApFucI y SpFucI. d Representación de la superficie electrostática de RdFucI, EcFucI, ApFucI y SpFucI. El bolsillo de unión al sustrato profundo y las regiones del bucle α8-α9 se indican con líneas de puntos naranjas y negras, respectivamente. Un sitio de unión a metales se indica con un asterisco amarillo