TEXT

Yersinia pestis este agentul etiologic al ciumei și are potențialul de a fi utilizată ca armă biologică (1, 13, 17-20, 23). Din acest motiv, este important ca rezistența emergentă la medicamente, fie ea naturală sau artificială, să poată fi detectată cu ajutorul unor metode standardizate care să fie ușor de implementat în mai multe laboratoare. Institutul pentru standarde clinice și de laborator (Clinical and Laboratory Standards Institute – CLSI) descrie o metodă de referință de microdiluție a bulionului (BMD) pentru testarea sensibilității antimicrobiene a Y. pestis și oferă orientări de interpretare a CMI pentru opt agenți antimicrobieni (6). BMD utilizează bulionul Mueller-Hinton ajustat cu cationi (CAMHB) și necesită incubare la 35 °C timp de 24 de ore, cu opțiunea de incubare timp de 48 de ore în cazul în care creșterea la 24 de ore este insuficientă pentru interpretarea punctului final. Din păcate, BMD de referință este dificil de încorporat în multe laboratoare, deoarece este relativ costisitor și laborios și necesită stocarea panourilor într-un format congelat sau deshidratat. Există mai multe metode alternative de testare a sensibilității, inclusiv metodele de difuzie pe disc și Etest. Cu toate acestea, înainte ca aceste metode să poată fi utilizate pentru o specie, ele trebuie evaluate și comparate cu BMD pentru a determina corelațiile dintre rezultatele obținute prin compararea metodelor.

Soldații de Y. pestis sunt fastidioși și pot crește mai lent pe medii artificiale decât alte specii comune de Enterobacteriaceae, astfel încât metodele de testare a sensibilității pentru Y. pestis au fost dificil de standardizat. În literatura de specialitate sunt descrise mai multe metode. Testele de difuzie pe disc au fost efectuate, în general, pe agar Mueller-Hinton (MHA), folosind de obicei 48 de ore de incubare la 35°C, dar descrierile metodologice sunt uneori lipsite de detalii (10, 16, 24). Metoda Etest a fost utilizată de Wong et al. (25), folosind MHA cu 5 % sânge de oaie, incubare la 35°C și un inocul care să corespundă cu un nr. 1 McFarland în loc de standardul de 0,5 McFarland utilizat în majoritatea studiilor de difuzie pe disc sau Etest. Diluția în agar, folosind MHA incubat la 27°-30°C timp de 48 de ore, este cea mai frecventă metodă raportată în literatura de specialitate (7, 8, 11, 12, 22). Metodele de macrodiluție și microdiluție în bulion au fost, de asemenea, utilizate cu diferite temperaturi de incubare (2, 21).

Există mai multe atribute ale metodelor de difuzie pe disc și Etest care le fac să fie metode alternative atractive pentru testarea sensibilității, inclusiv ușurința de depozitare și un termen de valabilitate lung pentru discuri și benzi. De asemenea, acestea sunt metode bazate pe agar și punctele finale pot fi mai ușor de citit decât cele ale BMD. Etest are avantajul suplimentar de a produce un rezultat MIC. În acest raport, prezentăm rezultatele unui studiu multicentric care compară metodele Etest și de difuzie pe disc cu metoda de referință CLSI BMD pentru testarea sensibilității la Y. pestis.

(Acest raport a fost prezentat parțial la cea de-a 107-a reuniune generală a Societății Americane de Microbiologie, Toronto, Canada, 21-25 mai 2007.)

Vreo 26 tulpini diverse de Y. pestis din colecțiile Centers for Disease Control and Prevention (CDC) și U.S. Army Medical Research Institute of Infectious Diseases (USAMRIID) au fost testate atât prin metoda Etest, cât și prin metoda BMD în patru locuri de testare și, în plus, prin difuzie pe disc în două dintre aceste locuri. Șase tulpini erau din biovarul Antiqua, șapte din biovarul Medievalis și 12 din biovarul Orientalis; un izolat atipic nu a putut fi atribuit niciunui biovar. Agenții antimicrobieni au fost testați atât prin BMD, cât și prin Etest (bioMérieux, Durham, NC), iar intervalele corespunzătoare au fost următoarele pentru BMD și, respectiv, Etest: pentru cloramfenicol, de la 0,03 la 64 μg/ml și de la 0,016 la 256 μg/ml; pentru ciprofloxacină, de la 0,03 la 64 μg/ml și de la 0,002 la 32 μg/ml; pentru doxiciclină, de la 0,03 la 64 μg/ml și de la 0.016 până la 256 μg/ml; pentru gentamicină, 0,03 până la 64 μg/ml și 0,016 până la 256 μg/ml; pentru levofloxacină, 0,06 până la 64 μg/ml și 0,002 până la 32 μg/ml; pentru streptomicină, 0,03 până la 64 μg/ml și 0,002 până la 32 μg/ml; pentru streptomicină, 0,03 până la 64 μg/ml și 0.016 până la 256 μg/ml; pentru tetraciclină, de la 0,03 până la 64 μg/ml și de la 0,016 până la 256 μg/ml; și pentru trimetoprim-sulfametoxazol, de la 0,015/32 până la 16/304 μg/ml și de la 0,002/0,038 până la 32/608 μg/ml. Deoarece intervalele pentru testarea BMD a unor medicamente nu au cuprins concentrațiile mai mici care pot fi obținute prin Etest, acordul esențial (± 1 log2 diluție) între metode a fost considerat ca fiind în afara scalei pentru unele comparații de rezultate (de exemplu, o CMI a levofloxacinei BMD de ≤0,06 μg/ml și o CMI Etest de 0,03 μg/ml). La CDC, au fost pregătite tăvi MIC de 96 de godeuri folosind 100 μl de CAMHB (BBL, Sparks, MD) pe gode; tăvile au fost păstrate congelate la -70°C și expediate către laboratoarele participante. Testele au fost efectuate prin metodele standard CLSI pentru BMD și difuzia pe disc (4-6). Inoculele au fost pregătite din culturi aerobe de 18 până la 24 de ore cultivate pe plăci de agar sânge de oaie 5% (BBL) prin metoda suspensiei directe de colonii în bulion Mueller-Hinton (MHB) (Remel, Lenexa, KS) pentru a egala un standard de turbiditate McFarland de 0,5 (4); aceleași inocule au fost folosite pentru a inocula plăci MHA cu diametrul de 150 mm pentru testele Etest și de difuzie pe disc. Imediat după inoculare, s-au efectuat cel puțin două numărători aleatorii de colonii în fiecare loc de testare cu puțul de control al creșterii BMD pozitiv, pentru a evalua dimensiunea inoculului. Nu s-au aplicat mai mult de patru benzi Etest pe o placă. Pentru difuzia pe discuri, s-au aplicat discuri comerciale (BBL) cu ajutorul unui distribuitor multidiscuri cu autoîncărcare (BBL). Panourile BMD și plăcile MHA, atât pentru Etest, cât și pentru difuzia discurilor, au fost incubate la 35 °C și citite la perioade de 24 și 48 de ore. Etest-urile au fost citite conform instrucțiunilor din prospectul Etest, după cum urmează: cloramfenicol, doxiciclină, tetraciclină și trimetoprim-sulfametoxazol au fost citite la o inhibiție de 80 % pentru punctul de intersecție; ciprofloxacina, levofloxacina, gentamicina și streptomicina au fost citite la o inhibiție de 100 %. Pentru analiza datelor, MIC-urile Etest au fost rotunjite la cea mai apropiată diluție log2. Escherichia coli ATCC 25922 și Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 au fost utilizate pentru controlul calității BMD și Etest. MIC pentru tulpinile de control al calității au fost determinate prin incubare timp de 16 până la 20 de ore. Plajele acceptabile de control al calității BMD pentru streptomicină au fost stabilite anterior la CDC (date nepublicate). Controlul de calitate al Etestului pentru cloramfenicol a fost efectuat prin testarea Escherichia coli ATCC 25922 și aplicarea intervalului acceptabil pentru CLSI BMD.

Pentru a măsura concordanța dintre rezultatele Etest și BMD, a fost examinată distribuția diferențelor în MIC de diluție log2 și a fost calculat, pentru fiecare medicament, procentul de determinări MIC care au dat valori identice (concordanță esențială în limitele de precizie ale metodei de referință ). De asemenea, pentru a determina dacă metoda Etest a produs MIC-uri semnificativ mai mici sau mai mari decât metoda de referință, am efectuat un test Wilcoxon signed-rank cu MIC-urile de diluție log2 ale celor două teste prin utilizarea software-ului statistic SAS (SAS Institute Inc., Cary, NC); MIC-urile în limita a ± 1 log2 diluție au fost considerate identice pentru acest test. Compararea rezultatelor categoriilor interpretative (susceptibil, intermediar și rezistent) s-a realizat prin calcularea ratelor de erori minore, majore și foarte majore.

În general, punctele finale MIC au fost mai ușor de distins prin BMD decât prin Etest la 24 de ore (datele nu sunt prezentate). În trei locații de testare (A, B și C), aproape toate CMI-urile BMD și Etest au fost lizibile la 24 h de incubare; un singur rezultat Etest a fost o excepție. Site-ul D a raportat MIC-uri BMD lizibile la 24 de ore pentru toate tulpinile, cu excepția uneia. Creșterea a fost insuficientă pentru a citi MIC-urile Etest la 24 de ore pentru opt tulpini din situl D. Numărul de CMI Etest care nu au putut fi citite din cauza creșterii inadecvate la 24 de ore, în funcție de medicament, a fost următorul: pentru cloramfenicol, n = 6; pentru ciprofloxacină, n = 4; pentru doxiciclină, n = 3; pentru gentamicină, n = 2; pentru levofloxacină, n = 5; pentru streptomicină, n = 5; pentru tetraciclină, n = 4; și pentru trimetoprim-sulfametoxazol, n = 4. Toate locurile de testare au fost capabile să citească toate rezultatele la 48 de ore. Prin urmare, în comparație au fost utilizate rezultatele la 48 de ore. Numărătoarea coloniilor a demonstrat că densitatea inoculului în godeurile BMD s-a situat în limite acceptabile pentru toate cele patru situri de testare; mediile pentru situri au variat de la 1,1 × 105 UFC/ml la 4,2 × 105 UFC/ml.

CMI90 și intervalul CMI pentru fiecare agent antimicrobian au fost comparate în funcție de metodă (tabelul 1). Pentru toate medicamentele, cu excepția cloramfenicolului, MIC90 pentru toate metodele au fost identice sau în limita a ± 1 log2 diluție una față de cealaltă. Concordanța de categorie între metodele Etest și BMD pentru toate medicamentele a fost excelentă, între 97 % și 100 %; toate erorile au fost minore (tabelul 1). Toate CMI-urile BMD și Etest s-au încadrat în intervalul susceptibil după 24 de ore de incubare (datele nu sunt prezentate). La 48 h, majoritatea CMI-urilor s-au încadrat în intervalul de sensibilitate, cu excepția următoarelor rezultate nesensibile: cloramfenicol (n = 2); ciprofloxacină (n = 1); și streptomicină (n = 5). Cele mai multe dintre rezultatele nesusceptibile au fost obținute prin metoda BMD mai degrabă decât prin Etest (Fig. 1).

Cele mai bune metode sunt comparate cel mai bine prin analiza acordului esențial (procentele de CMI în limita a ± 1 log2 diluție pentru cele două metode ). Acordul esențial pentru toate siturile combinate (inclusiv pentru MIC-urile de pe scară) a fost ≥90% pentru ciprofloxacină, doxiciclină, levofloxacină, streptomicină și tetraciclină. Valorile pentru acordul esențial pentru gentamicină, trimetoprim-sulfametoxazol și cloramfenicol au fost mai mici, de 88 %, 78 % și, respectiv, 35 %. Cu excepția cloramfenicolului și a trimetoprim-sulfametoxazolului, a existat, în general, o variație mică sau deloc în ceea ce privește acordul esențial între site-uri pentru fiecare medicament (tabelul 3). Pentru cloramfenicol și trimetoprim-sulfametoxazol, acordul esențial între metodele CMI la situri individuale a variat de la 4% la 81% și, respectiv, de la 58% la 96%.

CMI ale gentamicinei și doxiciclinei Etest au fost semnificativ (P = 0.03) mai mari decât MIC-urile corespunzătoare ale BMD (tabelul 2); cu toate acestea, valorile pentru acordul esențial între metode pentru fiecare medicament au fost încă bune, de 88% și, respectiv, 93% (tabelul 2). CMI-urile de cloramfenicol, ciprofloxacină și trimetoprim-sulfametoxazol Etest au fost, în medie, semnificativ (P < 0,001) mai mici decât CMI-urile BMD corespunzătoare, și numai ciprofloxacina a avut o concordanță esențială de ≥90%. Pentru levofloxacină, streptomicină și tetraciclină, nu s-au observat diferențe statistice între CMI Etest și CMI BMD.

Pentru difuzia pe disc, toate discurile antimicrobiene, cu excepția discurilor de streptomicină, au produs zone cu diametru mare; unele zone au depășit 40-50 mm în diametru (tabelul 4) și s-au suprapus unele peste altele pe placa MHA. Marginile zonelor pentru medicamentele care produc aceste zone mari erau adesea neclare sau indistincte. Două izolate de la un loc de testare au avut zone ilizibile pentru toate medicamentele din cauza creșterii slabe la 24 de ore. Dischetele de cloramfenicol și trimetoprim-sulfametoxazol au produs ocazional un efect de zonă dublă cu o margine interioară de creștere mai ușoară, probabil din cauza activității statice a medicamentului cu acest organism cu creștere lentă. Dischetele de streptomicină au produs cea mai mică dimensiune medie a zonei de inhibiție a discului (23-24 mm de diametru) și cele mai distincte și lizibile zone. Dimensiunile zonelor celorlalte tipuri de discuri au avut un diametru mediu de 30 până la 42 mm la 48 de ore, iar diametrele lor au fost mai greu de citit.

În general, a existat o bună concordanță esențială între metoda Etest și metoda BMD de referință pentru testarea sensibilității antimicrobiene. Cu toate acestea, ratele de concordanță esențială între Etest și BMD pentru cloramfenicol, gentamicină și trimetoprim-sulfametoxazol au fost mai mici decât minimul de 90% care este recomandat de Food and Drug Administration (FDA) din S.U.A. pentru utilizarea unei noi metode în testarea clinică (http://www.fda.gov/downloads/MedicalDevices/DeviceRegulationandGuidance/GuidanceDocuments/ucm071462.pdf).

Diferențele de intensitate a iluminării în cabinetul de securitate biologică la fiecare loc de testare pot fi un factor care contribuie la determinarea punctului final. Am constatat că citirea unui punct final Etest este mai ușoară atunci când o lampă de lectură este plasată în cabinet pentru a suplimenta sursa de lumină. Toate siturile, cu excepția sitului D, au utilizat această sursă de lumină suplimentară pentru a îmbunătăți lizibilitatea testelor de sensibilitate. Etesturile de tetraciclină și doxiciclină, ca și cele de cloramfenicol și trimetoprim-sulfametoxazol, au fost, de asemenea, citite la un punct final de 80%, dar nu s-au observat elipse duble, iar acordul esențial a fost ≥90% pentru ambele medicamente din clasa tetraciclinei, astfel încât se pare că acest fenomen Etest variază în funcție de clasa de medicamente pentru Y. pestis.

Pentru gentamicină, acordul esențial general a fost de 88%, puțin sub pragul de acord recomandat de 90%. Două site-uri au demonstrat un acord esențial ridicat (96%), dar acordul a fost mai mic (77% și 81%) pentru celelalte două site-uri. Motivul acestei variabilități este necunoscut. Cu toate acestea, distribuțiile generale ale MIC pentru Etest și BMD MIC sunt similare (Fig. 1). S-a sugerat că, pentru noile metode de sensibilitate care sunt efectuate cu organisme cu creștere lentă sau fastidioase, testarea ar trebui să fie mai puțin rigidă față de acest standard și că este permisă o concordanță esențială mai mică (14). Această logică pare adecvată pentru testul Etest pentru gentamicină, deoarece acordul esențial a fost de 88 %. Acceptabilitatea testului Etest trimetoprim-sulfametoxazol cu un acord esențial de 78% este neclară.

O limitare a acestui studiu a fost faptul că nu au fost incluse izolate cu rezistență cunoscută. Accesul la tulpinile rezistente la medicamente din Madagascar (3, 9-11) este restricționat. Alte rapoarte de rezistență la medicamente la Y. pestis sunt rare, iar tulpinile rezistente nu sunt bine caracterizate (15, 16, 24). Prin urmare, nu am putut evalua capacitatea metodei Etest de a detecta rezistența cunoscută la Y. pestis.

Metoda de difuzie pe disc nu este recomandată pentru Y. pestis din cauza dificultății de citire a zonelor de inhibiție slab definite și a diametrelor mari ale zonelor întâlnite cu majoritatea medicamentelor testate. Testarea cu discul de streptomicină ar putea justifica un studiu suplimentar în cazul în care izolatele rezistente la streptomicină devin accesibile, deoarece dimensiunile zonelor au fost mai mici și mai distincte decât cele obținute cu alte discuri.

În rezumat, într-o comparație a două metode de determinare a CMI pentru testarea sensibilității Y. pestis, rezultatele pentru toți agenții antimicrobieni s-au corelat bine între Etest și BMD, cu excepția cloramfenicolului și a trimetoprim-sulfametoxazolului, pentru care punctele finale au fost dificil de determinat prin Etest. De asemenea, a existat o variabilitate mai mare de la un loc la altul pentru cloramfenicol și trimetoprim-sulfametoxazol decât pentru celelalte medicamente. Metoda Etest pare a fi o alternativă acceptabilă la BMD pentru ciprofloxacină, doxiciclină, gentamicină, levofloxacină, streptomicină și tetraciclină, dar nu și pentru cloramfenicol și trimetoprim-sulfametoxazol. Deoarece Y. pestis s-a dezvoltat lent pe MHA, se recomandă o incubare de 48 de ore pentru Etest. Cu toate acestea, deoarece nu am putut include în studiul nostru nicio tulpină de Y. pestis rezistentă la medicamente, se recomandă, de asemenea, ca MIC-urile Etest nesensibile să fie confirmate printr-un test MIC BMD de referință. De asemenea, sfătuim ca testul BMD de confirmare să fie efectuat pe orice izolat de Y. pestis cu o CMI Etest pentru ciprofloxacină sau levofloxacină de 0,25 μg/ml, o CMI situată la capătul superior al intervalului de sensibilitate, deoarece nu se știe dacă rezistența emergentă poate fi detectată pentru aceste două medicamente prin metoda Etest.

.