Abstract

Progresul secvențierii genomului uman determină abordări genetice pentru definirea funcției genelor. Strategii precum capcanele genetice și mutageneza chimică vor genera în curând o resursă mare de șoareci mutanți. Mutațiile punctiforme induse de N -etil- N -nitrozouree (ENU) oferă o resursă unică de mutanți, deoarece acestea: (i) reflectă consecințele modificării unei singure gene, independent de efectele de poziție; (ii) oferă o disecție a structurii fine a funcției proteice; (iii) prezintă o gamă de efecte mutante, de la pierderea completă sau parțială a funcției până la o funcție exagerată; și (iv) descoperă funcțiile genelor într-o manieră imparțială. Ecranările ENU orientate spre fenotip la șoarece pun accentul pe relevanța pentru bolile clinice umane, vizând cardiologia, fiziologia, neurologia, imunitatea, hematopoieza și dezvoltarea mamiferelor. Astfel de abordări sunt extrem de puternice în înțelegerea bolilor și trăsăturilor umane complexe: modificările perechilor de baze pot modela cu exactitate modificările de baze întâlnite în bolile umane, iar alelele mutante subtile într-un fond genetic standard oferă capacitatea de a analiza consecințele genotipurilor compuse. Experimentele de mutageneză ENU la șoareci, aflate în curs de desfășurare, generează o comoară de noi mutații care permit un studiu aprofundat al unei singure gene, al unei regiuni cromozomiale sau al unui sistem biologic.

Introducere

Instrumentele genetice de manipulare la șoarece sunt extinse și puternice. Geneticienii șoarecilor pot elimina sau supraexprima gene în întregul animal sau într-un țesut specific, pot introduce bucăți mari de ADN propriu sau străin în genom și pot inginera cromozomi întregi. Aceste tehnici, combinate cu asemănările genetice, de dezvoltare, patologice și fiziologice dintre șoarece și om, au făcut din șoarecele de laborator un organism model principal pentru cercetarea bolilor umane. Tulpinile consangvinizate de șoareci oferă posibilitatea de a studia o trăsătură a unei boli într-un fond genetic definit, permițând distincția între fenotipurile conferite de o singură mutație și contribuțiile altor modificatori genetici.

Capacitatea de a crea mutații de pierdere a funcției prin recombinare omologă în celulele stem embrionare a deschis calea unei revoluții în biologia șoarecilor. Cu ajutorul tehnologiei celulelor stem embrionare, orice genă implicată în boli umane poate fi perturbată, oferind informații valoroase despre consecințele mutației la nivelul întregului animal. În timp ce mutațiile nule sunt necesare, mutațiile subtile induse de N -etil- N -nitrozouree (ENU) sunt de neprețuit pentru examinarea întregii game de funcții genetice. Mutațiile în regiunile de codificare și în elementele de reglementare pot produce fenotipuri extrem de diferite, oferind în același timp o disecție fină a structurii funcției proteice și a reglării genelor. Serii de alele pot fi generate prin recombinare omoloagă, dar mutageneza bazată pe fenotipuri oferă multe avantaje în ceea ce privește viteza de generare și eliminarea prejudecăților cercetătorului. Prin urmare, o bază de date knockout pentru genomul șoricelului ar trebui considerată doar ca un punct de plecare; pentru a finaliza analiza funcțională sunt obligatorii alte alele și specificități tisulare.

Mutagenizarea liniei germinale a șoarecilor

ENU poate transfera gruparea sa etilică la radicalii de oxigen sau de azot din ADN, ceea ce are ca rezultat o deteriorare și o substituție a perechilor de baze dacă nu este reparată. Cele mai mari rate de mutație apar în celulele stem spermatogoniale pre-meiotice, cu frecvențe de mutație la un singur locus de 6–1,5 × 10 -3 ( 1-3 ), ceea ce echivalează cu obținerea unei mutații într-o singură genă de elecție la unul din 175-655 de gameți examinați. Datorită puterii sale de a izola mutații în orice genă sau regiune de interes, ENU a fost utilizat la șoarece pentru: (i) obținerea de serii multialelice de gene unice pentru a defini mai bine funcția; (ii) disecarea căilor biochimice sau de dezvoltare; (iii) obținerea de noi mutații recesive pe un singur cromozom sau la nivelul întregului genom; și (iv) saturarea regiunilor din genomul șoricelului care sunt descoperite prin deleții ( 4-10 ). Analiza a 62 de mutații de linie germinală secvențiate din 24 de gene arată că ENU modifică predominant perechile de baze A/T, cu 44 % de tranziții A/T→T/A, 38 % de tranziții A/T→G/C, 8 % de tranziții G/C →A/T, 3 % de tranziții G/C→C/G, 5 % de tranziții A/T→C/G și 2 % de tranziții G/C→T/A ( Tabelul 1 ; Fig. 1 ). Atunci când sunt traduse într-un produs proteic, aceste modificări au ca rezultat 64 % mutații cu sens greșit, 10 % mutații fără sens și 26 % erori de splicing ( Tabelul 1 ; Fig. 1 ).

Deoarece este un mutagen punctiform, ENU poate induce multe tipuri diferite de alele. Mutații de pierdere a funcției, hipomorfe viabile ale grupurilor de completare letală, antimorfe și mutații de câștig de funcție au fost izolate în ecrane de mutageneză la șoareci ( 4 , 9-16 ). Seriile de alele la un singur loci sunt extrem de puternice atunci când sunt analizate împreună pentru a defini funcția. Seriile alelice la loci complecși pot perturba izoforme proteice individuale, ceea ce duce la descoperirea unor funcții distincte în diferite țesuturi de-a lungul vieții unui organism ( 17 ). Un exemplu izbitor al unei astfel de serii alelice este locusul quaking ( qk ). Înainte de izolarea alelelor induse de ENU, locusul quaking a fost definit de o singură alelă spontană, qkV , cu un fenotip homozigot de convulsii și tremurături cauzate de dismielinizarea severă a sistemului nervos central (SNC) ( 18 ). Cu toate acestea, alelele induse de ENU arată că quaking funcționează, de asemenea, în timpul embriogenezei ( 7 , 13 ). Homozigoții a patru dintre cele cinci alele induse de ENU ( qk1-1 , qkkt1 , qkk2 , qkkt3/4 ) mor la zilele embrionare (E) 8,5-10,5 cu defecte ale SNC, în timp ce numai unul dintre ei este viabil și prezintă tremurături și convulsii ( qke5 ) (19; J.K. Noveroske și M.J. Justice, date nepublicate). Deși alelele quaking pot fi grupate pe baza letalității embrionare sau a dismielinizării viabile, fiecare alelă se abate într-un mod semnificativ de la aceste fenotipuri generale, ceea ce o face o resursă unică și valoroasă pentru studii de structură/funcție fină și modelarea defectelor tubului neural uman, precum și a tulburărilor de convulsii și de mielinizare ( Tabelul 2 ). Seriile alelice generate de ENU sau de direcționarea genică la alți loci complecși vor fi instrumente valoroase pentru disecarea funcției proteice ( 17 ).

Isolarea modelelor de boli cu ajutorul ENU

Pentru izolarea mutațiilor induse de ENU se pot folosi diferite ecrane genetice. Un ecran cu o singură generație poate genera rapid mutanți viabili și fertili care reprezintă serii de alele, modificatori sau mutații dominante. Ecranele de deleție pe două generații pot identifica mutații letale recesive într-o regiune definită a genomului. Screen-urile pedigree cu trei generații pot fi utilizate pentru a scana întregul genom în căutarea unei mutații viabile de interes sau, în combinație cu markeri legați sau cromozomi de echilibrare, pentru a izola alele letale sau sterile (a se vedea mai jos).

Screen-uri la scară largă

Mai multe screen-uri de mutageneză la scară largă au fost deja finanțate la nivel internațional. Caracteristicile cheie ale acestor ecrane sunt rezumate în tabelul 3 . Fiecare dintre aceste ecrane utilizează o strategie genetică diferită pentru a izola mutațiile: unele ecrane vizează mutații dominante, în timp ce altele sunt concepute pentru a izola mutații recesive. Unele grupuri selectează mutații recesive letale și dăunătoare prin mutageneză regională pentru a aborda funcția genică în paralel cu Proiectul Genomului uman. Alte grupuri scanează un număr mare de genomuri mutagenetizate pentru a căuta variante dominante neurologice și de hematologie clinică sau biochimice.

Screening la scară mică

Screeningul pentru mutații nu trebuie să fie efectuat pe scară largă. Două strategii eficiente din punct de vedere al costurilor pentru laboratoarele mici sunt seriile alelice și ecranările de căi sensibilizate. Un screening al căilor sensibilizate vizează o singură cale biologică sau biochimică și exploatează necomplementarea non-alelică pentru a izola mutațiile în prima generație de descendenți ai masculilor mutagenați. Într-un astfel de screening, o mutație indusă (*) la un locus care interacționează cu locusul de interes ( m ) poate să nu se completeze (*/+;+/ m ), dar să producă un fenotip care amintește de mutantul homozigot original ( m/m ). Unele ecrane sensibilizate pot fi efectuate în contextul unui medicament sau al unei modificări de mediu, în loc de o modificare genetică. De exemplu, folosind o injecție de fenilalanină ca sensibilizator, au fost izolate ca heterozigoți o serie de mutații care afectează calea metabolismului fenilalaninei ( 20 , 21 ).

Combinarea abordărilor bazate pe gene și pe fenotip

O abordare unică în vederea izolării mutațiilor combină direcționarea bazată pe gene în celulele stem embrionare cu mutageneza ENU bazată pe fenotip. Strategiile genetice puternice la Drosophila se bazează pe disponibilitatea reactivilor genetici, cum ar fi delețiile, duplicațiile și inversiunile, pentru a facilita ecranările genetice și pentru a asigura o întreținere simplă și rentabilă a stocurilor. Delețiile sunt utile pentru generarea haploidiei în ecranele genetice, precum și pentru cartografierea cu ajutorul strategiilor de necomplementare ( Fig. 2 B) ( 22 ). Inversiunile care poartă un marker dominant și sunt homozigote letale sunt cromozomi de echilibrare ideali pentru a suprima recombinarea și pentru a identifica cu ușurință clase de descendenți pentru izolarea și menținerea mutațiilor letale sau dăunătoare ( Fig. 2 C). Capacitatea de a proiecta regiuni cromozomiale întregi cu ajutorul tehnologiilor Cre /loxP permite crearea acestor reactivi genetici într-un proces de direcționare genetică în două etape ( Fig. 2 A) ( 23 , 24 ). Abordarea se bazează pe gene, deoarece punctele finale ale deleției sau inversiunii sunt cunoscute, ceea ce reduce la minimum efortul necesar pentru caracterizarea rearanjamentelor. Tehnicile de inginerie permit ca rearanjamentele să fie marcate cu un marker dominant de culoare galbenă a hainei, K-14 agouti , oferind o resursă pentru o cartografiere simplă, pentru întreținerea stocului de animale și pentru testele genetice ( 22 , 24 , 25 ). Crearea de biblioteci genomice de șoareci care conțin construcțiile necesare pentru evenimentele de direcționare oferă un sistem rapid pentru generarea acestora oriunde în genomul șoricelului ( Fig. 2 A) ( 25 ).

Un efort inițial de mutageneză, conceput pentru a izola mutații recesive din mai multe clase fenotipice, vizează cromozomul 11 al șoarecilor, care este un cromozom bogat în gene foarte conservat cu cromozomul 17 uman. Scopul este de a satura cromozomul cu mutații pentru a defini funcția genei, apoi de a folosi conservarea legăturilor între șoarece și om pentru a prezice funcția genei la om. Cu ajutorul reactivilor genetici generați de ingineria Cre /loxP, se realizează două scheme de mutageneză: pedigree de deleție pe două generații ( Fig. 2 B) și pedigree pe trei generații folosind cromozomi de echilibrare ( Fig. 2 C). Ambele scheme profită de culoarea galbenă a blănii conferită de transgenul K14-agouti. Schema de deleție poate fi utilizată numai pentru deleții mari care nu sunt dăunătoare pentru animal, limitând screening-ul la anumite regiuni, dar permițând izolarea mutațiilor în numai două generații. Schema de inversiune permite depistarea mutațiilor pe o porțiune mai mare de cromozom, dar necesită trei generații de reproducere.

Identificarea mutațiilor punctiforme

Pentru a fi valoroase, noile mutații trebuie să fie localizate, astfel încât să poată fi identificate genele candidate și modelele de boli umane relevante. Mutațiile punctiforme izolate prin fenotipul lor trebuie să fie cartografiate folosind informații despre fenotip, deoarece nu este disponibilă o etichetă moleculară. În mod tradițional, aceste mutații sunt cartografiate în retrocrucișări meiotice care segregă fenotipul în raport cu polimorfisme moleculare multiple (pentru o analiză, a se vedea ref. 26 ). Pentru a cartografia la o rezoluție de 10 cM este necesară analizarea a 100 de meioze. Astfel, 100 de noi mutații izolate la nivel de genom ar necesita analiza a 10 000 de șoareci. Strategiile de cartografiere de înaltă rezoluție pentru clonarea pozițională implică, de obicei, analiza a 1 000-2000 de meioe pentru fiecare mutație. O multitudine de mutații dominante și recesive pot fi izolate în orice screening ENU, ceea ce face ca cartografierea să fie gâtul de gâtul procesului și necesită tehnologii de cartografiere mai simple, cum ar fi gruparea ADN-ului ( 27 ). Ecranele cu marcare a culorii hainei descrise mai sus sunt unice prin faptul că mutația este izolată legată de markeri cromozomiali vizibili, astfel încât locația cromozomială a acesteia este cunoscută în momentul izolării, eliminând nevoia de cartografiere meiotică. În plus, delețiile generate de Cre /loxP pot fi utilizate pentru a localiza mutațiile într-o regiune subcromosomală prin necomplementare ( 22 , 28 ). Deoarece secvența genomului de șoarece va fi disponibilă în curând, multe mutații vor fi atribuite genelor pe baza candidaturii poziționale după localizarea lor. În plus, complementarea BAC poate fi utilizată pentru a identifica corelațiile mutație-gena ( 29 ).

.

,

,

, vol.

(pag.

–

)

,

,

.

,

,

, vol. I, nr. 1.

(pg.

–

)

,

,

.

,

,

, vol.

(pag.

–

)

,

,

,

,

,

,

,

.

,

,

, vol.

(pag.

–

)

,

,

,

,

,

.

,

,

, vol.

(pag.

–

)

.

,

,

, vol.

(pg.

–

)

,

,

.

,

,

, vol.

(pag.

–

)

,

,

,

.

,

,

, vol.

pg.

.