INVESTIGACIÓN BÁSICA

Respuesta de la hormona del crecimiento al péptido liberador de la hormona del crecimiento-2 en ratones Little deficientes de la hormona del crecimiento

Cibele N. PeroniI; Cesar Y. HayashidaII; Nancy NascimentoI; Viviane C. LonguiniII; Rodrigo A. ToledoII; Paolo BartoliniI; Cyril Y. BowersIII; Sergio P.A. ToledoII

Departamento de Biotecnología, Comisión Nacional de Energía Nuclear (IPEN-CNEN), Cidade Universitária, São Paulo/SP, Brasil
IIFaculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, Departamento de Medicina, Endocrinología, Unidad de Genética Endocrina/LIM 25, São Paulo/SP, Brasil
IIITulane University Health Sciences Center, Department of Medicine, Division of Endocrinology, Endocrine Section, New Orleans, LA/USA

ABSTRACT

OBJETIVO: Investigar una posible acción directa, liberadora de la hormona del crecimiento, independiente de la hormona del crecimiento, GHRP-2, en las células somatotropas hipofisarias en presencia de receptores inactivos de la hormona liberadora del crecimiento.
MATERIAL Y MÉTODOS: Se compararon las respuestas de la hormona de crecimiento sérica a la inyección aguda de P-2 liberadora de la hormona de crecimiento en ratones lit/lit, que representan un modelo de deficiencia de GH derivada de receptores de la hormona liberadora de la hormona de crecimiento mutados, con las observadas en los compañeros de camada heterocigotos (lit/+) y en ratones C57BL/6J de tipo salvaje (+/+).
RESULTADOS: Tras la administración de 10 mcg de P-2 liberador de la hormona del crecimiento a ratones lit/+, se observó una liberación de hormona del crecimiento de 9,3±1,5 ng/ml en comparación con 1,04±1,15 ng/ml en los controles (p<0,001). En comparación, se indujo una liberación intermedia de hormona del crecimiento de 34,5±9,7 ng/ml y una mayor liberación de hormona del crecimiento de 163±46 ng/ml en los ratones lit/+ y en los ratones de tipo salvaje, respectivamente. Por lo tanto, la GHRP-2 estimuló la hormona del crecimiento en los ratones lit/lit, y la liberación de la hormona del crecimiento in vivo puede ser sólo parcialmente dependiente de la hormona liberadora de la hormona del crecimiento. Además, se evaluaron los niveles de leptina y grelina en plasma en los ratones lit/lit en condiciones basales y estimuladas.
CONCLUSIONES: Aquí hemos demostrado que los ratones lit/lit, que albergan una mutación en la línea germinal del gen de la hormona liberadora de la hormona del crecimiento, mantienen una elevación limitada pero estadísticamente significativa de la hormona del crecimiento tras la estimulación exógena con GHRP-2. Los presentes datos reflejan probablemente un efecto directo, independiente de la hormona del crecimiento, sobre la estimulación de la hormona del crecimiento S (ghrelina) en los somatotropos hipofisarios restantes de los ratones pequeños que está mediado por la hormona del crecimiento S-R 1a.

Palabras clave: Grelina; GH; GHRH-R; GHRP-2; Leptina; Ratón pequeño.

INTRODUCCIÓN

La síntesis y secreción de la hormona del crecimiento (GH) están reguladas principalmente por las hormonas hipotalámicas hormona liberadora de GH (GHRH) y somatostatina por la retroalimentación negativa de GH e IGF-I y por la hormona endógena natural liberadora de GH grelina (1-8). La maduración normal de los somatotropos, la proliferación y el crecimiento y desarrollo somáticos requieren GHRH (9). En las últimas fases de diferenciación de las células somatotropas, la GHRH activa Gs alfa, AMPc y la vía de la proteína quinasa A a través de su receptor de membrana celular GHRH-R (1,10,11). Por el contrario, la grelina, que se aisló inicialmente del estómago y del amus hipotalámico de la rata, actúa a través del receptor de la hormona del crecimiento (GHS-R 1a), que está acoplado a miembros de la familia Gq/i y activa la fosfolipasa C (2,12,13).

Los SAM sintéticos son agonistas del receptor de grelina que estimulan la secreción de GH in vitro e in vivo. Incluyen péptidos liberadores de GH (GHRP), como el GHRP-2, y compuestos no peptídicos. Los GHS sintéticos y la ghrelina también estimulan la liberación de ACTH/cortisol y prolactina a través de efectos hipotalámicos y se ha demostrado que aumentan la ingesta de alimentos, el gasto energético, el sueño y el tono cardíaco (15-17). Aunque sus estructuras químicas varían, todos los SGAs parecen actuar a través del SGA-R para aumentar la secreción de GH y la ingesta de alimentos. Se ha identificado el ARNm del GHS-R en la glándula pituitaria, en el núcleo arqueado del hipotálamo y en otros tejidos (6,15-17). Para una estimulación máxima de la GH, las GHRP requieren una secreción simultánea de GHRH hipotalámica (18-21). Además, la ghrelina y los GHS sintéticos potencian la producción de AMPc inducida por la GHRH y aumentan los niveles de varios GHRH-R, lo que también puede dar lugar a interacciones alteradas entre los GHS-R y la GHRH (22-25). En este contexto, puede producirse una acción dual y complementaria de la ghrelina y la GHRP sobre el hipotálamo y la hipófisis. Además, cabe mencionar un efecto paracrino sobre el núcleo arqueado del hipotálamo, que participa en la regulación de la ingesta de alimentos y del gasto energético (17).

El lugar de acción predominante de los SAM para la secreción de GH no se ha establecido completamente. Se han identificado GHS-Rs tanto en la hipófisis como en el hipotálamo, y los GHSs pueden actuar en uno o en ambos sitios. Algunas evidencias indican que la acción secretora de GH de los SGAs y la ghrelina puede ocurrir principalmente en el hipotálamo, con un efecto directo marginal en la glándula pituitaria (25-27). En consecuencia, se documentó por primera vez una elevación limitada pero estadísticamente significativa de la GH (p<0,05) tras un estímulo agudo con GHRP2 en pacientes con deficiencia de GH y baja estatura resultante de una mutación en la línea germinal del gen GHRH-R (28). Poco después, otros estudios apoyaron estos hallazgos iniciales (29,30), lo que indica una acción directa de la GHRP-2 en la hipófisis. La clonación del gen del receptor de la hormona liberadora de la hormona del crecimiento (ghrhr) en el ratón y en el ser humano se llevó a cabo tras el hallazgo de que diferentes mutaciones análogas a la mutación inactivadora de la ghrhr Asp60Gly de los ratoncitos con deficiencia de GH también se producían en los seres humanos con deficiencia de GH (31-37). La mutación ghrhr en ratones lit/lit resultó en una completa falta de liberación de GH mediada por GHRH, lo cual fue reportado además por el hallazgo de que la proteína GHRH-R mutada no se unía a GHRH (32,33). Como se esperaba, la falta completa de una respuesta de GH a GHRH1-29NH2 ha sido reportada en ratones pequeños (38-40). La falta completa de una respuesta de GH a GHRP-6 también fue reportada en ratoncitos (41). Sin embargo, debido a que los SGAs actúan específicamente a través del SGA-R, es razonable asumir que una respuesta de GH puede ocurrir en respuesta a un desafío de SGA en ratoncitos. En apoyo de esta hipótesis, se ha demostrado que la GHRP-2 aumenta la liberación de GH de las pituitarias de rata in vitro, incluso después de bloquear el GHRH-R mediante el enfoque de oligonucleótidos antisentido (42).

El ratoncito es un modelo animal establecido para evaluar los efectos directos e independientes de la GHRH de los SGA y la grelina en las células somatotropas hipofisarias (33-35). Aquí evaluamos la respuesta de la GH a la GHRP-2 en ratoncitos (lit/lit), sus compañeros de camada heterocigotos (lit/+) y los controles de tipo salvaje (+/+). Además, un posible papel de GHRH y GHRH-R en la secreción y la acción de la grelina se evaluó mediante la medición de los niveles de grelina en plasma en ayunas y alimentado y leptina sérica en estos animales.

MATERIALES Y MÉTODOS

Animales y condiciones de alojamiento

Los ratones pequeños (C57BL/6J lit/lit) y sus compañeros de camada heterocigotos (lit/+) se adquirieron en The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, EE.UU.), y se estableció una colonia de cría en nuestro animalario (43). Los ratones mutantes se produjeron apareando hembras C57BL/6J lit/+ con machos C57BL/6J lit/+. En los ensayos se utilizaron ratones de ambos sexos con 45-90 días de edad. Como controles, se utilizaron ratones C57BL de tipo salvaje (+/+), obtenidos en la División de Medicina Tropical de la Facultad de Medicina de la Universidad de São Paulo (São Paulo, Brasil), a los 45-90 días de edad (peso corporal ,30 g). Los pesos corporales de los ratones lit/lit y lit/+ fueron de aproximadamente 10-12 g y 20-25 g, respectivamente, a la misma edad y se obtuvieron por un método sensible (43).

Los ratones se mantuvieron en una sala climatizada a una temperatura de 24±1ºC. El agua y la comida se proporcionaron ad libitum, y la luz se reguló en un horario de 12 horas de luz/12 horas de oscuridad.

Un grupo de ratones se mantuvo en condiciones de ayuno retirando la comida por la tarde, aproximadamente a las 17:00 h. Se recogió sangre de los grupos de ratones ayunados y no ayunados al día siguiente a las 09:00 h. Se proporcionó agua ad libitum a los ratones ayunados (43).

Esta investigación fue aprobada por el comité de ética local y cumplió los criterios para los experimentos con animales.

Análisis de secuenciación

Se realizó el genotipado para confirmar y caracterizar genéticamente a los ratones lit/lit, lit/+ y wt/wt. Los ratones fueron genotipados mediante la amplificación por PCR del ADN de la cola aislado utilizando el protocolo estándar de fenol de nuestro laboratorio (44,45). Se utilizaron dos cebadores, 5′-TGAGCTTGCATGTCTTCA GG-3′ y 5′-GGGATTAGACCAGCCAGTGA-3′ (temperatura de recocido, 60ºC), para amplificar la región del gen de la mutación ghrhr Asp60Gly que da lugar al fenotipo del ratón pequeño (24). El análisis de la mutación se realizó mediante secuenciación automatizada utilizando el Big Dye Terminator v3.1 (310 Sequencer, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

Se analizaron las cadenas directa e inversa en muestras de ADN duplicadas. Se utilizaron dos programas de software de edición de secuencias (Gene StudioTM Professional Edition, Suwanee; y Mutation Surveyour, Softgenetics, PA, USA) para identificar las anomalías del ADN.

Preparaciones e inyecciones

GHRP-2 (200 µg/ml; lote KP102-HQ007; Pramorelin: D-alanil-3-(2-naftilo)-D-alanil-L-alanil-L-triptofilo-D-fenilalanil-L-lisinamida dihidrocloruro) se obtuvo de Fujisawa USA, Inc. (Deerfield, IL). Los ratones recibieron inyecciones intraperitoneales (i.p.) y se pesaron. Dep terminación del diseño experimental, se recogieron muestras de sangre del seno orbital para las mediciones de GH, IGF-I, leptina o grelina.

Los niveles séricos de GH de ratón (mGH) se determinaron mediante un RIA específico de la casa, altamente sensible, utilizando reactivos obtenidos del Dr. A. F. Parlow del National Hormone and Pituitary Program (NHPP, Torrance, CA) (46). Todas las muestras se analizaron por duplicado. En cada ensayo, se utilizaron grupos de sueros de ratones wt/wt C57BL y lit/lit como controles internos. Se utilizaron ocho ratones de cada cepa, y el nivel sérico conjunto (n = 8) de GH fue de 1,3±0,7 ng/ml en los ratones lit/lit y de 6,5±1,8 ng/ml en los ratones wt/wt C57BL. Los niveles iniciales de GH en los ratones lit/+ no fueron significativamente diferentes de los de los ratones wt/wt C57BL, probablemente debido al número de animales. La sensibilidad del ensayo de GH, que se realizó mediante una adición retardada del trazador, fue de 0,25±0,15 ng/ml según la definición de Rodbard (47). El coeficiente de variación entre ensayos fue inferior al 10%.

Los niveles de IGF-I se determinaron por duplicado utilizando un kit RIA de IGF-I de rata (DSL-2900, Diagnostic Systems Laboratories Inc., Webster, Texas, EE.UU.) con un nivel mínimo de detección de 21 ng/ml y concentraciones medibles que oscilaban entre 150 y 4.500 ng/ml.

Los niveles de leptina se determinaron utilizando un kit RIA de leptina de rata (Linco Research Inc., St. Charles, MO, USA) con un valor mínimo de detección de 0,2 ng/ml y un rango de concentración medible de 0,2-12,8 ng/ml.

Los niveles totales de grelina (octanoilada + desoctanoilada)(48) se determinaron utilizando un kit RIA de grelina de rata (Phoenix Pharmaceuticals Inc., Belmont, CA, EE.UU.) con una sensibilidad de ~5,4 pg/tube y un rango de 1-128 pg/tube. Los niveles de grelina activa (octanoilada) se determinaron con el kit Linco Research (St. Charles, MO). Para estas mediciones, las muestras de sangre se recogieron en tubos que contenían 0,78 mg de K2EDTA (250-500 ml de sangre/tubo), se mantuvieron en hielo y se centrifugaron en una centrífuga refrigerada. A las muestras de plasma se les añadió PMSF (0,1 mg/ml de plasma) y HCl 1 M (50 ml/ml de plasma). Las muestras se mantuvieron congeladas a -70ºC hasta que se midieron los niveles de grelina. Para el kit de grelina activa, los coeficientes de variación intra e inter-ensayo fueron de 6,5-9,5% y 9,6-16,2%, respectivamente. Para el kit de grelina total, los coeficientes de variación intra e inter-ensayo fueron <10% y <15%, respectivamente.

Diseño del estudio

Dos grupos de ratones C57BL de tipo salvaje (+/+) emparejados por edad fueron inicialmente inyectados i.p. con 1 µg (32 animales/grupo) o 10 µg (18 animales/grupo) de GHRP-2, y se recogieron muestras de sangre para las mediciones de GH en diferentes momentos hasta 1 h después de la inyección. Se utilizaron tres ratones para cada punto de tiempo, y la sangre se extrajo una sola vez antes de sacrificar a los animales. En un estudio piloto, se administraron 10 µg de GHRP-2 i.p. a 2-3 ratones lit/lit, lit/+ y (wt/wt) (n = 18 animales/grupo), y se midió la respuesta de GH en diferentes momentos hasta 1 hora después de la inyección para evaluar los efectos de la dosis y el momento.

Se realizó un estudio independiente de dos semanas con ratones lit/wt tratados diariamente con 10 µg de GHRP-2 i.p. por ratón (n = 6 ratones para el control y n = 8 ratones para el grupo experimental). Se midió el peso corporal y se extrajo sangre cada 3-4 días para medir los niveles de GH, IGF-I y leptina. Como se ha descrito anteriormente, el peso corporal se midió utilizando una metodología precisa y altamente sensible (40). Brevemente, el peso corporal de los animales se midió diariamente a lo largo de todo el experimento y luego se utilizó para calcular las curvas de crecimiento individuales; las pendientes de las curvas de crecimiento se utilizaron entonces como parámetros de respuesta. En el caso de los ratones iluminados/iluminados, la variación de peso diaria aceptable en los últimos diez días antes de cada ensayo (período previo al ensayo) estaba dentro de 0,0025±0,0045 g/día (36,40). Así pues, se rechazó aproximadamente el 10% de la población de ratones enanos homocigóticos. Nuestros criterios de selección de los ratones lit/lit se basaron en las curvas de crecimiento de los ratones homocigotos (lit/lit) y heterocigotos (lit/+) de la cepa C57BL/6J, que ya se habían establecido en un estudio anterior (36) y se confirmaron además con la genotipificación realizada aquí.

Para evaluar y comparar las áreas bajo la curva de los valores hormonales, se definió una unidad arbitraria de concentración (ng/ml/tiempo (min)).

Estadística

Para analizar los niveles de leptina y las respuestas hormonales medidos por los datos del área bajo la curva (AUC), se realizó un análisis de varianza (ANOVA) de dos vías con el tiempo y el tratamiento como variables independientes. Se utilizó la prueba t de Student con el ajuste de Bonferroni para todos los valores obtenidos tras el inicio del tratamiento. En todas las demás mediciones, se utilizó la prueba t emparejada de Student para evaluar la significación de las diferencias. p,0,05 se consideró significativa.

RESULTADOS

Análisis de mutaciones en el genHr

Se extrajo el ADN de una muestra de sangre de un ratón iluminado/iluminado utilizando métodos rutinarios descritos en otro lugar (44,45). Se llevó a cabo la PCR utilizando los cebadores descritos anteriormente, seguida del análisis de la secuencia del gen ghrhr.

Se confirmó una mutación de línea germinal ghrhr Asp60Gly en el ratón lit/lit, mientras que se verificó una mutación heterocigótica ghr Asp60Gly en los compañeros de camada lit/+. Por el contrario, los ratones C57BL/6J de tipo salvaje (+/+) no albergaban esta mutación en la línea germinal (Figura 1). Estos datos confirmaron los genotipos de los tres linajes de ratones utilizados en el presente estudio, respectivamente: +/+, Asp60Asp; lit/+, Asp60Gly y lit/lit, Gly60Gly (Figura 1).

Niveles basales de GH e IGF-I en ratones normales y homocigotos

Los niveles medios basales de mGH en los 18 ratones homocigotos lit/lit (1,16±0,97 ng/ml; rango, 0,28-4.0 ng/ml) fueron significativamente más bajos que los observados en los 46 controles de tipo salvaje (+/+) (5,36±2,60 ng/ml; rango, 1,05-14,0 ng/ml; p<0,001) o sus 12 compañeros de camada heterocigotos (lit/+) (6,60±2,35 ng/ml; rango, 4,25-11,5 ng/ml; p<0,001). Además, las concentraciones basales de GH observadas en los ratones lit/+ y +/+ no difirieron significativamente.

El valor de IGF-I sérico basal en los 8 ratones lit/lit (231±103 ng/ml; rango, 120-420) fue claramente inferior al de los 8 controles +/+ (473±104 ng/ml; rango, 330560 ng/ml; p<0,001).

Respuesta de la GH a la administración aguda de GHRP-2

Inicialmente se demostró que el aumento de la GH en los ratones de control de tipo salvaje C57BL en respuesta a 1 µg de GHRP-2 era significativamente menor (aumento de ~dos veces sobre los niveles basales) que el aumento en respuesta a 10 mg de GHRp-2 i.p. (aumento de 24 veces sobre los valores basales; p<0,05). Así, se seleccionó la dosis de 10-µg de GHRP-2 para la evaluación de las respuestas a la GH en los tres grupos de ratones (+/+, lit/+ y lit/lit).

La respuesta media máxima de GH en el grupo de control (+/+) fue de 163 ng/ml, y se produjo 10 minutos después de la administración de GHRP-2 con un aumento de 24 veces sobre los niveles basales (Figura 2). En los ratones lit/+ y lit/lit se produjo una respuesta significativa de la GH a la GHRP-2 a los 5-10 min. Veinte minutos después de la inyección de GHRP-2, los niveles de GH volvieron a los valores basales.

Estos datos indican que la respuesta de GH a 10 µg de GHRP-2 (9,3±1,5 ng/ml; rango 8-11 ng/ml) observada en los ratones homocigotos lit/lit fue significativamente mayor que la de los ratones lit/lit inyectados con solución salina (1,04±1,15 ng/ml; p<0,001). Además, la respuesta de la GH a la GHRP-2 en los ratones lit/lit fue significativamente menor que la observada en los compañeros de camada heterocigotos (lit/+) (9,3±1,5 ng/ml frente a 34,5±9,7 ng/ml; p<0,01) o en los ratones de tipo salvaje ( +/+) (163±46 ng/ml; p<0,005). Así, la respuesta de la GH a la GHRP-2 en los ratones lit/+ fue intermedia a las observadas en los ratones lit/lit y +/+ (Figura 2).

Los incrementos absolutos de GH sobre la línea base en los ratones lit/lit, lit/+ y +/+ fueron de 8,3, 28,8 y 156 ng/ml, respectivamente, lo que confirma las marcadas diferencias en la secreción de GH entre las tres cepas de ratones estudiadas. El aumento del nivel de GH sobre la línea de base tras la administración aguda de 10 µg de GHRP-2 no difirió significativamente entre los ratones lit/lit y lit/+ (8,9-vs. 6,1 veces; p>0,05). Sin embargo, el aumento de GH en respuesta a GHRP-2 disminuyó significativamente en los ratones lit/lit (p<0,005) y lit/+ (p<0,01) en comparación con los controles. Las áreas individuales bajo la curva (AUC) de la GH sérica en respuesta a la administración aguda de GHRP-2 confirmaron además las diferencias significativas entre los ratones lit/lit tratados con GHRP-2 y con solución salina (Figura 3).

Respuesta a la administración de GHRP-2 durante dos semanas

Como se esperaba, se observó un marcado aumento del peso corporal en los ratones lit/lit cuando se inyectaron 10 µg de GHRP-2 i.p. (49) una vez al día durante dos semanas en comparación con la inyección del vehículo de control (p<0,02; Figura 4). Sin embargo, los niveles de GH e IGF-I no aumentaron significativamente durante la administración de GHRP-2 durante dos semanas (datos no mostrados). Además, se observaron niveles de leptina notablemente elevados (p<0,005) en los ratones iluminados/iluminados el día 15 del tratamiento con GHRP-2.

Niveles de grelina y leptina en suero

Las concentraciones de acil grelina y grelina total (acil + deacil) en plasma, que pueden tener acciones biológicas independientes e interrelacionadas, y las concentraciones de leptina en suero en los ratones +/+, lit/+ y lit/lit en estado de ayuno y alimentación se muestran en la Tabla 1. En el estado de ayuno, los niveles plasmáticos medios de acil grelina y grelina total en los ratones lit/lit fueron significativamente menores (un 78,9% y un 37,6%, respectivamente) que en los ratones +/+. Los ratones heterocigotos lit/+ también tenían niveles significativamente más bajos de acil grelina y grelina total en ayunas (un 80,5% y un 44,9%, respectivamente) en comparación con los controles. En los ratones lit/+, la acil grelina plasmática en el estado alimentado era un 93,8% mayor que en el estado de ayuno. Por el contrario, en los ratones de tipo salvaje, la acil grelina plasmática fue un 82,5% menor (p<0,001), y la grelina total fue un 61% menor (p<0,001) en el estado alimentado que en el estado de ayuno. La diferencia en los niveles de acil grelina en plasma en estado de alimentación entre los dos grupos (157±70 pg/ml para los ratones +/+ frente a 67±18 pg/ml para los lit/lit) fue significativa (p<0,05). Además, los niveles totales de grelina fueron un 23,4% mayores en el estado de ayuno que en el de alimentación para los ratones lit/lit.

Los niveles séricos de leptina de los ratones lit/lit en ayunas fueron un 348% más altos que los de los ratones +/+ en ayunas (p<0,005). Los ratones lit/+ en ayunas también se diferenciaron de los ratones lit/lit (un 50% menos, p<0,02) y +/+ (un 123% más, p<0,005). Además, en los ratones lit/lit, los niveles séricos de leptina en el estado de alimentación disminuyeron un 35% en comparación con el estado de ayuno (p>0,05). Además, los niveles de leptina en los ratones alimentados lit/+ y +/+ fueron un 37% y un 16% mayores que en los animales en ayunas, respectivamente (p>0,05).

DISCUSIÓN

Se han documentado varias mutaciones germinales homocigóticas espontáneas en ratones que dan lugar a la deficiencia de hormonas hipofisarias y al enanismo (34). Así, los fenotipos de los ratones enanos de Ames resultan de mutaciones en el gen Prop1 y presentan una deficiencia congénita de múltiples hormonas hipofisarias, incluida la GH (50). Además, los ratones enanos Snell con mutaciones en el gen pit presentan enanismo por deficiencia de GH, hipotiroidismo e infertilidad (51). Además, el fenotipo de los ratones pequeños resulta de mutaciones homocigóticas en el gen ghrh-r (33). Se han notificado mutaciones homocigóticas equivalentes en la línea germinal de los genes PROP1, PIT y GHRH-R en seres humanos que presentan una estatura baja grave (37,52,53).

Por lo que sabemos, ningún otro trabajo hasta la fecha ha vuelto a investigar específicamente esta cuestión en ratoncitos. Cabe destacar que se ha documentado una resistencia completa de la GH a la GHRP-2 en ratones ghrh-knockout. Sin embargo, los ratones ghrh-knockout y los ratoncitos tienen mutaciones en diferentes genes, aunque sus fenotipos son similares. Además, diferentes métodos de GH y condiciones experimentales pueden haber influido en estos resultados aparentemente contradictorios.

Respuestas de GH a GHRP-2

El desarrollo y la función de las células somatotropas son dependientes de GHRH (1), como indican nuestros hallazgos de una respuesta limitada de GH a la administración aguda de GHRP-2 en ratones lit/lit que llevan una mutación homocigótica en ghr. Asumiendo que la ghrhr está completamente inactiva en los ratones lit/lit (39), nuestros presentes hallazgos indican que al menos una parte de la liberación de GHS-GH independiente de la GHRH se produce a través de la activación del GHS-R.

Además de somatotrofos maduros dependientes de GHRH, se han encontrado células madre productoras de GH en las glándulas pituitarias de ratones lit/lit y en ratones adultos de 60 días (26).

Sin embargo, no se sabe si la GHRP-2 y/o la ghrelina actúan como factor trófico para las células madre productoras de GH independientemente de la acción hipofisaria de la GHRH.

La falta de respuesta a la GH en ratones iluminados/iluminados a otro tipo de GHS, la GHRP-6 (41), que se había comunicado anteriormente, puede estar relacionada con el uso de un ensayo de GH menos sensible (10 ng/ml frente a 0,25 ng/ml en nuestro ensayo). Además, la GHRP-2 tiene una mayor potencia biológica (aproximadamente seis veces mayor) que la GHRP-6 para desencadenar la liberación de GH (14-16). La ausencia de respuestas de GH a GHRP-6 también se sugirió inicialmente en humanos con una mutación Glu72Stop GHRH-R (42). Sin embargo, otros estudios han documentado la presencia de una respuesta de GH estadísticamente significativa, aunque alterada, a GHRP-2 en pacientes con baja estatura genética que albergan un gen GHRHR severamente truncado (28-30).

Además, no se observaron elevaciones agudas ni crónicas de GH en ratones ghrh-knockout, y se concluyó que la GHRP-2 tiene un efecto estimulante del crecimiento que aumenta la respuesta inducida por JI-38 (55,56). Sin embargo, es importante señalar que a) los ratones knockout y los animales que albergan mutaciones espontáneas de la línea germinal similares o incluso equivalentes pueden comportarse de forma diferente; b) los métodos de mGH utilizados para estudiar los ratoncitos y los ratones knockout podrían ser diferentes; y c) en estos estudios se utilizaron diseños experimentales diferentes (28-30,55,56).

Las respuestas intermedias de la GH a la GHRP-2 en los ratones lit/+ pueden ser el resultado de diferencias cualitativas y/o cuantitativas en las células somatotrofas, aunque deben realizarse más investigaciones sobre este tema para confirmar estos hallazgos. Estos datos pueden sugerir un efecto genético de dosificación en la función de las células somatotropas, que se vería más deteriorada en función de la edad. De forma similar, se propuso previamente un efecto genético de dosis para los casos portadores de una mutación en el gen GHRHR (52).

Es importante destacar que nuestro método RIA de GH fue capaz de detectar la presencia de niveles muy bajos de GH (~0,25 ng/ml) en ratoncitos con una precisión aceptable; rara vez se dispone de datos similares en la literatura. Otros han utilizado kits de GH con sensibilidades más bajas. Sin embargo, no se encontraron otros reportes que abordaran los niveles de GH en suero de ratones lit/lit obtenidos por un RIA homólogo específico. Cheng et al. reportaron niveles de GH en suero de 0.61±0.09 ng/ml en ratones lit/lit macho y hembra y 8.50±0.75 ng/ml y 2.85±0.33 ng/ml en ratones lit/+ macho y hembra, respectivamente. Marmary et al. informaron de niveles séricos de GH de 1,08±0,06 ng/ml y 20,35±22,9 ng/ml en ratones enanos Snell y sus compañeros de camada de control, respectivamente (58). También se han comunicado estimaciones elevadas del nivel absoluto de GH en suero determinadas mediante un RIA de GH de rata heteróloga (59,60).

Crecimiento tras la administración de GHRP-2

En este estudio, se observó un aumento definitivo del peso corporal de los ratoncitos tras la administración de GHRP-2.

Estos hallazgos están de acuerdo con otros estudios que documentaron un aumento significativo del peso corporal en ratones ghrh-knockout tratados con GHRP-2 y en ratones tras la administración de ghrelina, lo que demuestra que ambos péptidos inducen adiposidad en estos animales (61). Cabe destacar que Alba et al. no observaron un aumento del crecimiento longitudinal de los ratones ghrh-knockout durante un tratamiento de seis semanas con GH RP-2 a una dosis de 10 µg inyectada por vía subcutánea (s.c.) dos veces al día, lo que confirmó el papel fundamental de la GHRH en la secreción de GH y el posterior crecimiento corporal (48). Además, un tratamiento crónico de seis semanas con 10 µg s.c. de GHRP-2 no aumentó la respuesta aguda de GH (30 minutos). Esta discrepancia de los padres con nuestros hallazgos puede haber sido el resultado de las diferencias en el tiempo de recogida de sangre o la sensibilidad del ensayo de GH, los diferentes métodos de administración del fármaco (s.c. vs. i.p.), o una combinación de estos factores.

Niveles de leptina y grelina en los ratones iluminados/iluminados

También evaluamos si la GHRP-2 influiría en los niveles de leptina y grelina.

Los niveles en ayunas de acil grelina y grelina total fueron mayores en los ratones de tipo salvaje +/+ que en los ratones alimentados (61-63). La regulación fisiológica de la grelina plasmática (es decir, su aumento y disminución en los estados de ayuno y alimentación, respectivamente) fue diferente en los ratones iluminados/iluminados. Este hallazgo puede ser el resultado de una falta de efecto de la acción de la GHRH y su inactiva GHRH-R, aunque esta hipótesis debe ser probada más a fondo.

También se han observado niveles elevados de leptina sérica basal y un aumento adicional tras la administración prolongada de GHRP-2 en ratones lit/lit en ratones tratados con ipamorelina (34). Se considera que estos hallazgos reflejan el aumento de la masa de tejido adiposo en los ratones con deficiencia de GH y el efecto adipogénico de la GHRP-2 y la grelina (61-63).

Para investigar los efectos lipogénicos de estos péptidos en ratones, las dosis de GHRP-2 utilizadas en el presente estudio fueron similares a las utilizadas por Tschop et al. y a las dosis de GHRP-6 utilizadas por Jansson et al. y Lall et al. (38,49,61). Sin embargo, basándose en el peso corporal, dichas dosis fueron proporcionalmente mucho más altas que las probadas en humanos con una mutación de GHRH-R, lo que podría reflejar diferencias entre especies en la sensibilidad a los SGA (61).

Nuestros limitados datos sobre los niveles de ghrelina octanoil (ghrelina) y leptina sérica en ratones de tipo salvaje (+/+) y lit/lit (-/-) alimentados frente a los ayunados (17 h) pueden sugerir relaciones disfuncionales entre estas dos hormonas metabólicas. Como se esperaba, los niveles de grelina en plasma fueron normales en los ratones de tipo salvaje alimentados y elevados en los ratones de tipo salvaje en ayunas, aunque también se observó el efecto contrario, ya que la grelina y la leptina se elevaron en el estado alimentado y no aumentaron más en el estado de ayuno. Además, los resultados en los ratones lit (+/-) fueron parcialmente paralelos a los obtenidos en los ratones lit (-/-) en el sentido de que los niveles plasmáticos de grelina no aumentaron con el ayuno, y durante el ayuno, los niveles séricos de leptina permanecieron elevados en los ratones lit (+/-y -/-) alimentados y ayunados. Sin embargo, el limitado número de animales estudiados impidió sacar más conclusiones. Por último, la medición de la ghrelina total como indicador de los niveles de octanoil ghrelina puede ser problemática. Aunque los niveles de ghrelina total y octanoilada pueden ser parcialmente paralelos, esta concordancia se hace menos evidente en condiciones fisiopatológicas, como en el presente estudio con ratones. Cada vez hay más pruebas que apoyan la actividad biológica de la molécula de ghrelina desoctanoylada y, por tanto, apoyan a su vez la medición de los niveles de ghrelina desoctanoylada en plasma mediante un ensayo específico, como el publicado por Akamizu et al. (64).

En conclusión, nuestros hallazgos son los primeros en documentar la presencia de aumentos estadísticamente significativos de GH tras la administración de GHRP-2 en ratoncitos. Los datos dan más apoyo a una acción directa de GHRP-2 en las glándulas pituitarias de los ratoncitos. Además, los ratones heterocigotos lit/+ pueden presentar sutiles alteraciones en su eje GHRH/GHRH-R/GH, lo que sugiere un efecto genético de dosificación, aunque se necesitan datos adicionales para confirmar esta conclusión.

CONSEJOS

Damos las gracias a Cristina T. Kanamura, B.S., y Venâncio A. F. Alves, M.D., de la División de Patología, Instituto Adolfo Lutz, São Paulo, por el apoyo técnico. Nos gustaría agradecer al Dr. Heitor F. Andrade Jr. que proporcionó los animales C57BL wt/wt. Esta investigación fue parcialmente apoyada por la FAPESP (01/11091-0). S.P.A.T. y P.B. son investigadores del Consejo Nacional de Investigación (CNPq). RAT es beneficiario de una beca posdoctoral de la FAPESP (2009/15386-6). SPAT es beneficiario de una beca y subvención del CNPq (401990/2010-9).

CONRIBUCIONES DEL AUTOR

Peroni CN, Nascimento N, y Bartolini P realizaron los experimentos y colaboraron en la preparación del manuscrito. Hayashida CY colaboró en la redacción del manuscrito. Toledo RA y Longuini VC realizaron los análisis genéticos. Bowers CY colaboró con las pruebas del producto (ghrp-2), las mediciones de grelina y leptina y la preparación del manuscrito. Toledo SP escribió y coordinó el proyecto de investigación y fue el investigador principal responsable de la preparación del manuscrito.

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