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Yersinia pestis é o agente etiológico da peste e tem potencial para uso como arma biológica (1, 13, 17-20, 23). Por isso, é importante que a resistência às drogas emergentes, sejam elas naturais ou artificiais, seja detectável usando métodos padronizados que são facilmente implementados em múltiplos laboratórios. O Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) descreve um método de microdiluição de caldo de referência (BMD) para testes de susceptibilidade antimicrobiana de Y. pestis e fornece diretrizes interpretativas da MIC para oito agentes antimicrobianos (6). BMD utiliza caldo Mueller-Hinton ajustado a catiões (CAMHB) e requer incubação a 35°C por 24 h com opção de incubação por 48 h quando o crescimento às 24 h é insuficiente para a interpretação do ponto final. Infelizmente, o BMD de referência é difícil de incorporar em muitos laboratórios porque é relativamente caro e trabalhoso e requer o armazenamento de painéis em formato congelado ou desidratado. Existem vários métodos alternativos de teste de susceptibilidade, incluindo os métodos de difusão em disco e Etest. Entretanto, antes que esses métodos possam ser empregados para uma espécie, eles devem ser avaliados e comparados ao BMD para determinar correlações entre os resultados obtidos por comparação dos métodos.

Y. isolados de pestis são fastidiosos e podem crescer mais lentamente em meios artificiais do que outras espécies comuns de Enterobacteriaceae, e assim os métodos de teste de susceptibilidade para Y. pestis têm sido difíceis de padronizar. Vários métodos estão descritos na literatura. O teste de difusão em disco tem sido geralmente realizado em ágar Mueller-Hinton (MHA), normalmente usando 48 h de incubação a 35°C, mas às vezes faltam descrições metodológicas em detalhes (10, 16, 24). O método Etest foi empregado por Wong et al. (25) usando MHA com 5% de sangue de ovelha, incubação a 35°C, e um inóculo correspondente a um não. 1 McFarland ao invés do padrão 0,5 McFarland usado na maioria dos estudos de difusão em disco ou Etest. A diluição em ágar, utilizando MHA incubada a 27° a 30°C durante 48 h, é o método mais comum relatado na literatura (7, 8, 11, 12, 22). Os métodos de macrodiluição e microdiluição do caldo também têm sido utilizados com várias temperaturas de incubação (2, 21).

Existem vários atributos de difusão em disco e métodos de Etest que os tornam métodos alternativos atraentes para testes de susceptibilidade, incluindo facilidade de armazenamento e uma longa vida útil para os discos e tiras. Além disso, estes são métodos baseados em ágar e os pontos finais podem ser mais fáceis de ler do que os do BMD. O Etest tem o benefício adicional de produzir um resultado MIC. Neste relatório, apresentamos resultados de um estudo multicêntrico comparando os métodos Etest e de difusão em disco com o método de referência CLSI BMD para testes de susceptibilidade de Y. pestis.

(Este relatório foi apresentado em parte na 107ª Reunião Geral da Sociedade Americana de Microbiologia, Toronto, Canadá, 21 a 25 de Maio de 2007.)

Vinte e seis cepas diversas de Y. pestis do Centers for Disease Control and Prevention (CDC) e do U.S. Army Medical Research Institute of Infectious Diseases (USAMRIID) foram testadas por ambos os métodos Etest e BMD em quatro locais de teste e, adicionalmente, por difusão em disco em dois desses locais. Seis cepas eram biovar Antiqua, sete eram biovar Medievalis e 12 eram biovar Orientalis; uma isolada atípica não pôde ser atribuída a nenhum biovar. Os agentes antimicrobianos foram testados por BMD e Etest (bioMérieux, Durham, NC), e as suas gamas correspondentes foram as seguintes para BMD e Etest, respectivamente: para cloranfenicol, 0,03 a 64 μg/ml e 0,016 a 256 μg/ml; para ciprofloxacina, 0,03 a 64 μg/ml e 0,002 a 32 μg/ml; para doxiciclina, 0,03 a 64 μg/ml e 0.016 a 256 μg/ml; para gentamicina, 0,03 a 64 μg/ml e 0,016 a 256 μg/ml; para levofloxacina, 0,06 a 64 μg/ml e 0,002 a 32 μg/ml; para estreptomicina, 0,03 a 64 μg/ml e 0.016 a 256 μg/ml; para tetraciclina, 0,03 a 64 μg/ml e 0,016 a 256 μg/ml; e para trimetoprim-sulfametoxazol, 0,015/32 a 16/304 μg/ml e 0,002/0,038 a 32/608 μg/ml. Como os intervalos para o teste de BMD de alguns fármacos não abrangeram as concentrações mais baixas obtidas pelo teste E, a concordância essencial (± 1 diluição log2) entre os métodos foi considerada fora da escala para algumas comparações de resultados (por exemplo, um MIC de levofloxacina BMD de ≤0.06 μg/ml e um MIC de Etest de 0.03 μg/ml). No CDC, bandejas MIC de 96 poços foram preparadas usando 100 μl de CAMHB (BBL, Sparks, MD) por poço; as bandejas foram mantidas congeladas a -70°C e enviadas para os laboratórios participantes. Os testes foram realizados pelos métodos padrão CLSI para BMD e difusão em disco (4-6). As Inoculas foram preparadas de 18 a 24 culturas aeróbias cultivadas em placas de ágar sangue de ovelha a 5% (BBL) pelo método de suspensão direta em caldo Mueller-Hinton (MHB) (Remel, Lenexa, KS) para igualar um padrão de turbidez 0,5 McFarland (4); o mesmo inóculo foi usado para inocular placas de MHA de 150 mm de diâmetro para testes de Etest e difusão em disco. Imediatamente após a inoculação, pelo menos duas contagens aleatórias de colônias foram realizadas em cada local de teste com o controle de crescimento positivo de BMD, a fim de avaliar o tamanho do inóculo. Não foram aplicadas mais de quatro tiras de Etest a uma placa. Para difusão em disco, os discos comerciais (BBL) foram aplicados com um dispensador multidiscos com auto-tamping (BBL). Os painéis BMD e placas de MHA tanto para Etest quanto para difusão em disco foram incubados a 35°C e lidos em períodos de 24 e 48 horas. Os Etests foram lidos de acordo com as instruções da embalagem Etest da seguinte forma: cloranfenicol, doxiciclina, tetraciclina e trimetoprim-sulfametoxazol foram lidos com inibição de 80% para o ponto de intersecção; ciprofloxacina, levofloxacina, gentamicina e estreptomicina foram lidos com inibição de 100%. Para análise dos dados, os MICs de Etest foram arredondados para a diluição log2 mais próxima. Escherichia coli ATCC 25922 e Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 foram utilizadas para o controle de qualidade de BMD e Etest. Os MICs para cepas de controle de qualidade foram determinados por incubação durante 16 a 20 h. As faixas aceitáveis de controle de qualidade de BMD para estreptomicina foram previamente estabelecidas no CDC (dados não publicados). O controle de qualidade do teste de cloranfenicol E foi realizado testando Escherichia coli ATCC 25922 e aplicando a faixa aceitável para o CLSI BMD.

Para medir a concordância entre os resultados do teste E e BMD, foi examinada a distribuição das diferenças na diluição log2 das MICs e foi calculada a porcentagem de determinações de MICs que produziam valores idênticos (concordância essencial dentro dos limites de precisão do método de referência ) para cada droga. Também, para determinar se o método Etest produziu MICs significativamente menores ou maiores que o método de referência, realizamos um teste Wilcoxon com MICs de diluição log2 dos dois testes através do uso do software estatístico SAS (SAS Institute Inc., Cary, NC); MICs dentro de ± 1 diluição log2 foram consideradas idênticas para este teste. A comparação dos resultados da categoria interpretativa (suscetível, intermediária e resistente) foi feita calculando taxas de erros menores, maiores e muito maiores.

Em geral, os pontos finais de MIC foram mais facilmente discerníveis pelo BMD do que pelo Etest às 24 h (dados não mostrados). Em três locais de teste (A, B e C), quase todos os MICs BMD e Etest foram legíveis às 24 h de incubação; um único resultado Etest foi a exceção. O local D relatou CMB legíveis em 24 h para todas as cepas, exceto uma. Não houve crescimento suficiente para ler os MICs de 24 h do teste Etest para oito cepas no local D. Os números de MICs de Etest que não eram legíveis devido ao crescimento inadequado a 24 h por droga foram os seguintes: para cloranfenicol, n = 6; para ciprofloxacina, n = 4; para doxiciclina, n = 3; para gentamicina, n = 2; para levofloxacina, n = 5; para estreptomicina, n = 5; para tetraciclina, n = 4; e para trimetoprim-sulfametoxazol, n = 4. Todos os locais de teste foram capazes de ler todos os resultados às 48 h. Portanto, foram utilizados resultados de 48 h na comparação. A contagem de colónias demonstrou que as densidades de inóculos nos poços BMD estavam dentro dos limites aceitáveis para todos os quatro locais de teste; as médias para os locais variaram de 1,1 × 105 UFC/ml a 4,2 × 105 UFC/ml.

O MIC90 e a gama MIC para cada agente antimicrobiano foram comparados por método (Tabela 1). Para todos os medicamentos excepto o cloranfenicol, as MIC90 para todos os métodos foram as mesmas ou com uma diluição de ± 1 log2 umas das outras. A concordância de categoria entre os métodos Etest e BMD para todos os fármacos foi excelente em 97% a 100%; todos os erros foram menores (Tabela 1). Todos os MICs de BMD e Etest estavam dentro da faixa suscetível após 24 h de incubação (dados não mostrados). Em 48 h, a maioria das MICs estavam dentro da faixa de susceptibilidade, com exceção dos seguintes resultados não sensíveis: cloranfenicol (n = 2); ciprofloxacina (n = 1); e estreptomicina (n = 5). A maior parte dos resultados não-susceptíveis foram do método BMD e não do Etest (Fig. 1).