Información de fondo
La transfección de ADN por electroporación es una técnica establecida que se puede aplicar a casi todos los tipos de células. Produce una alta frecuencia de transformantes estables y tiene una alta eficiencia de expresión génica transitoria. La electroporación ha demostrado ser eficaz en la entrega de ADN plasmídico in vivo a una variedad de tipos de tejidos. La electroporación aprovecha el hecho de que la membrana celular actúa como un condensador eléctrico incapaz de pasar la corriente (excepto a través de los canales iónicos). Al someter las membranas a un campo eléctrico de alto voltaje se produce su ruptura temporal y la formación de poros lo suficientemente grandes como para permitir que entren o salgan de la célula macromoléculas (así como moléculas más pequeñas como el ATP). La reconexión de los poros de la membrana es un proceso de descomposición natural que se retrasa a 0°C.
Durante el tiempo que los poros están abiertos, el ácido nucleico puede entrar en la célula y, en última instancia, en el núcleo. El ADN lineal con extremos libres es más recombinogénico y es más probable que se integre en el cromosoma del huésped para producir transformantes estables. El ADN superenrollado se empaqueta más fácilmente en la cromatina y suele ser más eficaz para la expresión génica transitoria.
El uso de descargas eléctricas de alto voltaje para introducir ADN en las células fue realizado por primera vez por Wong y Neumann utilizando fibroblastos (Wong y Neumann, 1982; Neumann et al., 1982). Posteriormente, la técnica se generalizó (Potter et al., 1984) a todos los tipos celulares, incluso a aquellos como los linfocitos que, a diferencia de los fibroblastos, no pueden ser transfectados con otros procedimientos (p. ej, fosfato de calcio o coprecipitados de ADN DEAE-dextrano).
Oliver Smithies y sus colegas utilizaron entonces la electroporación para introducir ADN en células madre embrionarias (ES) y diseñaron vectores de orientación que permitían que el ADN introducido se recombinara con regiones homólogas del genoma e introdujera un gen alterado o una secuencia perturbadora para generar células ES con un gen específico «eliminado» o «golpeado». Las células ES alteradas se utilizaron entonces para generar los correspondientes ratones knockin o knockout. La electroporación era necesaria para estas aplicaciones de transferencia de genes porque introduce el ADN en las células en una forma desnuda que puede participar fácilmente en la recombinación homóloga. Esta extensión de la electroporación hizo que el Dr. Smithies compartiera el Premio Nobel de Medicina o Fisiología de 2007. La metodología para electroporar células ES es esencialmente la misma que para otras células de mamíferos. Si se desea una sustitución génica homóloga, hay que diseñar vectores que permitan una selección «positiva-negativa» (Bronson y Smithies, 1994; Joyner 2000) de manera que una selección recupere todas las células en las que el ADN electroprado se ha insertado en el genoma, y la segunda selección sea contra los clones de ES en los que el ADN se ha insertado al azar. A continuación, se pueden generar ratones knockin/out fusionando las células ES clonadas seleccionadas con embriones, reimplantando para permitir el desarrollo y reproduciendo las quimeras resultantes para generar ratones en los que todas las células son portadoras del gen alterado.
Aunque se ha informado de que las plantas enteras o el tejido foliar son transfectables por electroporación, las células vegetales generalmente deben convertirse en protoplastos antes de que el ADN pueda introducirse fácilmente en ellas (protocolo alternativo; Fromm et al., 1985; Ou-Lee et al., 1986). Al igual que las células de mamíferos, los protoplastos de plantas pueden ser electroporados bajo una variedad de condiciones eléctricas (parámetros críticos). Se ha utilizado tanto un alto voltaje con baja capacitancia (duración corta del pulso) como un bajo voltaje con alta capacitancia (duración larga del pulso) para lograr una transferencia genética exitosa (Chu et al., 1991). La PE in vivo se utilizó originalmente para administrar agentes quimioterapéuticos a tumores sólidos y progresó desde los estudios preclínicos hasta los ensayos clínicos (Gothelf, et al., 2003). La administración in vivo de ADN plasmídico mediante electroporación se comunicó por primera vez a principios y mediados de la década de 1990 (Titomarov, et al., 1991; Heller, et al., 1996; Nishi, et al., 1996) y fue un avance lógico basado en el éxito de las transfecciones in vitro con electroporación y en la demostración de que el procedimiento podía realizarse de forma segura in vivo cuando se administraban moléculas pequeñas como agentes quimioterapéuticos. El uso de la electroporación in vivo para la administración de ADN plasmídico ha experimentado un enorme crecimiento en el número de estudios preclínicos que se están llevando a cabo y recientemente se ha trasladado a la clínica (Heller, et al., 2006a y Bodles-Brakhop, et al.,2009).
El amplio uso de la electroporación ha sido posible en gran parte por la disponibilidad de aparatos comerciales que son seguros y fáciles de usar y que dan resultados extremadamente reproducibles. Los diseños de estas máquinas varían sustancialmente, pero se dividen en dos categorías básicas que utilizan diferentes medios para controlar la duración del pulso y el voltaje (los dos parámetros eléctricos que gobiernan la formación de poros). Un tipo utiliza un sistema de descarga de condensadores para generar un pulso de corriente que decae exponencialmente, y el otro genera una verdadera onda cuadrada (o una aproximación a ella). Los instrumentos de descarga de condensadores cargan su condensador interno a un determinado voltaje y luego lo descargan a través de la suspensión de células-ADN. Tanto el tamaño del condensador como la tensión pueden variar. Dado que el pulso de corriente es una función que decae exponencialmente de (1) el voltaje inicial, (2) el ajuste de la capacitancia del instrumento y (3) la resistencia del circuito (incluida la muestra), si se cambia el tamaño del condensador para permitir que se almacene más (o menos) carga en el voltaje, se producirán tiempos de decaimiento más largos (o más cortos) y, por lo tanto, una duración efectiva del pulso diferente. En cambio, los generadores de ondas cuadradas controlan tanto la tensión como la duración del pulso con dispositivos de conmutación de estado sólido. También pueden producir pulsos que se repiten rápidamente. Para aplicaciones in vivo, se prefieren los generadores de onda cuadrada. Además de la duración y la amplitud del pulso, el número de pulsos y la configuración de los electrodos también influyen en la eficacia de la administración.
La mayoría de nuestros experimentos de electroporación in vitro han utilizado el Bio-Rad Gene Pulser, un dispositivo de descarga de condensadores, pero son directamente aplicables a otros dispositivos de descarga de condensadores, y con algunos ajustes a los generadores de onda cuadrada. Los dispositivos de descarga de condensadores también están disponibles en GIBCO/BRL, BTX, Hoeffer Scientific e International Biotechnologies (véase el APÉNDICE 4 para las direcciones de los proveedores). Estas máquinas, ya sea en una sola unidad o mediante componentes adicionales, pueden ofrecer una variedad de condiciones de electroporación adecuadas para la mayoría de las aplicaciones. Los generadores de onda cuadrada están disponibles en BTX, Baekon, CytoPulse Sciences, Sonidel, Bio-Rad, Jouan e IGEA y ofrecen un gran control sobre la anchura del pulso, permiten pulsos múltiples y rápidos, y pueden ser más eficaces para las células que son muy sensibles o difíciles de transfectar. El uso de la electroporación para llevar a cabo la terapia génica en animales vivos o en seres humanos también requiere un buen control de los parámetros de electroporación para garantizar una transferencia eficaz del ADN con un daño mínimo al tejido, y esto generalmente requiere generadores de onda cuadrada. Los generadores están disponibles para administrar pulsos como voltaje constante o corriente constante. Además de suministrar generadores de onda cuadrada, estos proveedores también ofrecen electrodos adecuados para la electroporación in vivo. Estas máquinas suelen ser más caras. Se ha hecho evidente que los pulsos de corriente alterna a ~100 kHz pueden ser la forma de onda más eficaz para la electroporación y posiblemente la electrofusión (Chang, 1989).
La mayoría de nuestros experimentos in vivo han utilizado generadores de onda cuadrada BTX T820 o T830. En estos experimentos se han utilizado electrodos disponibles en el mercado, como una matriz de 2 agujas, electrodos de pinza y electrodos de fórceps, así como electrodos diseñados a medida. Como se mencionó anteriormente, los principales proveedores de equipos de electroporación tienen una variedad de electrodos penetrantes y no penetrantes disponibles. Los generadores de onda cuadrada permiten un mejor control de los parámetros de los pulsos, lo que es especialmente importante cuando se realiza la administración in vivo. El crecimiento del uso de la electroporación in vivo está directamente relacionado con su entrega efectiva en el músculo. La aplicación de la entrega intramuscular de genes utilizando la electroporación ha sido particularmente importante para fines de vacunación (Abdulhagg, et al., 2008). También se ha demostrado que el músculo es un excelente depósito para aplicaciones de sustitución de proteínas basadas en genes (Trollet, et al., 2006). La administración en el músculo también puede utilizarse para la administración de vacunas contra el cáncer (Bodles-Brakhop, et al., 2009). La administración en la piel también ha ganado aceptación como objetivo versátil. La liberación en la piel puede utilizarse para tratar enfermedades cutáneas directamente, para liberar proteínas en la circulación con fines de terapia sistémica, para la terapia del cáncer y para liberar vacunas de ADN (Hirao, et al., 2008, Roos, et al., 2006, Glasspool-Malone, et al., 2000).
La electroporación puede ser más fácil de llevar a cabo que otras técnicas alternativas, por lo que se está utilizando cada vez más. Su desventaja para el uso con el análisis transitorio es que se necesitan casi cinco veces más células y ADN que con la transfección mediada por fosfato de calcio o DEAE-dextrano (UNITS 9.1, 9.2 & 16.12). La principal diferencia entre los procedimientos de electroporación y de coprecipitación con fosfato de calcio es el estado del ADN integrado tras la selección en medios antibióticos adecuados. En el caso del fosfato de calcio, la cantidad de ADN captada e integrada en el genoma de cada célula transfectada es del orden de 3 × 106 pb. Como resultado, el ADN transfectado a menudo se integra como grandes conjuntos en tándem que contienen muchas copias del ADN transfectado. Esto sería una ventaja cuando se desea la transfección de ADN genómico en células receptoras y la selección para algún cambio fenotípico como la transformación maligna; en este caso es esencial una gran cantidad de ADN integrado por célula receptora. En cambio, la electroporación puede ajustarse para obtener de una a muchas copias de ADN insertado por célula receptora. Esto supondría una ventaja para los estudios de expresión génica, ya que se puede controlar la identidad de la copia concreta responsable de la expresión génica y, como se ha comentado anteriormente, es esencial para la orientación génica de las células ES para generar ratones transgénicos.