La infección por Giardia lamblia es una de las causas más comunes de enfermedad diarreica en todo el mundo (22). Este protozoo patógeno coloniza el intestino delgado y puede adherirse al epitelio pero no invade la mucosa. Las infecciones suelen ser autolimitadas, ya que los huéspedes inmunocompetentes pueden controlar y, por lo general, erradicar G. lamblia, un proceso en el que intervienen las células T CD4 y la generación de inmunoglobulina A (IgA) secretora y otros efectores poco conocidos (6, 8, 9, 18). A pesar de los síntomas clínicos frecuentemente graves, diarrea, dolor abdominal, malabsorción y pérdida de peso, la infección no se acompaña de una inflamación significativa de la mucosa (12). Estas observaciones sugieren que los mediadores inflamatorios pueden no ser importantes para la diarrea inducida por el parásito, aunque los mecanismos que gobiernan la diarrea en la giardiasis son poco conocidos. No se ha demostrado que Giardia libere enterotoxinas que puedan explicar la alteración de la absorción o secreción de fluidos intestinales. Tras la infección por Giardia en ratones se produce una reducción de la superficie de absorción debido a la pérdida de microvellosidades epiteliales (16), lo que podría provocar una diarrea de origen osmótico asociada a la malabsorción, pero la reducción absoluta de la superficie es modesta en comparación con la reserva anatómica prevista del intestino delgado. Los humanos infectados con G. lamblia muestran signos de hipermotilidad intestinal en el examen radiológico (15), un fenómeno que también se ha observado en jerbos de Mongolia infectados experimentalmente (5). Los mecanismos subyacentes y el significado funcional de estos hallazgos no están actualmente claros. Por lo tanto, el objetivo del presente estudio fue probar la hipótesis de que la hipermotilidad intestinal representa un mecanismo de defensa del huésped contra Giardia, utilizando modelos murinos de giardiasis.
Los ratones adultos C57BL/6, SCID y deficientes en óxido nítrico sintasa neuronal (nNOS) se obtuvieron de The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Para las infecciones con Giardia muris, los quistes se purificaron por flotación de sacarosa, se contaron en un hemocitómetro bajo un microscopio de contraste de fase y se administraron por sonda oral en agua a 104 quistes/ratón en 0,2 ml (9). Para las infecciones por G. lamblia, se cultivaron trofozoítos de la cepa GS/M (ATCC 50580) (11) en medio TYIS-33 y se administraron por vía oral a razón de 107 quistes/ratón en 0,2 ml del mismo medio (9). La motilidad del intestino delgado se determinó mediante un método de comida de prueba modificado. Se ayunó a los ratones durante la noche y se les administró 0,2 ml de una suspensión de 106 perlas de poliestireno fluorescentes (microesferas de carboxilato Fluoresbrite YG de 10 μm de diámetro; Polysciences, Inc., Warrington, PA) (19) y tinte de carmín al 6% en goma arábiga al 5% en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Después de 20 minutos, se extrajo rápidamente el intestino delgado y se registró la posición del frente del colorante carmín y toda la longitud del intestino delgado. A continuación, se dividió el intestino en ocho trozos de igual tamaño, cada uno de los cuales se abrió longitudinalmente, se introdujo en 2 ml de PBS y se enfrió en hielo durante 10 min. Las mezclas se agitaron enérgicamente para desprender los trofozoítos y las perlas, que luego se contaron por separado utilizando microscopios de contraste de fase y de fluorescencia, respectivamente. La distancia recorrida por el frente de colorante carmín se expresó como porcentaje de la longitud total del intestino delgado. El número de microesferas por segmento se expresó como porcentaje del número total de microesferas en el intestino delgado. Para evaluar las consecuencias de la inhibición de la motilidad del intestino delgado en el aclaramiento giardiano, los ratones se infectaron primero por vía oral con G. muris o G. lamblia GS/M y se trataron por gavación oral cada dos días, a partir del día 7 o del día 4, respectivamente, con 30 mg/kg de loperamida o con PBS como control. El número de trofozoítos en el intestino se determinó el día 21 para G. muris y el día 9 para G. lamblia.
Para determinar si los ratones adultos normales son un modelo adecuado para estudiar el papel de la motilidad intestinal en el control de la infección giardiana, infectamos ratones C57BL/6 de 8 a 10 semanas de edad con quistes del patógeno murino natural G. muris. La motilidad del intestino delgado se determinó mediante un método de comida de prueba, utilizando tinte de carmín como marcador de fase líquida (14) y perlas de poliestireno de 10 μm como marcador de partículas comparables en tamaño a los trofozoitos de Giardia (19). La infección con G. muris aceleró el tránsito del intestino delgado, ya que los frentes tanto del colorante carmín (Fig. (Fig.1A)1A) como de las perlas de poliestireno (Fig. (Fig.1B)1B) habían viajado significativamente más lejos en los ratones infectados que en los controles no infectados. Un análisis del curso temporal de este fenómeno reveló que la hipermotilidad se produjo una semana después de la infección, pero alcanzó su punto máximo a las 2 o 3 semanas, en un momento en el que el número de trofozoítos disminuyó en comparación con el número en el momento de la infección máxima a la semana (Fig. (Fig.1A).1A). Por lo tanto, los cambios máximos en la motilidad del intestino delgado se retrasaron en relación con el pico de la carga de trofozoitos, lo que sugiere que estos cambios pueden ser causados por un mecanismo distinto de la estimulación giardial directa.
La infección por G. muris de ratones de tipo salvaje induce la hipermotilidad del intestino delgado. (A) Los ratones C57BL/6 adultos fueron infectados por vía oral con 104 quistes de G. muris (semanas 1 a 4) o se dejaron sin infectar como controles (semana 0). En los momentos indicados tras la infección, se examinó la motilidad del intestino delgado (-) y la carga de trofozoitos (○). Los datos de motilidad se muestran como la distancia recorrida por una comida de prueba que contiene colorante carmín en relación con la longitud de todo el intestino delgado durante un período de 20 minutos. Los valores son medias ± errores estándar de las medias (SEM) de los resultados de cuatro a siete animales. Los asteriscos representan un aumento significativo (P < 0,05, prueba t) de la motilidad en relación con los controles no infectados. (B) Los ratones infectados durante 2 semanas con G. muris (barras vacías) y los controles no infectados (barras rellenas) recibieron una comida de prueba que contenía perlas de poliestireno fluorescentes de 10 μm, y se evaluó el tránsito de las perlas después de 20 minutos. El número de microesferas en cada uno de los ocho segmentos del intestino delgado de igual tamaño (numerados por orden desde el duodeno proximal hasta el distalileo) se indica como porcentaje del número total de microesferas en el intestino delgado. No se encontraron diferencias significativas entre el número de microesferas residuales en los estómagos de los ratones infectados y no infectados (14,2% ± 5,7% frente a 18,5% ± 3,4%, respectivamente). Los valores son medias ± SEM de seis a siete animales. Los asteriscos representan un aumento significativo (P < 0,05, prueba t) en relación con los ratones no infectados.
Este hallazgo recuerda a los informes sobre la pérdida de microvellosidades epiteliales intestinales inducida por Giardia en los que se encontró que la respuesta inmune adaptativa del huésped era responsable (16, 17). Para evaluar si mecanismos similares pueden estar implicados en la causa de la hipermotilidad del intestino delgado, evaluamos ratones con inmunodeficiencia combinada grave (ratones SCID). Estos ratones carecen de células T y B funcionales debido a un defecto en la subunidad catalítica de la proteína quinasa dependiente del ADN, PRKDC, que es necesaria para la recombinación V(D)J normal, y no pueden erradicar Giardia (9, 18). La infección por G. muris de los ratones SCID no alteró el tránsito del intestino delgado, lo que contrastó fuertemente con las observaciones en los controles inmunocompetentes (Fig. Estos resultados indican que la hipermotilidad del intestino delgado asociada a la giardiasis dependía de la inducción de una respuesta inmunitaria adaptativa normal al patógeno.
Dependencia de la hipermotilidad intestinal de las funciones intactas de las células T y B. Los ratones adultos C57BL/6 (tipo salvaje) y SCID fueron infectados por vía oral con quistes de G. muris o se dejaron sin infectar como controles, y se evaluó la motilidad del intestino delgado (A) y el número de trofozoitos (B) 2 semanas después de la infección. Los valores son la media ± SEM de cuatro a seis animales. El asterisco designa un aumento significativo (P < 0,05, prueba t) en relación con los controles no infectados.
Para comprobar si la hipermotilidad del intestino delgado observada contribuía a la eliminación de Giardia, tratamos a los ratones con loperamida, un fármaco que inhibe el tránsito intestinal mediante la activación de los receptores μ-opioides en el tracto gastrointestinal (2, 13, 21). El tratamiento farmacológico se inició en el momento de máxima infección por G. muris (día 7) para garantizar que los cambios inducidos farmacológicamente en la motilidad no interfirieran con el establecimiento inicial de la infección. La inhibición de la motilidad del intestino delgado por parte de la loperamida comprometió notablemente el aclaramiento giardiano, con un número de trofozoitos 25 veces mayor en los ratones tratados con loperamida que en los controles tratados con PBS a los 21 días (Fig. (Fig.3).3). El tratamiento con loperamida no tuvo ningún efecto sobre el desarrollo de la inmunidad adaptativa, ya que los títulos de IgA antigiardial en las secreciones de la mucosa intestinal no se vieron afectados por el tratamiento (datos no mostrados). Además, esta estrategia experimental reveló un efecto inhibidor similar en la infección murina con G. lamblia GS/M, un patógeno giardial humano que puede infectar a ratones adultos normales (3, 9). Los ratones tratados con PBS habían eliminado en gran medida la infección a los 9 días, mientras que los ratones tratados con loperamida a partir del día 4 seguían teniendo un número significativo de trofozoitos de G. lamblia en el intestino delgado (Fig. Así pues, la inhibición de la motilidad del intestino delgado comprometía la eliminación de Giardia en el huésped murino, independientemente de la especie giardiana. Como enfoque adicional para determinar la importancia de la motilidad intestinal en la defensa del huésped contra Giardia, utilizamos un enfoque genético en el que la interrupción del gen de la nNOS interfiere con la propulsión efectiva en el intestino de los ratones (20). El análisis de la motilidad confirmó que los ratones deficientes en nNOS presentaban un retraso constitutivo en el tránsito gastrointestinal en comparación con sus compañeros de camada de tipo salvaje (Fig. (Fig.4A).4A). Paralelamente, los ratones knockout no lograron eliminar la infección por G. lamblia con normalidad (Fig. (Fig.4B).4B). Por lo tanto, utilizando enfoques farmacológicos y genéticos, encontramos que la disminución de la motilidad intestinal se asoció con el deterioro de la defensa del huésped contra Giardia.
La inhibición farmacológica de la motilidad intestinal compromete la eliminación de Giardia. Se infectaron ratones C57BL/6 adultos por vía oral con 104 quistes de G. muris o con 107 trofozoitos de G. lamblia GS/M. Tras 7 días (G. muris) o 4 días (G. lamblia), los ratones recibieron loperamida (Lop) o PBS por vía oral en días alternos. Se determinó el número de trofozoítos en el intestino delgado en los momentos indicados tras la infección. Los valores son medias ± SEM de ocho a diez animales. *, P < 0,05, determinado por la prueba t.
Los ratones que carecen de nNOS presentan una disminución del tránsito gastrointestinal y una mayor susceptibilidad a la infección por Giardia. (A) Los ratones adultos deficientes en nNOS (nNOS-/-) y sus controles de tipo salvaje (WT) fueron sometidos a pruebas de motilidad gastrointestinal utilizando una comida de prueba de colorante carmín. Los valores son medias ± SEM de al menos tres animales. *, P < 0,05 (prueba t), en relación con los resultados de los ratones de tipo salvaje. (B) Los ratones fueron infectados por vía oral con 107 trofozoitos de G. lamblia GS/M, y se determinó el número de trofozoitos en el intestino delgado en los momentos indicados después de la infección. Los valores son medias ± SEM de tres a cuatro animales. *, P < 0,05, en relación con los recuentos del día 4.
Nuestro estudio muestra que la hipermotilidad intestinal es una importante defensa del huésped contra Giardia, conclusión a la que también se llegó en otro informe reciente (10). Esta defensa parece depender del desarrollo de una respuesta inmunitaria adaptativa normal contra el parásito, ya que no se produjo en los ratones que carecen de células T y B, aunque es posible, en principio, que las células T o B contribuyan a la hipermotilidad independientemente de su papel en la inmunidad adaptativa antigriardia. La hipermotilidad dependiente de la inmunidad opera en la defensa del huésped contra otros parásitos entéricos, particularmente los helmintos. Por ejemplo, la erradicación de la ascáride Trichinella spiralis, que pasa una parte importante de su ciclo vital en el intestino delgado, está altamente correlacionada con una mayor motilidad intestinal (4, 23). Asimismo, la expulsión del anquilostoma Nippostrongylus brasiliensis en ratas va acompañada de hipermotilidad del intestino delgado, lo que sugiere un papel en la defensa del huésped contra este helminto (7). Todos estos patógenos entéricos tienen en común su localización primaria, si no exclusiva, en la luz intestinal. Desde el punto de vista anatómico, este lugar de infección está situado fuera del cuerpo revestido de epitelio propiamente dicho y, por lo tanto, no es fácilmente accesible para muchas células y moléculas efectoras inmunitarias, como los neutrófilos o el complemento, que actúan eficazmente dentro del cuerpo. De hecho, una defensa antimicrobiana eficaz en la luz intestinal supone un reto especial para el huésped, que tiene un repertorio limitado de defensas en este lugar. De éstas, la IgA secretora se considera comúnmente como un mecanismo de defensa luminal primordial, pero su importancia real en la eliminación giardiana parece ser variable y puede depender de factores mal definidos del huésped y del parásito (6, 9, 18). Nuestros datos y trabajos anteriores con helmintos (4, 23) indican que la hipermotilidad intestinal es otro importante mecanismo de defensa contra la colonización de la luz intestinal.
La hipermotilidad dependiente de la inmunidad puede proporcionar una explicación mecánica para la diarrea asociada a la giardiasis, como se ha señalado en informes anteriores (5, 15). En principio, la diarrea puede ser causada por la disminución de la absorción de fluidos o el aumento de la secreción o una combinación de estos dos mecanismos. Existen pocas pruebas de un aumento de la secreción de iones y fluidos en la giardiasis, por lo que la causa más probable es el deterioro de la absorción de fluidos. Un menor tiempo de contacto con los fluidos luminales, que pueden ser ingeridos o derivados de las secreciones gástricas o pancreáticas, podría comprometer la eficacia del transporte de iones a través del epitelio, especialmente cuando la hipermotilidad se combina con la pérdida de superficies epiteliales absorbentes (16). Sin embargo, hay que tener en cuenta que los ratones no presentan una diarrea franca tras la infección por Giardia. No obstante, es posible que se produzca un desequilibrio de los fluidos intestinales tanto en los huéspedes humanos como en los animales y que quede compensado en los ratones pero no en los humanos. Si la hipermotilidad contribuye realmente a la patogénesis de la diarrea, nuestro hallazgo de que los ratones SCID no mostraron la hipermotilidad inducida por Giardia implicaría que los pacientes con inmunodeficiencias celulares asociadas con una mayor susceptibilidad a las infecciones por Giardia (por ejemplo, la inmunodeficiencia variable crónica) pueden ser menos propensos a desarrollar diarrea asociada a la infección. Además, nuestros resultados sugieren que hay que tener cuidado al considerar el uso de inhibidores de la motilidad intestinal en el tratamiento de la diarrea inducida por Giardia (1), ya que dicho tratamiento puede prolongar la infección subyacente.