TEXT

Yersinia pestis jest czynnikiem etiologicznym dżumy i ma potencjał do wykorzystania jako broń biologiczna (1, 13, 17-20, 23). Z tego powodu ważne jest, aby pojawiająca się oporność na leki, czy to naturalna czy wytworzona, była możliwa do wykrycia przy użyciu standardowych metod, które można łatwo wdrożyć w wielu laboratoriach. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) opisuje referencyjną metodę mikrorozcieńczeń bulionowych (BMD) do oznaczania wrażliwości Y. pestis na środki przeciwdrobnoustrojowe i podaje wytyczne interpretacyjne MIC dla ośmiu środków przeciwdrobnoustrojowych (6). BMD wykorzystuje bulion Mueller-Hinton z korekcją kationową (CAMHB) i wymaga inkubacji w temperaturze 35°C przez 24 godziny z opcją inkubacji przez 48 godzin, gdy wzrost w ciągu 24 godzin jest niewystarczający do interpretacji punktu końcowego. Niestety, referencyjne BMD jest trudne do wprowadzenia w wielu laboratoriach, ponieważ jest stosunkowo kosztowne i pracochłonne oraz wymaga przechowywania paneli w formie zamrożonej lub odwodnionej. Istnieje kilka alternatywnych metod oznaczania wrażliwości, w tym metoda dyfuzyjno-krążkowa i Etest. Jednakże, zanim te metody będą mogły być zastosowane dla danego gatunku, muszą być ocenione i porównane z BMD w celu określenia korelacji pomiędzy wynikami uzyskanymi przez porównanie tych metod.

Izolaty Y. pestis są wymagające i mogą rosnąć wolniej na sztucznych podłożach niż inne powszechnie występujące gatunki Enterobacteriaceae, dlatego też metody oznaczania wrażliwości dla Y. pestis były trudne do standaryzacji. W literaturze opisano kilka metod. Test dyfuzyjno-krążkowy był zazwyczaj wykonywany na podłożu Mueller-Hinton agar (MHA), zwykle przy 48-godzinnej inkubacji w temperaturze 35°C, ale opisy metodologiczne są czasami mało szczegółowe (10, 16, 24). Metoda Etest została zastosowana przez Wong i wsp. (25) przy użyciu MHA z 5% krwią owczą, inkubacji w temperaturze 35°C i inokulum odpowiadającemu no. 1 McFarlanda zamiast standardu 0,5 McFarlanda stosowanego w większości badań dyfuzyjnych metodą krążkową lub Etest. Rozcieńczanie agarowe, przy użyciu MHA inkubowanego w temperaturze 27° do 30°C przez 48 godzin, jest najczęściej stosowaną metodą opisywaną w literaturze (7, 8, 11, 12, 22). Metody makrorozcieńczeń bulionowych i mikrorozcieńczeń były również stosowane przy różnych temperaturach inkubacji (2, 21).

Istnieje kilka cech metod dyfuzyjnych i Etest, które czynią je atrakcyjnymi alternatywnymi metodami badania wrażliwości, w tym łatwość przechowywania i długi okres przydatności krążków i pasków. Ponadto, są to metody oparte na agarze, a punkty końcowe mogą być łatwiejsze do odczytania niż w przypadku BMD. Dodatkową zaletą Etestu jest możliwość uzyskania wyniku MIC. W niniejszym raporcie przedstawiamy wyniki wieloośrodkowego badania porównującego Etest i metody dyfuzyjne z referencyjną metodą BMD CLSI do oznaczania wrażliwości Y. pestis.

(Raport ten został przedstawiony częściowo na 107. spotkaniu ogólnym Amerykańskiego Towarzystwa Mikrobiologicznego, Toronto, Kanada, 21 do 25 maja 2007 r.).)

Dwudzieści sześć różnych szczepów Y. pestis z kolekcji Centers for Disease Control and Prevention (CDC) i U.S. Army Medical Research Institute of Infectious Diseases (USAMRIID) było testowanych zarówno metodą Etest jak i BMD w czterech ośrodkach badawczych oraz dodatkowo metodą dyfuzji krążkowej w dwóch z tych ośrodków. Sześć szczepów należało do biotypu Antiqua, siedem do biotypu Medievalis, a 12 do biotypu Orientalis; jeden nietypowy izolat nie mógł być przypisany do żadnego biotypu. Środki przeciwdrobnoustrojowe badano zarówno metodą BMD, jak i Etest (bioMérieux, Durham, NC), a ich odpowiednie zakresy były następujące odpowiednio dla BMD i Etest: dla chloramfenikolu, 0,03 do 64 μg/ml i 0,016 do 256 μg/ml; dla cyprofloksacyny, 0,03 do 64 μg/ml i 0,002 do 32 μg/ml; dla doksycykliny, 0,03 do 64 μg/ml i 0.016 do 256 μg/ml; dla gentamycyny, 0,03 do 64 μg/ml i 0,016 do 256 μg/ml; dla lewofloksacyny, 0,06 do 64 μg/ml i 0,002 do 32 μg/ml; dla streptomycyny, 0,03 do 64 μg/ml i 0.016 do 256 μg/ml; dla tetracykliny, 0,03 do 64 μg/ml i 0,016 do 256 μg/ml; oraz dla trimetoprimu-sulfametoksazolu, 0,015/32 do 16/304 μg/ml i 0,002/0,038 do 32/608 μg/ml. Ponieważ zakresy dla badań BMD niektórych leków nie obejmowały niższych stężeń możliwych do uzyskania za pomocą Etestu, zasadnicza zgodność (± 1 log2 rozcieńczenia) między metodami została uznana za poza skalą dla niektórych porównań wyników (np. MIC lewofloksacyny BMD ≤0,06 μg/ml i MIC Etestu 0,03 μg/ml). W CDC przygotowano płytki MIC z 96 dołkami, używając 100 μl CAMHB (BBL, Sparks, MD) na dołek; płytki przechowywano w stanie zamrożonym w temperaturze -70°C i wysyłano do uczestniczących laboratoriów. Badania przeprowadzono według standardowych metod CLSI dla BMD i dyfuzji krążkowej (4-6). Inokulacje przygotowywano z 18- do 24-godzinnych hodowli tlenowych wyhodowanych na płytkach z 5% agarem z krwi owczej (BBL) metodą bezpośredniej zawiesiny kolonii w bulionie Mueller-Hinton (MHB) (Remel, Lenexa, KS) w celu wyrównania standardu zmętnienia 0,5 McFarlanda (4); te same inokulacje były używane do inokulacji płytek MHA o średnicy 150 mm do testów Etest i dyfuzji krążkowej. Natychmiast po inokulacji przeprowadzono co najmniej dwa losowe liczenia kolonii w każdym miejscu badania z pozytywną studzienką kontroli wzrostu BMD w celu oceny wielkości inokulum. Na płytkę nakładano nie więcej niż cztery paski Etest. Do dyfuzji krążkowej nakładano krążki komercyjne (BBL) za pomocą samozaciskającego się dozownika wielodyskowego (BBL). Panele BMD i płytki MHA zarówno dla Etestu jak i dyfuzji dyskowej inkubowano w temperaturze 35°C i odczytywano w 24- i 48-godzinnych okresach czasu. Etesty odczytywano zgodnie z zaleceniami zawartymi w ulotkach dołączonych do opakowań Etestów, w następujący sposób: chloramfenikol, doksycyklinę, tetracyklinę i trimetoprim-sulfametoksazol odczytywano przy 80% inhibicji dla punktu przecięcia; cyprofloksacynę, lewofloksacynę, gentamycynę i streptomycynę odczytywano przy 100% inhibicji. W analizach danych MIC Etestu zostały zaokrąglone w górę do najbliższego log2 rozcieńczenia. Escherichia coli ATCC 25922 i Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 były używane do kontroli jakości BMD i Etestu. MIC dla szczepów kontroli jakości określono przez inkubację przez 16 do 20 h. Akceptowalne zakresy kontroli jakości BMD dla streptomycyny zostały wcześniej ustalone w CDC (dane niepublikowane). Kontrola jakości Etestu chloramfenikolu została przeprowadzona przez badanie Escherichia coli ATCC 25922 i zastosowanie dopuszczalnego zakresu dla CLSI BMD.

Aby zmierzyć zgodność pomiędzy wynikami Etestu i BMD, zbadano rozkład różnic w log2 rozcieńczeniach MIC i obliczono procent oznaczeń MIC, które dały identyczne wartości (zasadnicza zgodność w granicach dokładności metody referencyjnej) dla każdego leku. Ponadto, w celu ustalenia, czy metoda Etest dawała istotnie niższe lub wyższe MIC niż metoda referencyjna, wykonano test Wilcoxona z podpisem-rankiem dla MIC w rozcieńczeniu log2 obu testów przy użyciu oprogramowania statystycznego SAS (SAS Institute Inc., Cary, NC); MIC w rozcieńczeniu ± 1 log2 uznano za identyczne dla tego testu. Porównanie wyników kategorii interpretacyjnych (podatne, pośrednie i oporne) zostało dokonane poprzez obliczenie wskaźników drobnych, poważnych i bardzo poważnych błędów.

Ogólnie, punkty końcowe MIC były łatwiejsze do wykrycia przez BMD niż przez Etest w ciągu 24 godzin (dane nie pokazane). W trzech ośrodkach badawczych (A, B i C), prawie wszystkie BMD i Etest MIC były czytelne po 24 h inkubacji; pojedynczy wynik Etestu był wyjątkiem. W ośrodku D odnotowano czytelne wartości MIC BMD po 24 godzinach dla wszystkich szczepów z wyjątkiem jednego. Wzrost był niewystarczający do odczytania MIC Etestu w 24 h dla ośmiu szczepów w ośrodku D. Liczba MIC Etestu, które były nieczytelne z powodu niewystarczającego wzrostu w 24 h dla poszczególnych leków, była następująca: dla chloramfenikolu, n = 6; dla cyprofloksacyny, n = 4; dla doksycykliny, n = 3; dla gentamycyny, n = 2; dla lewofloksacyny, n = 5; dla streptomycyny, n = 5; dla tetracykliny, n = 4; i dla trimetoprimu-sulfametoksazolu, n = 4. Wszystkie ośrodki badawcze były w stanie odczytać wszystkie wyniki po 48 h. Dlatego w porównaniu wykorzystano wyniki 48 h. Liczby kolonii wykazały, że gęstość inokulum w studzienkach BMD mieściła się w dopuszczalnych granicach dla wszystkich czterech ośrodków badawczych; średnie dla ośrodków wahały się od 1,1 × 105 CFU/ml do 4,2 × 105 CFU/ml.

Porównano MIC90 i zakres MIC dla każdego środka przeciwdrobnoustrojowego według metody (Tabela 1). Dla wszystkich leków z wyjątkiem chloramfenikolu wartości MIC90 dla wszystkich metod były takie same lub mieściły się w zakresie ± 1 log2 rozcieńczenia między sobą. Zgodność kategorii pomiędzy metodami Etest i BMD dla wszystkich leków była doskonała i wynosiła od 97% do 100%; wszystkie błędy były niewielkie (Tabela 1). Wszystkie MIC BMD i Etestu mieściły się w zakresie podatności po 24 godzinach inkubacji (dane nie pokazane). W ciągu 48 godzin większość MIC mieściła się w zakresie wrażliwości, z wyjątkiem następujących wyników niewrażliwych: chloramfenikol (n = 2); cyprofloksacyna (n = 1); i streptomycyna (n = 5). Większość wyników niewrażliwych pochodziła z metody BMD, a nie Etestu (ryc. 1).

Dwie metody są najlepiej porównywane poprzez analizę niezbędnej zgodności (procent MIC w zakresie ± 1 log2 rozcieńczenia dla obu metod). Niezbędna zgodność dla wszystkich miejsc łącznie (w tym MIC poza skalą) wynosiła ≥90% dla cyprofloksacyny, doksycykliny, lewofloksacyny, streptomycyny i tetracykliny. Wartości zgodności zasadniczej dla gentamycyny, trimetoprimu-sulfametoksazolu i chloramfenikolu były niższe i wynosiły odpowiednio 88%, 78% i 35%. Z wyjątkiem chloramfenikolu i trimetoprimu-sulfametoksazolu, zasadniczo istniało niewielkie zróżnicowanie lub brak zróżnicowania w zakresie niezbędnej zgodności między ośrodkami dla każdego leku (Tabela 3). W przypadku chloramfenikolu i trimetoprimu-sulfametoksazolu zasadnicza zgodność między metodami MIC w poszczególnych ośrodkach wynosiła odpowiednio od 4% do 81% i od 58% do 96%.