Abstract

Postęp w sekwencjonowaniu ludzkiego genomu napędza podejścia genetyczne w celu określenia funkcji genów. Strategie takie jak pułapki genowe i mutageneza chemiczna wkrótce wygenerują duży zasób zmutowanych myszy. Mutacje punktowe wywołane przez N -etylo- N -nitrozomocznik (ENU) zapewniają unikalny zasób mutantów, ponieważ: (i) odzwierciedlają konsekwencje zmiany pojedynczego genu niezależnie od efektów pozycji; (ii) zapewniają drobnostrukturalną dysekcję funkcji białka; (iii) wykazują zakres efektów mutacji od całkowitej lub częściowej utraty funkcji do przesadnej funkcji; oraz (iv) odkrywają funkcje genu w sposób bezstronny. Fenotypowo ukierunkowane badania ENU na myszach podkreślają znaczenie dla chorób klinicznych u ludzi poprzez ukierunkowanie na kardiologię, fizjologię, neurologię, odporność, hematopoezę i rozwój ssaków. Takie podejścia są niezwykle potężne w zrozumieniu złożonych ludzkich chorób i cech: zmiany w parach bazowych mogą dokładnie modelować zmiany bazowe znalezione w ludzkich chorobach, a subtelne zmutowane allele w standardowym tle genetycznym zapewniają zdolność do analizowania konsekwencji złożonych genotypów. Trwające eksperymenty mutagenezy ENU na myszach generują skarbnicę nowych mutacji w celu umożliwienia dogłębnego badania pojedynczego genu, regionu chromosomalnego lub systemu biologicznego.

Wprowadzenie

Manipulacyjne narzędzia genetyczne u myszy są rozległe i potężne. Genetycy myszy mogą wyeliminować lub nadekspresję genów w całym zwierzęciu lub w określonej tkance, wprowadzać duże fragmenty własnego lub obcego DNA do genomu i inżynierować całe chromosomy. Techniki te, w połączeniu z genetycznymi, rozwojowymi, patologicznymi i fizjologicznymi podobieństwami między myszą a człowiekiem, uczyniły z myszy laboratoryjnej podstawowy organizm modelowy w badaniach nad chorobami człowieka. Wrodzone szczepy myszy zapewniają możliwość badania cech chorobowych w określonym tle genetycznym, umożliwiając rozróżnienie między fenotypami nadanymi przez pojedynczą mutację a wkładem innych modyfikatorów genetycznych.

Zdolność do tworzenia mutacji powodujących utratę funkcji przez rekombinację homologiczną w embrionalnych komórkach macierzystych zapoczątkowała rewolucję w biologii myszy. Wykorzystując technologię embrionalnych komórek macierzystych, każdy gen zaangażowany w ludzką chorobę może zostać zaburzony, dostarczając cennych informacji o konsekwencjach mutacji w całym zwierzęciu. Podczas gdy mutacje zerowe są niezbędne, subtelne mutacje wywołane przez N -etylo-N -nitrozomocznik (ENU) są nieocenione dla zbadania pełnego zakresu funkcji genu. Mutacje w regionach kodujących i elementach regulacyjnych mogą dawać bardzo różne fenotypy, a jednocześnie zapewniają drobnostrukturalny przekrój funkcji białka i regulacji genu. Serie alleli mogą być generowane przez rekombinację homologiczną, ale mutageneza fenotypowa oferuje wiele korzyści w szybkości generowania i usuwania uprzedzeń badaczy. Dlatego też, baza danych nokautów dla genomu myszy powinna być traktowana jedynie jako punkt wyjścia; dodatkowe allele i specyficzności tkankowe są niezbędne do zakończenia analizy funkcjonalnej.

Mutagenizing the Mouse Germline

ENU może przenosić swoją grupę etylową na rodniki tlenowe lub azotowe w DNA, co skutkuje błędnym sparowaniem i substytucją par zasad, jeśli nie zostanie naprawione. Najwyższe wskaźniki mutacji występują w przedmejotycznych spermatogonialnych komórkach macierzystych, z pojedynczymi częstotliwościami mutacji locus 6–1,5 × 10 -3 ( 1-3 ), co odpowiada uzyskaniu mutacji w pojedynczym wybranym genie w jednej z każdych 175-655 przesiewanych gamet. Z uwagi na jego moc w izolowaniu mutacji w jakimkolwiek genie lub regionie zainteresowania, ENU został wykorzystany u myszy w celu: (i) uzyskania serii multiallelicznych pojedynczych genów w celu dalszego definiowania funkcji; (ii) przecięcia biochemicznych lub rozwojowych szlaków; (iii) uzyskania nowych recesywnych mutacji na pojedynczym chromosomie lub w całym genomie; oraz (iv) nasycenia regionów genomu myszy, które są odkryte przez delecje ( 4-10 ). Analiza 62 sekwencjonowanych mutacji germinalnych z 24 genów ujawnia, że ENU przeważnie modyfikuje pary zasad A/T, z 44% transwersjami A/T→T/A, 38% transwersjami A/T→G/C, 8% transwersjami G/C →A/T, 3% transwersjami G/C→C/G, 5% transwersjami A/T→C/G i 2% transwersjami G/C→T/A ( Tabela 1 ; Ryc. 1 ). Po przełożeniu na produkt białkowy zmiany te powodują 64% mutacji missense, 10% mutacji nonsensownych i 26% błędów splicingowych ( tab. 1 ; ryc. 1 ).

Isolating Disease Models Using ENU

Różne ekrany genetyczne mogą być wykorzystywane do izolowania mutacji wywołanych ENU. Przesiew pojedynczego pokolenia może szybko wygenerować zdolne do życia oraz płodne mutanty, które reprezentują serie alleli, modyfikatory lub mutacje dominujące. Dwupokoleniowe skriningi delecyjne mogą identyfikować recesywne mutacje letalne w określonym regionie genomu. Trzypokoleniowe badania rodowodowe mogą być wykorzystane do przeskanowania całego genomu pod kątem mutacji zdolnej do przeżycia lub, w połączeniu z powiązanymi markerami lub chromosomami równoważącymi, do wyizolowania alleli letalnych lub sterylnych (patrz poniżej).

Wielkoskalowe badania przesiewowe

Kilka wielkoskalowych badań przesiewowych mutagenezy zostało już sfinansowanych na skalę międzynarodową. Kluczowe cechy tych badań są podsumowane w Tabeli 3 . Każdy z tych przesiewów wykorzystuje inną strategię genetyczną w celu wyizolowania mutacji: niektóre przesiewy są ukierunkowane na mutacje dominujące, podczas gdy inne są zaprojektowane w celu wyizolowania mutacji recesywnych. Niektóre grupy badają recesywne mutacje letalne i szkodliwe z mutagenezą regionalną w celu zajęcia się funkcją genu równolegle z Human Genome Project. Inne grupy skanują duże liczby zmutowanych genomów dla dominujących neurologicznych i klinicznych hematologicznych lub biochemicznych wariantów.

Skanowanie na małą skalę

Skanowanie dla mutacji nie musi być przeprowadzane na dużą skalę. Dwie opłacalne strategie dla małych laboratoriów to serie alleliczne i ekrany uwrażliwionych szlaków. Przesiewanie uwrażliwionych ścieżek jest ukierunkowane na pojedynczą biologiczną lub biochemiczną ścieżkę oraz wykorzystuje niealleliczną niekomplementarność w celu wyizolowania mutacji w pierwszym pokoleniu potomstwa zmutowanych samców. W takim przesiewie, wywołana mutacja (*) w locus, które oddziałuje z locus zainteresowania ( m ) może nie dopełniać się (*/+;+/ m ), jednakże dawać fenotyp przypominający pierwotnego homozygotycznego mutanta ( m/m ). Niektóre uwrażliwione ekrany mogą być przeprowadzane w tle modyfikacji leku lub środowiska, zamiast modyfikacji genetycznej. Na przykład, używając zastrzyku fenyloalaniny jako sensybilizatora, wyizolowano szereg mutacji wpływających na szlak metabolizmu fenyloalaniny jako heterozygoty ( 20 , 21 ).

Combining gene-driven and phenotype-driven approaches

Unikalne podejście do izolowania mutacji łączy ukierunkowanie oparte na genach w embrionalnych komórkach macierzystych z mutagenezą ENU napędzaną fenotypem. Potężne strategie genetyczne w Drosophila opierają się na dostępności odczynników genetycznych takich jak delecje, duplikacje i inwersje w celu ułatwienia badań genetycznych i zapewnienia prostego, opłacalnego utrzymania zasobów. Delecje są przydatne do generowania haploidii w ekranach genetycznych, jak również do mapowania przy użyciu strategii niekomplementarnych ( Fig. 2 B) ( 22 ). Inwersje, które niosą dominujący marker oraz są homozygotycznie letalne są idealnymi chromosomami balansującymi w celu tłumienia rekombinacji oraz łatwej identyfikacji klas potomstwa do izolacji oraz utrzymania mutacji letalnych lub szkodliwych ( Rys. 2 C). Zdolność do inżynierii całych regionów chromosomów przy użyciu technologii Cre /loxP pozwala na tworzenie tych odczynników genetycznych w dwuetapowym procesie ukierunkowania genów ( ryc. 2 A) ( 23 , 24 ). Podejście to jest oparte na genach, ponieważ punkty końcowe delecji lub inwersji są znane, minimalizując ilość wysiłku wymaganego do scharakteryzowania rearanżacji. Techniki inżynieryjne pozwalają na znakowanie rearanżacji dominującym markerem żółtego koloru sierści, K-14 agouti , zapewniając zasoby dla prostego mapowania, utrzymania zasobów i ekranów genetycznych ( 22 , 24 , 25 ). Tworzenie bibliotek genomowych myszy zawierających konstrukty niezbędne do zdarzeń ukierunkowanych zapewnia szybki system do ich generowania w dowolnym miejscu w genomie myszy ( Fig. 2 A) ( 25 ).

An initial mutagenesis effort, zaprojektowane w celu wyizolowania recesywnych mutacji wielu klas fenotypowych, jest ukierunkowane na chromosom 11 myszy, który jest chromosomem bogatym w geny, wysoce konserwowanym z ludzkim chromosomem 17. Celem jest nasycenie tego chromosomu mutacjami w celu określenia funkcji genu, a następnie wykorzystanie zachowania powiązań między myszami i ludźmi do przewidywania funkcji genów u ludzi. Wykorzystując odczynniki genetyczne wytworzone przez inżynierię Cre /loxP, przeprowadzane są dwa schematy mutagenezy: dwupokoleniowe rodowody delecyjne (Rys. 2 B) i trzypokoleniowe rodowody wykorzystujące chromosomy balansujące (Rys. 2 C). Oba schematy wykorzystują żółty kolor sierści nadawany przez transgen K14-agouti. Schemat delecji może być stosowany tylko w przypadku dużych delecji, które nie są szkodliwe dla zwierzęcia, ograniczając ekran do pewnych regionów, ale pozwalając na wyizolowanie mutacji w ciągu zaledwie dwóch pokoleń. Schemat inwersji pozwala na badanie większej części chromosomu w celu wykrycia mutacji, lecz wymaga trzech pokoleń hodowli.

Identyfikacja Mutacji Punktowych

Aby być wartościowym, nowe mutacje muszą być zlokalizowane tak, że geny kandydujące oraz odpowiednie modele chorób ludzkich mogą być zidentyfikowane. Mutacje punktowe wyodrębnione przez ich fenotyp muszą być mapowane przy użyciu informacji o fenotypie, ponieważ znacznik molekularny nie jest dostępny. Tradycyjnie, mutacje te są mapowane w mejotycznych krzyżówkach wstecznych segregujących fenotyp w stosunku do wielu polimorfizmów molekularnych (w celu przeglądu zobacz ref. 26 ). Mapowanie do rozdzielczości 10 cM wymaga przeanalizowania 100 mejoz. Tak więc, 100 nowych mutacji wyizolowanych w całym genomie wymagałoby analizy 10 000 myszy. Strategie mapowania wysokiej rozdzielczości dla klonowania pozycyjnego zwykle obejmują analizę 1000-2000 mejoz na mutację. Mnóstwo dominujących oraz recesywnych mutacji może zostać wyizolowanych w każdym ekranie ENU, czyniąc mapowanie wąskim gardłem w procesie oraz wymagając prostszych technologii mapowania, takich jak łączenie DNA ( 27 ). Opisane powyżej ekrany znakowane kolorem sierści są wyjątkowe w tym sensie, że mutacja jest izolowana w połączeniu z widocznymi markerami chromosomalnymi, więc jej lokalizacja chromosomowa jest znana przy izolacji, eliminując potrzebę mapowania mejotycznego. Ponadto, delecje generowane przez Cre /loxP mogą być wykorzystane do zlokalizowania mutacji w regionie podchromosomalnym poprzez niekomplementarność ( 22 , 28 ). Ponieważ sekwencja genomu myszy będzie wkrótce dostępna, wiele mutacji zostanie przypisanych do genów w oparciu o kandydaturę pozycyjną po ich zlokalizowaniu. Ponadto, komplementacja BAC może być wykorzystana do identyfikacji korelacji mutacja-gen ( 29 ).

Ponieważ nowe technologie są opracowywane dla wysokowydajnego wykrywania polimorfizmu pojedynczego nukleotydu, technologie dla wykrywania mutacji punktowych staną się prostsze ( 30 , 31 ). W przeciwieństwie do ludzi, naturalnie występujące polimorfizmy są rzadkie w szczepach wsobnych myszy, w szczególności w obrębie regionów kodujących. Tak więc, wykrywanie mutacji punktowych jest możliwe w tle szczepu wsobnego, czyniąc wykrywanie mutacji za pomocą enzymów naprawy niedopasowania potencjalnym podejściem do szybkiego mapowania i identyfikowania zmian.

Screening for Disease Phenotypes

W każdym ekranie dla mutacji wykorzystującym ENU, izolacja mutacji opiera się na badaniu fenotypu, wymagając, aby fenotyp mutanta różnił się znacząco od tła. Jednakże, badanie przesiewowe dla mutacji obejmuje analizę wielu zwierząt, więc badania przesiewowe fenotypu muszą być szerokie i niedrogie. Widoczne fenotypy, które wpływają na oko, sierść, rozmiar lub zachowanie neurologiczne są łatwe do zidentyfikowania, a takie ekrany często dają nowe mutacje. Zachowanie i fenotypy narządów zmysłów mogą być badane przy użyciu standardowych testów na odruchy, utratę wzroku lub słuchu, rozwój motoryczny, równowagę i koordynację, jak również uczenie się i pamięć. Rozwój szkieletu i morfologia tkanek miękkich mogą być badane przy użyciu analizy rentgenowskiej o wysokiej rozdzielczości i niskiej energii. Testy kliniczne wykonywane na krwi myszy mogą dać szeroki wachlarz fenotypów istotnych dla chorób klinicznych u ludzi, mimo że testy wykonywane na płynach ustrojowych myszy muszą być wykonywane w mikroskali. Z powodu istniejących testów w mikroskali dla ludzkich niemowląt, wiele testów klinicznych jest już dostępnych. Pełna morfologia krwi z mikroskopową analizą różnicową może zidentyfikować nieprawidłowości w liczbie lub morfologii czerwonych i białych krwinek, jak również nieprawidłowości płytek krwi. Rozszerzenie analizy komórek krwi za pomocą cytometrii przepływowej może ujawnić inne defekty immunologiczne. Oznaczanie ilościowe przeciwciał przeciwjądrowych może wykryć autoprzeciwciała w surowicy w wielu różnych zaburzeniach autoimmunologicznych, w tym w toczniu rumieniowatym układowym. Testy chemii klinicznej mogą diagnozować anomalie wielu układów organicznych, w tym zaburzenia wątroby, trzustki, serca i nerek. Analiza moczu u myszy ujawnia podwyższony poziom białka lub innych nieprawidłowych produktów ubocznych choroby. Tandemowa spektrometria masowa może wykryć wiele zaburzeń metabolicznych wpływających na lipidy, kwasy tłuszczowe lub aminokwasy. Dodatkowe testy są opracowywane w celu identyfikacji fenotypów neurologicznych, sercowo-naczyniowych, krwiotwórczych i immunologicznych przy użyciu technologii o wysokiej wydajności, takich jak mikromacierze.

Generowanie Zasobów dla Zmutowanych Myszy

Generowanie dużych ilości mutacji stworzy nowe etyczne i naukowe zagadnienia w społeczności myszy: nowe bazy danych i oznaczenia fenotypów będą wymagane, efektywne kosztowo odzyskiwanie mutacji z kriokonserwowanej lub liofilizowanej spermy stanie się istotne, oraz pojawią się kwestie opieki nad zwierzętami i kosztów. Wysiłki te wymagają ogromnych inwestycji w zasoby myszy.

Zasoby genetyczne

Jednym z najpotężniejszych zasobów genetycznych dostępnych obecnie u myszy są szczepy wsobne. Dalsze definiowanie różnorodności genetycznej w tych szczepach jest jednym z priorytetów społeczności myszy, przy czym trwają prace nad stworzeniem bazy danych cech szczepów. Wymaga to przeanalizowania szczepów wsobnych pod kątem wielu parametrów fenotypowych, w tym hematologii klinicznej i chemii, patologii, zachowania i fizjologii.

Utrzymanie, analiza i mapowanie dużej liczby mutacji u myszy będzie wymagało generowania zasobów genetycznych w celu obniżenia kosztów i zmniejszenia liczby błędów. Odczynniki genetyczne, takie jak delecje, są opracowywane za pomocą różnych metod, w tym Cre / loxP i promieniowania ( 22 , 23 , 25 , 32 , 33 ). Chromosomy balansujące mogą być obecnie generowane szybko i wydajnie przy użyciu podejść Cre /loxP ( 24 , 25 ). Transgeniczne myszy zawierające ludzkie YACs lub BACs mogą być użyteczne w badaniach uzupełniających i ratunkowych ( 34 ). Ponieważ zmutowane fenotypy mogą się różnić na różnych podłożach szczepów wsobnych, odczynniki genetyczne powinny być również utrzymywane na standardowych podłożach genetycznych.

Archiwizacja

Wytworzenie dużej liczby stad myszy wymaga wydajnej archiwizacji i rekonstytucji stad. Przechowywanie zarodków myszy poprzez kriokonserwację jest skuteczną techniką, stosowaną już od ponad dekady. Ostatnio, sukcesy w kriokonserwacji nasienia sprawiły, że stała się ona techniką możliwą do zastosowania ( 35-37 ). W szczególności, nasienie myszy może być wykorzystywane do rekonstytucji stad w wielu technologiach wspomaganego rozrodu: sztucznej inseminacji, zapłodnienia in vitro i wewnątrzcytoplazmatycznej iniekcji plemników (ICSI) ( 38 ). Udana rekonstytucja szczepów myszy z liofilizowanych plemników przy użyciu ICSI może zapewnić inną metodę archiwizacji i odnawiania szczepów myszy ( 39 ).

Bazy danych

Bazy danych są już wymagane do obsługi danych genetycznych i fenotypowych myszy. Podstawową bazą danych myszy jest Mouse Genome Database znajdująca się w Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME; http://www.informatics.jax.org ), która zawiera Mouse Locus Catalogue opisujący istniejące mutanty myszy oraz zawierający obszerne informacje mapowe opisujące ich lokalizacje. W celu uproszczenia poszukiwania zmutowanych myszy, ostatnio opracowano International Mouse Strain Resource ( 40 ), który jest odzwierciedlony na dwóch stronach internetowych: Laboratorium Jacksona pod adresem www.jax.org/pub-cgi/imsrlist oraz MRC, Harwell, pod adresem imsr.har.mrc.ac.uk/. Dodatkowo, duże ilości danych fenotypowych będą prawdopodobnie gromadzone na dużych liczbach zmutowanych szczepów myszy, tworząc potrzebę fenotypowych baz danych, które mogą być połączone z bazami danych mapowania i mutagenezy.

Dystrybucja

W celu dostarczenia zasobów genetycznych do społeczności, zmutowane myszy muszą być łatwo dostępne. Chociaż wiele zmutowanych stad jest dostępnych od komercyjnych dostawców lub z Jackson Laboratory, wymagane są dodatkowe centra dystrybucji. Aby sprostać temu zapotrzebowaniu, kilka finansowanych przez NIH Centrów Zasobów Myszy Mutantów będzie służyć jako archiwa zasobów i centra dystrybucji dla różnych regionów USA. Europejskie Archiwum Myszy Mutantów z węzłami w Monteretondo (Roma, Włochy), CNRS (Orlean, Francja), Instytut Gulbenkian (Lizbona, Portugalia) i Instytut Karolinska (Huddings, Szwecja) jest zasobem dla wysiłków europejskich. Te centra zasobów są przeznaczone do dystrybucji wszystkich rodzajów zmutowanego szczepu myszy.

Przyszłość wygląda jasno

Duża liczba zmutowanych zasobów myszy będzie generowana w ciągu następnej dekady, która będzie obejmować myszy niosące delecje, duplikacje, chromosomy balansera, ukierunkowane zakłócenia, pułapkę genową, retrowirusowe lub transgeniczne wstawki oraz mutacje punktowe. Kompilacja tych mutacji do zasobu myszy mutantów będzie wymagała dopracowania ich lokalizacji mapowych u myszy i przewidzenia ich lokalizacji u człowieka. Mutacje będą generować funkcjonalną mapę genomu, która może być skorelowana z mapą sekwencji i transkryptów w celu zapewnienia bogatego zasobu informacji funkcjonalnych ( Ryc. 3 ). Duża liczba mutacji wywołanych ENU została już wyprodukowana, które reprezentują jedynie ułamek potencjału mutacyjnego genomu ssaków, a dodatkowe eksperymenty wygenerują nowe modele chorób ludzkich oraz ujawnią nowe ścieżki rozwojowe ssaków. Nasze spojrzenie na funkcję genów u ssaków zostanie dramatycznie i trwale zmienione przez te eksperymenty, co będzie miało ogromny wpływ na rozwój leków i zdrowie ludzkie.

Podziękowania

Autorzy dziękują Yin-Chai Cheah za pomoc w sfinalizowaniu manuskryptu. Prace nad chromosomem 11 są finansowane z grantu P01 CA75719 Departamentu Zdrowia Publicznego USA. A.B. jest badaczem Howard Hughes Medical Institute.

.