TEXT

Yersinia pestis is de etiologische agent van de pest en kan mogelijk als biologisch wapen worden gebruikt (1, 13, 17-20, 23). Daarom is het belangrijk dat opkomende geneesmiddelenresistentie, of die nu natuurlijk of gemanipuleerd is, kan worden gedetecteerd met gestandaardiseerde methoden die gemakkelijk in meerdere laboratoria kunnen worden toegepast. Het “Clinical and Laboratory Standards Institute” (CLSI) beschrijft een referentiemethode voor bouillon-microdilutie (BMD) voor antimicrobiële gevoeligheidstests van Y. pestis en geeft MIC-interpretatierichtsnoeren voor acht antimicrobiële stoffen (6). BMD maakt gebruik van voor kationen gecorrigeerde Mueller-Hinton bouillon (CAMHB) en vereist incubatie bij 35°C gedurende 24 uur met een optie voor incubatie gedurende 48 uur wanneer de groei bij 24 uur onvoldoende is voor de interpretatie van het eindpunt. Helaas is referentie-BMD in veel laboratoria moeilijk toe te passen omdat het relatief duur en bewerkelijk is en de panels in bevroren of gedehydrateerde vorm moeten worden bewaard. Er bestaan verscheidene alternatieve gevoeligheidstestmethoden, waaronder de schijfdiffusie- en de Etest-methode. Voordat deze methoden echter voor een bepaalde soort kunnen worden gebruikt, moeten zij worden geëvalueerd en vergeleken met BMD om correlaties te bepalen tussen de resultaten die door vergelijking van de methoden worden verkregen.

Y. pestis isolaten zijn kieskeurig en groeien langzamer op kunstmatige media dan andere gewone soorten Enterobacteriaceae, en daarom zijn gevoeligheidstestmethoden voor Y. pestis moeilijk te standaardiseren geweest. In de literatuur worden verschillende methoden beschreven. Schijfdiffusietests zijn in het algemeen uitgevoerd op Mueller-Hinton agar (MHA), meestal met 48 uur incubatie bij 35°C, maar methodologische beschrijvingen zijn soms niet gedetailleerd (10, 16, 24). De Etest-methode werd toegepast door Wong et al. (25) met gebruikmaking van MHA met 5% schapenbloed, incubatie bij 35°C, en een inoculum dat overeenkomt met een nr. 1 McFarland in plaats van de 0,5 McFarland-standaard die in de meeste schijf- of Etest-diffusieonderzoeken wordt gebruikt. Agarverdunning, met MHA dat gedurende 48 uur bij 27° tot 30°C wordt geïncubeerd, is de meest gebruikelijke methode die in de literatuur wordt vermeld (7, 8, 11, 12, 22). Ook bouillonmacrodilutie- en microdilutiemethoden zijn gebruikt met verschillende incubatietemperaturen (2, 21).

Er zijn verschillende eigenschappen van schijfdiffusie- en Etest-methoden die deze aantrekkelijke alternatieve methoden voor gevoeligheidstests maken, waaronder het gemak van opslag en de lange houdbaarheid van de schijven en strips. Bovendien zijn deze methoden op agar gebaseerd en kunnen de eindpunten gemakkelijker worden afgelezen dan die van BMD. De Etest heeft als bijkomend voordeel dat hij een MIC-resultaat oplevert. In dit rapport presenteren wij de resultaten van een multicenter onderzoek waarin Etest en schijfdiffusiemethoden worden vergeleken met de CLSI-referentie BMD-methode voor gevoeligheidstests van Y. pestis.

(Dit rapport werd gedeeltelijk gepresenteerd tijdens de 107e Algemene Vergadering van de American Society for Microbiology, Toronto, Canada, 21 tot 25 mei 2007.)

Zesentwintig verschillende Y. pestis-stammen uit de collecties van de Centers for Disease Control and Prevention (CDC) en het U.S. Army Medical Research Institute of Infectious Diseases (USAMRIID) werden getest met zowel de Etest- als de BMD-methode op vier testlocaties en aanvullend met schijfdiffusie op twee van deze locaties. Zes stammen waren biovar Antiqua, zeven waren biovar Medievalis en 12 waren biovar Orientalis; één atypisch isolaat kon niet bij een biovar worden ingedeeld. De antimicrobiële stoffen werden getest met zowel BMD als Etest (bioMérieux, Durham, NC), en hun overeenkomstige bereiken waren als volgt voor BMD en Etest, respectievelijk: voor chlooramfenicol, 0,03 tot 64 μg/ml en 0,016 tot 256 μg/ml; voor ciprofloxacine, 0,03 tot 64 μg/ml en 0,002 tot 32 μg/ml; voor doxycycline, 0,03 tot 64 μg/ml en 0,016 tot 256 μg/ml; voor doxycycline, 0,03 tot 64 μg/ml en 0,016 tot 256 μg/ml.016 tot 256 μg/ml; voor gentamicine, 0,03 tot 64 μg/ml en 0,016 tot 256 μg/ml; voor levofloxacine, 0,06 tot 64 μg/ml en 0,002 tot 32 μg/ml; voor streptomycine, 0,03 tot 64 μg/ml en 0.016 tot 256 μg/ml; voor tetracycline, 0,03 tot 64 μg/ml en 0,016 tot 256 μg/ml; en voor trimethoprim-sulfamethoxazol, 0,015/32 tot 16/304 μg/ml en 0,002/0,038 tot 32/608 μg/ml. Omdat de bereiken voor de BMD-test van sommige geneesmiddelen niet de lagere concentraties omvatten die met de Etest konden worden verkregen, werd de essentiële overeenstemming (± 1 log2 verdunning) tussen de methoden voor sommige resultaatvergelijkingen als buiten de schaal vallend beschouwd (bv. een BMD MIC van levofloxacine van ≤ 0,06 μg/ml en een Etest MIC van 0,03 μg/ml). Bij het CDC werden 96-well MIC-platen bereid met 100 μl CAMHB (BBL, Sparks, MD) per well; de platen werden bevroren bij -70 °C bewaard en naar de deelnemende laboratoria verzonden. De tests werden uitgevoerd volgens de CLSI-standaardmethoden voor BMD en schijfdiffusie (4-6). Inocula werden bereid uit 18- tot 24-uurs aerobe culturen gekweekt op 5% schapenbloed agar platen (BBL) door de directe koloniesuspensie methode in Mueller-Hinton bouillon (MHB) (Remel, Lenexa, KS) om een 0,5 McFarland troebelheidsstandaard (4) te evenaren; dezelfde inocula werden gebruikt om MHA-platen met een diameter van 150 mm te inoculeren voor Etest- en schijfdiffusietests. Onmiddellijk na de inoculatie werden op elke testlocatie ten minste twee willekeurige kolonietellingen verricht met de positieve BMD-groeicontroleput om de grootte van het inoculum te bepalen. Er werden niet meer dan vier Etest-strips op een plaat aangebracht. Voor schijfdiffusie werden in de handel verkrijgbare schijven (BBL) aangebracht met een zelfstempelende multidisk-dispenser (BBL). BMD-panelen en MHA-platen voor zowel Etest- als schijfdiffusie werden geïncubeerd bij 35°C en afgelezen na 24 en 48 uur. Etests werden als volgt afgelezen volgens de aanwijzingen in de bijsluiters van de Etest-verpakking: chlooramfenicol, doxycycline, tetracycline en trimethoprim-sulfamethoxazol werden afgelezen bij 80% remming voor het snijpunt; ciprofloxacine, levofloxacine, gentamicine en streptomycine werden afgelezen bij 100% remming. Voor de gegevensanalyse werden de Etest-MIC’s naar boven afgerond tot de dichtstbijzijnde log2-verdunning. Escherichia coli ATCC 25922 en Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 werden gebruikt voor BMD en Etest kwaliteitscontrole. MIC’s voor kwaliteitscontrolestammen werden bepaald door incubatie gedurende 16 tot 20 uur. Aanvaardbare BMD-kwaliteitscontrolebereiken voor streptomycine werden eerder door het CDC vastgesteld (ongepubliceerde gegevens). Kwaliteitscontrole van de chlooramfenicol Etest werd uitgevoerd door Escherichia coli ATCC 25922 te testen en het aanvaardbare bereik voor de CLSI BMD toe te passen.

Om de overeenstemming tussen de Etest- en BMD-resultaten te meten, werd de verdeling van de verschillen in de log2-verdunnings-MIC’s onderzocht en werd voor elk geneesmiddel het percentage MIC-bepalingen berekend dat identieke waarden opleverde (essentiële overeenstemming binnen de nauwkeurigheidsgrenzen van de referentiemethode ). Om te bepalen of de Etest-methode significant lagere of hogere MIC’s opleverde dan de referentiemethode, hebben we ook een Wilcoxon signed-rank test uitgevoerd met de log2-verdunnings-MIC’s van de twee tests met behulp van statistische software van SAS (SAS Institute Inc., Cary, NC); MIC’s binnen ± 1 log2-verdunning werden voor deze test als identiek beschouwd. Vergelijking van de resultaten van de interpretatiecategorieën (vatbaar, intermediair en resistent) vond plaats door berekening van de percentages kleine, grote en zeer grote fouten.

In het algemeen waren de MIC-eindpunten bij BMD gemakkelijker te onderscheiden dan bij Etest na 24 uur (gegevens niet aangetoond). Op drie testlocaties (A, B, en C) waren bijna alle BMD en Etest MIC’s afleesbaar na 24 uur incubatie; een enkel Etest resultaat was de uitzondering. Op locatie D waren de BMD-MIC’s na 24 uur voor alle stammen op één na afleesbaar. Er was onvoldoende groei om 24-uurs Etest-MIC’s af te lezen voor acht stammen op locatie D. Het aantal Etest-MIC’s dat onleesbaar was als gevolg van onvoldoende groei na 24 uur per geneesmiddel was als volgt: voor chlooramfenicol, n = 6; voor ciprofloxacine, n = 4; voor doxycycline, n = 3; voor gentamicine, n = 2; voor levofloxacine, n = 5; voor streptomycine, n = 5; voor tetracycline, n = 4; en voor trimethoprim-sulfamethoxazol, n = 4. Op alle testpunten konden de resultaten na 48 uur worden afgelezen. Daarom werden de resultaten na 48 uur in de vergelijking gebruikt. Kolonietellingen toonden aan dat de inoculumdichtheden in de BMD-putjes voor alle vier de testlocaties binnen aanvaardbare grenzen lagen; de gemiddelden voor de locaties varieerden van 1,1 × 105 CFU/ml tot 4,2 × 105 CFU/ml.

De MIC90 en het MIC-bereik voor elk antimicrobieel middel werden per methode vergeleken (tabel 1). Voor alle middelen, behalve chlooramfenicol, waren de MIC90’s voor alle methoden gelijk of binnen ± 1 log2 verdunning van elkaar. De categorie overeenkomst tussen de Etest en BMD methoden voor alle geneesmiddelen was uitstekend met 97% tot 100%; alle fouten waren gering (Tabel 1). Alle BMD en Etest MICs waren binnen het vatbaarheidsbereik na 24 uur incubatie (gegevens niet aangetoond). Na 48 uur lagen de meeste MIC’s binnen het vatbaarheidsbereik, met uitzondering van de volgende niet-vatbare resultaten: chlooramfenicol (n = 2); ciprofloxacine (n = 1); en streptomycine (n = 5). De meeste niet-vatbare resultaten waren eerder van de BMD-methode dan van de Etest (Fig. 1).

De twee methoden kunnen het best met elkaar worden vergeleken door de essentiële overeenstemming (het percentage MIC’s binnen ± 1 log2 verdunning voor de twee methoden) te analyseren. De essentiële overeenstemming voor alle locaties samen (inclusief off-scale MIC’s) was ≥90% voor ciprofloxacine, doxycycline, levofloxacine, streptomycine, en tetracycline. De waarden voor essentiële overeenstemming voor gentamicine, trimethoprim-sulfamethoxazol, en chlooramfenicol waren lager, met respectievelijk 88%, 78%, en 35%. Behalve voor chlooramfenicol en trimethoprim-sulfamethoxazol, was er over het algemeen weinig of geen variatie in essentiële overeenstemming tussen de locaties voor elk geneesmiddel (tabel 3). Voor chlooramfenicol en trimethoprim-sulfamethoxazol varieerde de essentiële overeenstemming tussen MIC-methoden op afzonderlijke locaties van 4% tot 81% en van 58% tot 96%, respectievelijk.

De Etest-MIC’s voor gentamicine en doxycycline waren significant (P = 0.03) hoger dan de overeenkomstige BMD-MIC’s (tabel 2); de waarden voor de essentiële overeenstemming tussen de methoden voor elk geneesmiddel waren echter nog steeds goed, respectievelijk 88% en 93% (tabel 2). Chlooramfenicol, ciprofloxacine, en trimethoprim-sulfamethoxazol Etest MIC’s waren gemiddeld significant (P < 0,001) lager dan hun overeenkomstige BMD MIC’s, en alleen ciprofloxacine had een essentiële overeenkomst van ≥90%. Voor levofloxacine, streptomycine, en tetracycline werden geen statistische verschillen gezien tussen Etest en BMD MIC’s.

Voor schijfdiffusie produceerden alle antimicrobiële schijven behalve de streptomycine schijven zones met een grote diameter; sommige zones overschreden 40 tot 50 mm in diameter (Tabel 4) en overlapten elkaar op de MHA plaat. De zonemarges voor geneesmiddelen die deze grote zones produceerden waren vaak vaag of onduidelijk. Twee isolaten op één testlocatie hadden onleesbare zones voor alle middelen vanwege slechte groei na 24 uur. Chlooramfenicol- en trimethoprim-sulfamethoxazol-schijven produceerden af en toe een dubbele-zone-effect met een lichtere binnenrand van groei, mogelijk als gevolg van de statische activiteit van het middel bij dit langzaam groeiende organisme. Streptomycine-schijven produceerden de laagste (23- tot 24-mm-diameter) gemiddelde schijfzone-inhibitiegrootte en de meest duidelijke, afleesbare zones. De diameter van de zones van de andere soorten schijven bedroeg gemiddeld 30 tot 42 mm na 48 uur, en hun diameters waren moeilijker af te lezen.

In het algemeen was er een goede essentiële overeenstemming tussen de Etest-methode en de BMD-referentiemethode voor antimicrobiële gevoeligheidstests. De percentages van essentiële overeenstemming tussen Etest en BMD voor chlooramfenicol, gentamicine en trimethoprim-sulfamethoxazol waren echter lager dan het minimum van 90% dat door de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) wordt aanbevolen voor het gebruik van een nieuwe methode bij klinische tests (http://www.fda.gov/downloads/MedicalDevices/DeviceRegulationandGuidance/GuidanceDocuments/ucm071462.pdf).

Verschillen in lichtintensiteit in de biologische veiligheidskast op elke testlocatie kunnen een factor zijn die bijdraagt aan de bepaling van het eindpunt. Wij hebben geconstateerd dat het aflezen van een Etest-eindpunt gemakkelijker gaat als er een leeslamp in de kast is geplaatst om de lichtbron aan te vullen. Alle locaties, behalve locatie D, hebben deze extra lichtbron gebruikt om de leesbaarheid van de gevoeligheidstests te verbeteren. Tetracycline en doxycycline Etests werden, net als die van chlooramfenicol en trimethoprim-sulfamethoxazol, ook afgelezen op een 80% eindpunt, maar er waren geen dubbele ellipsen waarneembaar en de essentiële overeenstemming was ≥90% voor beide tetracycline-klasse geneesmiddelen, dus het lijkt erop dat dit Etest fenomeen varieert per geneesmiddelklasse voor Y. pestis.

Voor gentamicine was de algemene essentiële overeenstemming 88%, net onder de aanbevolen 90% overeenstemming cutoff. Twee sites toonden een hoge (96%) essentiële overeenstemming, maar de overeenstemming was lager (77% en 81%) voor de andere twee sites. De reden voor deze variabiliteit is onbekend. De algemene MIC-verdelingen voor Etest en BMD MICs zijn echter vergelijkbaar (Fig. 1). Er is gesuggereerd dat voor nieuwe gevoeligheidmethoden die worden uitgevoerd met langzaam groeiende of snelwerkende organismen, het testen minder strikt aan deze norm moet worden gehouden en dat een lagere essentiële overeenkomst toelaatbaar is (14). Deze logica lijkt van toepassing op de gentamicine Etest, aangezien de essentiële overeenstemming 88% bedroeg. De aanvaardbaarheid van de trimethoprim-sulfamethoxazol Etest bij 78% essentiële overeenstemming is onduidelijk.

Een beperking van deze studie was dat er geen isolaten met bekende resistentie werden geïncludeerd. De toegang tot de medicijnresistente stammen van Madagaskar (3, 9-11) is beperkt. Andere meldingen van resistentie tegen geneesmiddelen in Y. pestis zijn zeldzaam, en resistente stammen zijn niet goed gekarakteriseerd (15, 16, 24). Daarom konden we het vermogen van de Etest-methode om bekende resistentie in Y. pestis te detecteren niet evalueren.

De schijfdiffusiemethode wordt niet aanbevolen voor Y. pestis vanwege de moeilijkheid bij het aflezen van de slecht gedefinieerde remmingszones en de grote zonediameters die bij de meeste geteste geneesmiddelen voorkomen. Streptomycine-schijftesten kunnen verdere studie rechtvaardigen als streptomycine-resistente isolaten toegankelijk worden, omdat de zone-groottes kleiner en meer uitgesproken waren dan die verkregen met andere schijven.

Samenvattend, in een vergelijking van twee MIC-methoden voor Y. pestis-gevoeligheidstesten, correleerden de resultaten voor alle antimicrobiële middelen goed tussen Etest en BMD, behalve voor chlooramfenicol en trimethoprim-sulfamethoxazol, waarvoor de eindpunten moeilijk te bepalen waren met Etest. Er was ook een grotere variabiliteit van plaats tot plaats voor chlooramfenicol en trimethoprim-sulfamethoxazol dan voor de andere geneesmiddelen. De Etest methode lijkt een acceptabel alternatief voor BMD voor ciprofloxacine, doxycycline, gentamicine, levofloxacine, streptomycine, en tetracycline, maar niet voor chlooramfenicol en trimethoprim-sulfamethoxazol. Aangezien Y. pestis langzaam groeit op MHA, wordt voor Etest een incubatieperiode van 48 uur aanbevolen. Aangezien wij echter geen geneesmiddelenresistente Y. pestis-stammen in ons onderzoek hebben kunnen opnemen, wordt ook aanbevolen om niet-resistente Etest-MIC’s te bevestigen met een BMD-referentie-MIC-test. Wij adviseren ook dat bevestigende BMD-testen worden uitgevoerd op elk Y. pestis-isolaat met een Etest-MIC van ciprofloxacine of levofloxacine van 0,25 μg/ml, een MIC aan de bovengrens van het gevoeligheidsbereik, aangezien onbekend is of opkomende resistentie voor deze twee geneesmiddelen kan worden gedetecteerd met de Etest-methode.