El cáncer colorrectal hereditario sin poliposis (HNPCC) es un trastorno genéticamente heterogéneo causado por mutaciones de la línea germinal en uno de varios genes MMR (Jiricny, 1998a,b), aunque las pruebas actuales sugieren que las mutaciones de la línea germinal en hMSH2 y hMLH1 representan la mayoría de los casos de HNPCC (Peltomäki y Vasen, 1997). Los portadores del gen HNPCC heredan una mutación en uno de los alelos que codifican un gen MMR, y la segunda copia muta o se pierde como un evento temprano en el desarrollo de un tumor. Este segundo evento hace que las células sean deficientes en la reparación de los desajustes del ADN (MMR), lo que presumiblemente conduce a la rápida acumulación de mutaciones que impulsa el desarrollo del tumor. Queda por dilucidar qué causa exactamente la predisposición subyacente al cáncer colorrectal en los individuos con HNPCC. Se ha demostrado que un ensamblaje preciso de los complejos MMR humanos es esencial para una MMR eficiente a fin de mantener la integridad genómica (Drummond et al., 1997). Estos datos sugieren que, dependiendo de la naturaleza de la mutación en los genes MMR, y de la expresión de éstos, la composición, y con ello la actividad, de los complejos de reparación del ADN varía entre los individuos del HNPCC. Además, la participación de al menos hMLH1 y hMSH2 en otras vías celulares, como la recombinación del ADN y la regulación del punto de control del ciclo celular (Jiricny, 1998a,b), que controlan la estabilidad del genoma, puede verse afectada por mutaciones en los genes hMLH1 y hMSH2. Por lo tanto, el desarrollo del tumor y el curso de la enfermedad pueden variar entre las familias de HNPCC (Jäger et al., 1997). La importancia de las interacciones proteína-proteína en los complejos de reparación está respaldada por los hallazgos de que hMSH2 existe en complejo con hMSH6 (hMutSα) o hMSH3 (hMutSβ) y la proteína hMLH1 en complejo con hPMS2 (hMutLα), hPMS1 (hMutLβ) o hMLH3 (Drummond et al., 1995; Li y Modrich, 1995; Lipkin et al., 2000; Palombo et al., 1995; Papadopoulos et al., 1995; Räschle et al., 1999). También se ha demostrado que la proteína hMSH2 interactúa con la exonucleasa humana 1 (hEXO1) (Rasmussen et al., 2000; Schmutte et al., 1998). Aunque no se sabe si la hEXO1 está implicada en la MMR, las cepas de levadura deficientes en la actividad de la exonucleasa 1 muestran un aumento de las tasas de mutación espontánea y un pequeño incremento de la recombinación cuando el heterodúplex intermedio contiene desajustes de bases o pequeños bucles (Nicholson et al., 2000; Tischkoff et al., 1997, 1998). Se sabe que tanto la exonucleasa 1 (EXO1) como las proteínas MMR participan en la recombinación homóloga (Fiorentini et al., 1997; Saparbaev et al., 1996; Sugawara et al., 1997) y que la levadura EXO1 desempeña un papel en la reparación de roturas de doble cadena y en el crossing over meiótico (Tsubouchi y Ogawa, 2000).

Muchos estudios de HNPCC se han centrado en la identificación de mutaciones en los genes hMLH1 y hMSH2. Sin embargo, el análisis mutacional de estos genes no determina los defectos moleculares y bioquímicos subyacentes a esta enfermedad. Para mejorar la comprensión de la relación entre la pérdida de la función del gen hMLH1 y el HNPCC, caracterizamos las interacciones proteínicas específicas de los complejos hMutLα y hMLH1-hEXO1, utilizando las formas mutantes de hMLH1 encontradas en los pacientes de HNPCC. Empleamos el sistema de dos híbridos de levadura, así como un ensayo de interacción de fusión (pull-down) con la glutatión S-transferasa (GST) para estudiar dichas interacciones proteína-proteína in vivo e in vitro, respectivamente.

La proteína hMLH1 existe predominantemente en un complejo con hPMS2 también conocido como el heterodímero hMutLα (Li y Modrich, 1995). La formación de un complejo hMutLα es esencial para la actividad MMR (Baker et al., 1995, 1996; Edelmann et al., 1996) y, por tanto, la incapacidad de las proteínas HNPCC-hMLH1 para formar un complejo con hPMS2 podría dar lugar a una actividad MMR ineficiente en los individuos HNPCC. Para investigar la posible causa subyacente al HNPCC, examinamos si tres mutantes de hMLH1 identificadas en pacientes daneses de HNPCC (Figura 1) eran capaces de interactuar con hPMS2. Las mutaciones incluían una mutación sin sentido de treonina a metionina en el codón 117 (T117M) de hMLH1 y dos nuevas mutaciones HNPCC, una mutación sin sentido (CAG a TAG) en el codón 426 (Q426X) y una mutación de cambio de marco (inserción de A en el nucleótido 1813) que da lugar a una parada prematura en el codón 609 (1813insA) (Figura 1). El ensayo de pull-down con proteínas HNPCC recombinantes marcadas con GST y hPMS2 transcrita y traducida in vitro (IVTT) reveló, como se esperaba, la formación de un complejo entre hMLH1 y hPMS2 (Figura 2a, carriles 5 y 10). Además, detectamos la formación de un complejo entre HNPCC-hMLH1 (T117M) y hPMS2 (Figura 2a, carril 11). Aunque descubrimos que la proteína HNPCC-hMLH1 (T117M) se expresa en las células eucariotas NIH3T3 (datos no mostrados), no pudimos reproducir la interacción con hPMS2 en el ensayo de dos híbridos de levadura (Figura 3a). Una explicación de esta discrepancia podría ser la formación de complejos tres veces menor entre hPMS2 y la proteína mutante HNPCC-hMLH1 (T117M) en comparación con las proteínas hPMS2 y hMLH1, tal como se cuantificó con un fosfómetro (datos no mostrados) (Figura 2a, carriles 10 y 11). En cambio, no se detectaron formaciones complejas entre los truncamientos de la proteína hMLH1, HNPCC-hMLH1 (Q426X) y HNPCC-hMLH1 (1813insA), y hPMS2 en ninguno de los ensayos (Figura 2a, carriles 12 y 13 y Figura 3a). En la reacción de pull-down que contenía HNPCC-hMLH1 (1813insA) y hPMS2 era visible una banda débil (Figura 2a, carril 13), pero la intensidad era similar a la banda obtenida en la reacción que contenía sólo la proteína hPMS2 (Figura 2a, carril 3) y es, por tanto, poco probable que represente un verdadero complejo entre HNPCC-hMLH1 (1813insA) y hPMS2.

(a) Alineación de la secuencia de la familia MutL. hMLH1: homólogo de MutL humano hMLH1, yMLH1: homólogo de MutL de Saccharomyces cerevisiae MLH1, MutL: MutL de Escherichia coli. Los residuos conservados se muestran en negrita. La alineación de secuencias se realizó mediante ClustalW Multiple Sequence Alignment. (b) Estructuras de las proteínas hPMS2, hMLH1, HNPCC-hMLH1 (T117M), HNPCC-hMLH1 (Q426X), HNPCC-hMLH1 (1813insA), hEXO1a/HEX1, hEXO1b, hEXO1a/HEX1-N-terminal, hEXO1a/HEX1-C-terminal y hEXO1b-C-terminal (Y5). Se identificaron tres familias danesas diagnosticadas de HNPCC a través del registro danés de HNPCC. Se identificaron dos nuevas mutaciones de HNPCC, una mutación sin sentido (CAG a TAG) en el codón 426 (Q426X) y una mutación de cambio de marco (inserción de A en el nucleótido 1813) que da lugar a una parada prematura en el codón 609 (1813insA) de hMLH1, en familias que cumplían los criterios de Amsterdam. La tercera mutación, una mutación sin sentido de treonina a metionina en el codón 117 (T117M) de hMLH1 se ha descrito previamente (www.nfdht.nl/database/mlh1-4.htm). La región codificante de hMLH1 se clonó en el sitio EcoRI de pcDNA3 y se utilizó como plantilla para la mutagénesis mediada por cebadores para construir las tres diferentes mutaciones HNPCC en hMLH1, T117M, Q426X y 1813insA. La secuencia de ADN de todas las mutaciones sintéticas y de los fragmentos amplificados por PCR se confirmó mediante secuenciación de ADN. Las otras construcciones utilizadas en este estudio son hPMS2 (ADNc completo), HEX1-N (región N-terminal de 1355 pb de HEX1/hEXO1a), HEX1-C (región C-terminal de 1182 pb de HEX1/hEXO1a) y hEXO1b-C (Y5) (región C-terminal de 1952 pb de hEXO1b). Todas las construcciones de hEXO1 se describen en detalle en Rasmussen et al., 2000)

Ensayo de proteína de fusión GST para estudiar la interacción entre las proteínas hMLH1 y hEXO1b o hPMS2. (a) Carril 1, proteína hPMS2 etiquetada por IVTT; carril 2,+perlas GST; carril 3,+lisado de BL21; carril 4,+proteína GST purificada; carril 5,+proteína GST-hMLH1 purificada; carril 6, proteína GST-hMLH1 purificada y vector IVTT etiquetado; carril 7, proteína GST-HNPCC-hMLH1 purificada (T117M) y vector IVTT etiquetado; carril 8, proteína GST-HNPCC-hMLH1 purificada (Q426X) y vector IVTT etiquetado; carril 9, proteína GST-HNPCC-hMLH1 (1813insA) purificada y vector IVTT etiquetado; carril 10, proteína GST-hMLH1 purificada y proteína hPMS2 IVTT etiquetada; carril 11, proteína GST-HNPCC-hMLH1 (T117M) purificada y proteína hPMS2 IVTT etiquetada; carril 12, proteína purificada GST-HNPCC-hMLH1 (Q426X) y proteína marcada IVTT hPMS2; y carril 13, proteína purificada GST-HNPCC-hMLH1 (1813insA) y proteína marcada IVTT hPMS2. (b) Carril 1, proteína IVTT hEXO1b; carril 2, +perlas GST; carril 3, +lisado BL21; carril 4, +proteína GST purificada; carril 5, +proteína GST-hMLH1 purificada; carril 6, proteína GST-hMLH1 purificada y vector IVTT etiquetado; carril 7, proteína GST-hMSH2 purificada y proteína IVTT hEXO1b etiquetada; carril 8, proteína GST-hMLH1 purificada y proteína hEXO1b etiquetada de IVTT; carril 9, proteína GST-HNPCC-hMLH1 (T117M) purificada y proteína hEXO1b etiquetada de IVTT; carril 10, proteína GST-HNPCC-hMLH1 (Q426X) purificada y proteína hEXO1b marcada; y carril 11, proteína GST-HNPCC-hMLH1 (1813insA) purificada y proteína hEXO1b marcada. Todas las reacciones de traducción de la transcripción in vitro se llevaron a cabo utilizando el sistema de lisado de reticulocitos acoplado TNT (Promega). Brevemente, los lisados se incubaron con 1 μg de ADN, una mezcla de aminoácidos sin cisteína, 35S-cisteína y la ARN polimerasa T9, durante 90 minutos a 30°C, según las instrucciones del fabricante. Se utilizó el vector pGEX (Pharmacia-Amersham) para construir GST-hMLH1, GST-hMLH1 (T117M), GST-hMLH1 (Q426X), GST-hMLH1 (1813insA) y GST-hMSH2. Todas las construcciones pGEX son proteínas de fusión GST N-terminal. La secuenciación del ADN de la región codificante completa confirmó todas las construcciones. Las proteínas de fusión se purificaron según lo descrito por Guerrette et al. (1998), salvo que se utilizaron cultivos de E. coli no inducidos. Los ensayos de pull-down se realizaron según lo descrito por Guerrette et al. (1998), excepto la incubación de las proteínas durante 2 h a 30°C antes de cargar las mezclas de reacción en los geles

Interacción de hMLH1, HNPCC-hMLH1 (T117M), HNPCC-hMLH1 (Q426X) y HNPCC-hMLH1 (1813insA) con hPMS2 o hEXO1 en el sistema de dos híbridos de levadura. (a) La actividad β-galactosidasa, listada como unidades Miller, se determinó como se describe en Rasmussen et al. (2000). (b) y (c) Las cepas que contenían varios plásmidos se extendieron en placas SD-LEU-TRP+X-gal. Los plásmidos contenidos en cada cepa probada se indican en la parte superior de cada columna y a la izquierda de cada fila. AD: dominio de activación, BD: dominio de unión. Se utilizaron los vectores de hibridación en levadura pAS2-1, pBRIDGE y pACT2 (CLONTECH) para construir las proteínas de fusión GAL4. Los ensayos de hibridación en levadura se realizaron como se ha descrito previamente (Rasmussen et al., 2000). Brevemente, las regiones codificantes de hMLH1 o HNPCC-hMLH1 se amplificaron por PCR y se clonaron en los sitios EcoRI y BamHI de pBRIDGE o en los sitios NcoI y BamHI de pACT2. hPMS2 se amplificó por PCR utilizando pREP4-hPMS2 (Risinger et al., 1998) como plantilla y se clonó en el sitio NdeI y BamHI de pAS2-1 y en los sitios SmaI y EcoRI de pACT2. Todos los demás plásmidos se describen en Rasmussen et al. (2000). Ninguno de los plásmidos mostró ninguna interacción con los vectores de dos híbridos sin inserción

Consistentemente, se ha demostrado previamente mediante mutagénesis de deleción que la interacción de hMLH1 y hPMS2 está mediada a través de la parte C-terminal de hMLH1 (aminoácidos 506-756) y la parte C-terminal de hPMS2 (aminoácidos 675-850) (Figura 1b) (Guerrette et al., 1999). La mutación HNPCC-hMLH1 (T117M) se ha notificado en nueve familias HNPCC no relacionadas de diferentes partes del mundo (www.nfdht.nl/database/mlh1-4.htm y datos no mostrados), lo que sugiere, como ya se ha demostrado en la levadura (Shcherbakova y Kunkel, 1999; Shimodaira et al., 1998), que la mutación no es un polimorfismo ligado. La mutación HNPCC-hMLH1 (T117M) se sitúa en una secuencia conservada (Figura 1), que se cree que está directamente implicada en la unión y/o hidrólisis del ATP (Ban et al., 1999). Por lo tanto, la mutación de sentido erróneo HNPCC-hMLH1 (T117M) puede inactivar la actividad MMR al alterar la capacidad de esta proteína mutante para unir y/o hidrolizar ATP y con ello la formación de complejos con otras proteínas MMR. De acuerdo con esta hipótesis, mostramos que los individuos con HNPCC que portan las mutaciones HNPCC-hMLH1 (T117M), HNPCC-hMLH1 (Q426X) y HNPCC-hMLH1 (1813insA) presentan un deterioro en la formación del heterodímero hMutLα, lo que conduce a un defecto en la actividad MMR cuando el segundo alelo hMLH1 se pierde o se inactiva.

En un intento de identificar factores asociados a MMR específicos de tejido, nosotros y otros hemos identificado recientemente una exonucleasa humana que interactúa con hMSH2 (Rasmussen et al., 2000; Schmutte et al., 1998; Tishkoff et al., 1998; Wilson III et al., 1998). Hemos demostrado que hMSH2 interactúa con ambas formas de hEXO1, hEXO1b y hEXO1a/HEX1, y que esta interacción está mediada por sus dominios C-terminales. En cambio, no detectamos ninguna interacción entre hMSH6 y hEXO1 en el sistema de dos híbridos (Rasmussen et al., 2000). No se sabe si hEXO1 desempeña un papel en la MMR o si su interacción con hMSH2 es importante para la recombinación. Demostramos que la proteína hMLH1, al igual que hMSH2, interactúa con ambas formas de hEXO1 (hEXO1b y hEXO1a/HEX1) y que esta interacción está mediada por los dominios C-terminales de las exonucleasas (Figura 2b, carriles 5 y 8 y Figura 3). No detectamos ninguna interacción entre hPMS2 y hEXO1 (Figura 3a,c). Nuestros datos preliminares sugieren que la presencia de las proteínas hMLH1 y hPMS2 no impidió que hEXO1 se uniera a hMLH1 (datos no mostrados). Por lo tanto, no creemos que la formación de hMutLα bloquee necesariamente la unión de hEXO1 a hMLH1. Para caracterizar mejor la interacción hMLH1-hEXO1 construimos fusiones de proteínas fluorescentes tanto de hMLH1 como de hEXO1 y las introdujimos en células NIH3T3 (Figura 4). Nuestros resultados revelan que CFP-hMLH1 está presente principalmente en el núcleo, pero también detectamos una fracción de esta proteína en el citoplasma (Figura 4, panel 1). En cambio, sólo detectamos YFP-hEXO1 en el núcleo (Figura 4, panel 2). Sin embargo, tras la cotransfección con YFP-hEXO1, la CFP-hMLH1 era totalmente nuclear (Figura 4, paneles 3 y 4).

Localización nuclear de las proteínas de fusión CFP-hMLH1 y YFP-hEXO1b. El día del tratamiento se transfectaron transitoriamente células murinas NIH3T3 con 3,5 μg de CFP-hMLH1 (panel 1) o de YFP-hEXO1b (panel 2) o ambas construcciones (paneles 3 y 4). Las células se incubaron durante la noche y al día siguiente se examinó la localización subcelular de las proteínas de fusión mediante microscopía confocal de barrido láser. Las células transfectadas se muestran además en la correspondiente imagen de Nomarski. El ADNc de hMLH1 se clonó en los sitios EcoRI y BamHI del vector pECFP-C2 (CLONTECH) y el ADNc de hEXO1b se clonó en los sitios BamHI y SalI del vector pEYFP-C1 (CLONTECH). Ambas construcciones de proteínas fluorescentes son fusiones N-terminales

En resumen, estos resultados demuestran que al menos dos proteínas MMR, a saber, hMSH2 y hMLH1, interactúan con la exonucleasa humana 1, mientras que otras dos proteínas MMR, hPMS2 y hMSH6, no participan directamente en la interacción con hEXO1 cuando se evalúan en el ensayo de dos híbridos in vivo.

Para examinar si las interacciones de hMLH1 y hEXO1 podrían estar afectadas en pacientes con HNPCC, se caracterizó la asociación de las tres proteínas mutantes de hMLH1 descritas anteriormente con hEXO1. Sólo se demostró una interacción positiva entre HNPCC-hMLH1 (T117M) y la proteína hEXO1b de longitud completa mediante el ensayo de pull-down in vitro (Figura 2b, carril 9). Sin embargo, utilizando el ensayo de dos híbridos in vivo no se pudieron detectar interacciones proteínicas entre las proteínas HNPCC-hMLH1 y las construcciones de la exonucleasa 1 probadas (Figura 3). No pudimos estudiar la interacción entre la hEXO1 de longitud completa fusionada con el dominio de activación GAL4 y las proteínas hMLH1, ya que estas construcciones no son funcionales en el ensayo de dos híbridos de levadura (Rasmussen et al., 2000). Del mismo modo, encontramos que el hMLH1 y los derivados del hMLH1 fusionados con el dominio de activación GAL4 dieron lugar a proteínas de fusión que no son funcionales en el ensayo de dos híbridos (Figura 3 y datos no mostrados).

En conclusión, nuestros resultados revelan que tres nuevas mutaciones HNPCC-hMLH1 conocidas por cosegregarse con la suceptibilidad al cáncer en pacientes de HNPCC conducen a un defecto en el ensamblaje del heterodímero hMutLα que podría dar lugar a una actividad MMR reducida. Del mismo modo, las proteínas mutantes del HNPCC-hMLH1 tampoco pueden interactuar con la proteína hEXO1 recientemente identificada, una proteína que ahora parece interactuar con hMLH1 y hMSH2, pero no con hMSH6 y hPMS2. Actualmente, las vías biológicas precisas y las contribuciones generales de estas interacciones documentadas siguen sin estar claras, en gran medida porque se ha descubierto que hMLH1 desempeña un papel tanto en la MMR como en la recombinación. La disección de los defectos moleculares en el HNPCC mediante el análisis de las proteínas MMR patógenas en ensayos funcionales diseñados para cuantificar las interacciones en los complejos proteicos debería, junto con el cribado mutacional, la inmunohistoquímica y el análisis de microsatélites, ayudar a desarrollar estrategias para diagnosticar y tratar a los portadores del HNPCC.